Vecteurs-substrats, sources de L-PEI-succ(A)3-P-L-G-OH 

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Les Vecteurs synthétiques

Les travaux de l’Unité de Vectorologie chimique de gènes ont progressé depuis plusieurs années et ont montré qu’il était possible de faire pénétrer un plasmide en utilisant des vecteurs synthétiques comme des lipofectamines dont la partie polycationique est liée au plasmide par les groupements phosphates de l’ADN à caractère anionique. Ces lipoplexes traversent la membrane cellulaire par endocytose et formation d’endosomes intracellulaires. Ces transporteurs sont plus efficaces s’ils sont porteurs d’un ligand qui peut se fixer sur un récepteur localisé en surface cellulaire. Cependant le taux de transfection est faible comparativement à la thérapie génique utilisant des enveloppes virales (retrovirus, adénovirus…). Par ailleurs les polycations utilisés (polylysines, …) donnent à ces vecteurs la propriété de se fixer non spécifiquement, sur des protéines du sérum et à la surface de cellules sanguines, perdant ainsi de leur efficacité et de la spécificité. Ils leur confèrent, en outre, un caractère cytotoxique.
Une meilleure efficacité de transfection, par exemple du “ gene reporter ” de la luciférase, a pu être obtenue avec d’autres polymères cationiques pouvant fixer l’ADN : les poly(éthylèneimines) (PEI)[23][24][25].
Leur effet “ éponge à protons ”[26], provoque un gonflement et un éclatement des endosomes (par lesquels ils ont pénétré dans la cellule), lors de la baisse du pH intracellulaire, et donc leur libération facile avec l’ADN plasmidique qu’ils transportent, dans le milieu intracellulaire. Mais un des rôles bénéfiques des PEI, serait alors, en fixant les protons, d’éviter la diminution du pH au niveau des lysosomes et donc d’altérer le fonctionnement d’enzymes comme des nucléases lysosomales fonctionnant normalement à pH acide. Ces polymères éviteraient ainsi en partie la perte intracellulaire d’ADN plasmidique. Par ailleurs, Moret et al [27] ont montré que le PEI empêchait également la dégradation de l’ADN dans le sérum total.
Un autre avantage des polymères cationiques comme les PEI, est que selon Bahnson et al [28] les lymphocytes et les monocytes ne possèdent pas de récepteurs de surface aux cations, contrairement aux cellules cancéreuses, aux cellules épithéliales et endothéliales.
Malheureusement, comme toutes les molécules cationiques, les PEI sont aussi cytotoxiques, par exemple, en s’adsorbant non spécifiquement aux protéines sériques et membranaires. Tels quels, ils peuvent provoquer l’activation du complément, l’agrégation des érythrocytes et une occlusion des capillaires avec risque d’embolie pulmonaire [29][30]. En outre, complexés à l’ADN, ils forment des polyplexes qui peuvent être captés par opsonisation par les cellules du système réticulo-endothéliale (RES), et donc être éliminés prématurément dans le sang et le foie.
Une des solutions pour éliminer efficacement tous ces effets secondaires, a été de coupler du poly(éthylèneglycol) (PEG) au transporteur PEI, pour masquer ses charges positives [29][31[32][34]. Si les effets secondaires comme la toxicité, ont pu être annulés efficacement par ce couplage de poly(éthylène)glycols au PEI, il s’en est suivi, par contre, une perte d’efficacité de la transfection [31].

Cancer et Gélatinases

De très nombreux travaux font état d’une hypersecrétion de collagénases de type IV par les cellules tumorales, en particulier deux gélatinases : la gélatinase A (MMP2, 66 KDa) (EC 3.4.24.24) ou, matrix métalloprotéase 2, et la gélatinase B (MMP9, 68 KDa) (EC 3.4.24.35) ou “ matrix métalloprotéase 9 ” [35].
Par exemple, la gélatinase B est surexprimée par les tumeurs du cancer du sein[45], mais pas la gélatinase A [36]. Au contraire, dans les carcinomes gastriques[34], c’est la gélatinase A (MMP2) qui est hypersecrétée. La gélatinase A est augmentée de 3 à 10 fois et la gélatinase B de 2 à 30 fois dans les tumeurs gliales, comparativement à celles des tissus normaux [37]. La secrétion de ces enzymes est la conséquence de processus complexes dans la cellule cancéreuse, en particulier “ d’activation cellulaire ” anormalement accélérée après apparition ou formation d’oncogènes.

Poly(éthylèneglycol)

Généralités
Le poly(éthylèneglycol)(PEG) est un polymère de l’éthylène glycol, aussi appelé poly(éthylèneoxide)(PEO). Initialement synthétisé par Fordyce et Hibbert en 1905 [76], il est utilisé dans de nombreuses applications industrielles : lubrifiant dans l’industrie du caoutchouc, dans la fabrication des fibres textiles et dans les opérations de carrossage des métaux. Il est utilisé comme solubilisant de pigments pour les peintures à l’eau, le revêtement de papiers, le polissage des peintures, dans l’industrie des céramiques etc… Il est largement utilisé dans la fabrication des cosmétiques et comme excipient en galénique pharmaceutique.
Les poly(éthylèneglycol)s sont des polyether diols. Ils ont été synthétisés en différentes tailles allant de 200 Daltons à 35kD. Ils peuvent s’appeler poly-oxyrane quand leur poids moléculaire dépasse 20 kD. Mais, ils sont souvent utilisés sous forme de méthoxyPEG (mPEG).
Propriété physico-chimiques
Alors que les PEG de petits poids moléculaires sont des liquides visqueux, ils sont sous forme solide à partir d’un poids moléculaire de 600 daltons. En effet, leur point de fusion augmente avec leur taille moléculaire. Les poly(éthyleneglycols) sont solubles dans l’eau (qu’ils absorbent en quantité importante et qui les fait augmenter de volume), les solvants polaires et dans des solvants comme le dichlorométhane, le toluène, traduisant à la fois un caractère hydrophile et moyennement hydrophobe, donc amphiphile. Ils sont insolubles dans l’éther diéthylique et le cyclohexane, l’hexane, et dans l’eau à température élevée ( ≥ 100°C), permettant leur isolement par précipitation.
Ils ont un effet de masquage des charges électriques, diminuant le potentiel ξ . Ceci peut expliquer leur effet ralentissant sur les débits électroosmotiques.
Les PEGs diminuent les interactions ioniques non spécifiques, telle l’adhésion à différentes surfaces (les protéines au polystyrène, au verre) au même titre que des tensio-actifs comme les Brij® , qui sont des dérivés des PEGs.
Les PEGs présentent une certaine polydispersité (traduite par le rapport Mw / Mn), qui, cependant, normalement, n’est pas supérieure supérieure à 1,1. Elle est visualisable en spectrométrie de masse Maldi-tof : Les spectres présentent une certaine quantité de pics dont l’ensemble des sommets a une forme gaussienne et dont le maximum fournit le poids moléculaire M/z moyen.
Les PEG sont aisément identifiables et quantifiables en H-1-RMN. Les groupements CH2 du PEG donnent un pic à 3,53 ppm, et les CH3 du methoxy du mPEG en donnent un faible à 3,49 ppm, en D2O.
Utilisations chimiques
Les PEG, ou, les mPEGs, possèdent un squelette relativement inerte. Ils sont seulement « fonctionnalisables » sur leur groupement hydroxyle pour permettre des couplages à d’autres molécules.
S.Zalipsky [77] a effectué une revue des différents types de fonctionnalisation. L’on a ainsi synthétisé des amino-PEG, carboxyl-PEG et leurs dérivés activés (succinimide, maléimide), succinyl-PEG et leurs dérivés activés, halogéno-PEG(Bromo-, chloro-), PEG-ester sulfonates (mesylates, tosylates, tresylates…), hydrazido-PEG, azido-PEG, mercapto-PEG, dichlorotriazine-PEG, PEG- carbonates et leurs dérivés (succini midylcarbonates…), PEG-carbamates, PEG-chloroformiates, PEG-aldehydes, PEG-époxides. Il a également été fonctionnalisé en PEGvinylsulfone (Morpurgo et al.)[78] qui présente une certaine spécificité de couplage sur les dérivés thiols.
Les dérivés mPEG fonctionnalisés sont le plus souvent utilisés, car ils empêchent la formation de maillons enchevêtrés (cross-links) non spécifiques. Lorsque la taille des PEGs utilisés, est suffisante, (i.e. P.M = 5000), les produits de la réaction chimiques de petits poids moléculaire peuvent être aisément séparés par perméation sur gel (Sephadex G25 , Biogel P6 …), les PEGs sortant en premier par exclusion. Lorsque les réactions sont effectuées en solvants, les PEGs sont aisément séparables des réactifs solubles dans l’éther, par précipitation dans ce solvant.
La PEGs ont la capacité de fixer les métaux et de permettre leur transfert d’une phase aqueuse à une phase organique. Ainsi, des « éther-couronnes », utilisés à cet effet, sont des dérivés PEGs. Les PEGs de petits poids moléculaires sont souvent utilisés comme « espaceur » dans la construction de molécules complexes. Le choix des petits polymères, permet de faire varier la longueur de la chaîne et de vérifier l’effet de l’éloignenment de molécules qu’ils lient entre elles. Leur caractère chimique relativement inerte en fait un outil de choix à cet usage.
Les PEGs ont été utilisés avec succès dans la synthèse peptidique homogène en tant que support de greffage initial. La précipitation à l’éther entre les différentes étapes permet aisément de séparer les PEG-peptides formés par précipitation à l’éther diéthylique.
Propriétés, utilisations biochimiques et biologiques
Les PEGs [87], sont utilisés à concentratio ns élevées pour précipiter des protéines, des acides nucléiques, des virus, à des fins de purification. Ces précipitations peuvent avoir pour cause un effet de masquage de charges, mais seraient surtout dues à un phénomène d’exclusion car les PEGs occupent un très gros volume dans l’eau qu’ils absorbent en quantité importante, provoquant une variation de pression osmotique. Ils sont parfois employés avec d’autres polymères dans des systèmes biphasiques aqueux, dans le même objectif de purification.
Comme les PEGs sont capables de former des complexes avec les métaux, l’adjonction de ceux-ci peut améliorer ces purifications. Cette capacité des PEGs pourrait être liée à la formation de structure hélicoïdale insérant le métal.
Le caractère amphiphile des PEGs leur confère des propriétés solubilisantes des molécules auxquelles ils sont couplés. A très faible concentration, ils ont, comme les Brij , un effet de changement de conformation des protéines, permettant la disparition de leur structure en pelote, et, par exemple, le démasquage de sites catalytiques d’enzymes. Au contraire, à concentration plus élevée, leur capacité de masquer les charges, peut provoquer une inhibition de l’activité enzymatique. Des paramètres cinétiques comme le kcat et le Km peuvent être modifiés.
Cependant, de nombreuses enzymes couplées chimiquement à des PEG, n’ont pas leur activité enzymatique globalement affectée, car le degré de substitution de la protéine par les PEG n’est pas suffisamment élevé pour avoir une incidence. Le couplage des PEG à des enzymes augmente leur solubilité d’une manière telle qu’elles peuvent rester actives en milieu solvant anhydre, comme dans le chloroforme ou le dichlorométhane.
Le couplage des PEG à des ligands, à des enzymes, à des anticorps ne gène pas, dans des proportions importantes, leurs fixations respectives à leur récepteur, leur substrat, leurs antigènes.
Les PEG-protéines (albumine, anticorps, enzymes…), ont une durée de vie augmentée dans la circulation sanguine, comparativement à la protéine non couplée [79]. En effet, le squelette des PEG, constitué d’oxyde d’éthylène, est non dégradable par les enzymes de mammifères. Les protéines, peptides ou petites molécules couplées au PEG, sont moins éliminés par le système rénal, et par les cellules du système réticulo-endothélial que lorsqu’ils sont non couplés. Il en est de même pour les liposomes habillés de PEG [80]. Cette durée de vie dans le système circulatoire augmente avec le poids moléculaire des PEG.
Le couplage des protéines, peptides et petites molécules organiques au PEG, diminue leur interaction avec d’autres protéines. L’effet éponge de l’albumine sur les petites molécules est diminué. En outre, le couplage des protéines au PEG diminue leur immunogénicité, au même titre celle des peptides, par rapport aux mêmes protéines ou peptides non couplés [81][82][79][83].
Ils ont un pouvoir « fusogène » dans les membranes cellulaires, qui pourrait être dû à leur effet déshydratant [84]. Cette propriété décrite par Yamazaki et al [85], est utilisée pour la production d’hybridomes dans la préparation d’anticorps monoclonaux.
Les PEG sont non toxiques au regard de la FDA. Ils diminuent quelquefois aussi la toxicité des molécules auxquelles ils sont conjugués, grâce, parfois, à leur effet potentiel de masquage (shielding) de charges. Cependant, les PEG de petits poids moléculaires (i.e. 400) sont oxydés au niveau du foie par une alcool-déshydrogénase en formant des diacides et des hydroxy-acides toxiques (Herold et al)[86].
Synthèse du mPEG- NH2 (Fig.12)
Plusieurs techniques de synthèse du methoxy-PEG-NH2, (mPEG-NH2), sont utilisables. Dans notre cas, nous avons initialement utilisé un mPEG-NH2 dont les rendements de synthèses n’avait été que de 50% environ.
Les auteurs avaient utilisé le procédé de synthèse suivant : le mPEG 5000-OH, commercial initial est transformé sous forme Tosyl avec le p-toluène sulfonyl chlorure. Ensuite, ce produit est transformé en mPEG-N=N+=N avec de l’azide de sodium. Puis, une réaction de réduction de Staudinger [88] est effectuée avec de la triphénylphosphine pour obtenir du mPEG-NH2. Mais cette voie de synthèse, donnant un rendement moyen, nécessite une purification de produit obtenu avec un échangeur de cations, pour élimi ner les impuretés non accrochées.
Nous avons utilisé une autre technique qui utilise la triphénylphosphine et la N-bromosuccinimide pour former du mPEG-Br, qui en présence d’azide de Na, permet la formation du mPEG-N=N+=N-. Comme précédemment une réduction de cette molécule par la triphénylphospine permet d’aboutir à mPEG- NH2 1.

Effets du mPEG-OH et du L-PEI sur l’activité gélatinase

La condition nécessaire pour l’utilisation de substrats de gélatinases, entourés par du mPEG et du L-PEI, est que ces deux polymères n’inhibent pas, d’une manière rédhibitoire, l’activité de ces enzymes.
Pour cela nous avons utilisé un substrat synthétique de gélatinase dont la séquence est proche de celle du substrat que nous voulons utiliser. L’hydrolyse de ce substrat par la gélatinase activée à l’APMA, peut être mesurée en fonction du temps, par la mesure en CLHP, de la surface à 220 nm du produit formé. (Fig. 14 )
Différents rapports molaires « polymère / enzyme » ont été utilisés pour vérifier l’inhibition de la gélatinase au bout de 18 H. (Fig. 15 )
Si le mPEG-OH inhibe peu, une inhibition plus nette est obtenue avec le L-PEI : jusqu’à environ 40 % lorsque l’on met en présence 1240 moles de PEI pour une mole de gélatinase.
Le mPEG n’a pas, semble-t-il d’influence marquante sur cette inhibition du L-PEI. Le tampon « Tris / HCl » 0.1 M pH 7.4, ne neutralise pas suffisamment les charges positives du L-PEI.
Mais, in vivo, tout macro-substrat (mPEG-X-peptide-X)n-PEI sera porteur D’ADN. Une partie des charges positives sera alors neutralisée par les charges négatives des phosphates de l’ADN.
Cette vérification faite et ce facteur pris en compte, les synthèses de ces macro-substrats, potentiellement vecteurs d’ADN, ont donc été mises en œuvre.

Assemblage chimique des vecteurs

Réactions – clefs

Les couplages des éléments constitutifs des vecteurs utilisés sont essentiellement des réactions de chimie peptidique. Plusieurs types de couplage ont été utilisés.

Couplage EDC / HOBt

La DCC (N,N’ dicyclohexylcarbodiimide) [104] [105] est souvent utilisée pour le couplage ou la synthèse de peptide car elle forme de la réaction de la dicyclohexylurée facilement éliminée par filtration ou par centrifugation. Mais cette molécule n’est pas adaptée au couplage de peptides solubles dans l’eau.
La carbodiimide la plus adaptée pour coupler de tels peptides est l’EDC [106]. Elle peut s’utiliser dans du DMF avec une petite quantité d’eau avec des rendements de couplage pouvant aller jusqu’à 80%. L’HOBt [107] est utilisé pour augmenter le rendement de couplage en empêchant la formation de N-acyl urée mais surtout pour éviter l’énantiomérisation de l’acide aminé C-terminal à coupler. Cette propriété appartient également à la N-hydroxy-succinimide ou NHS [108], qui, comme le HOBt, permet la formation d’un ester activé intermédiaire sur lequel se fixera le groupement aminé de la molécule à coupler. Le mécanisme global proposé de la réaction de couplage avec les carbodiimides est décrit dans le schéma ci-après :
Lorsque l’EDC et l’HOBt sont utilisés en couplages peptidiques, ils peuvent être éliminés par perméation sur gel (Sephadex G50, Biogel P6 …), si le poids moléculaire du produit synthétisé est suffisamment important et différent en P.M de ces réactifs.
Les esters de HOBt sont moins stables que les esters de NHS et sont généralement utilisés en une seule étape (« one pot ») avec l’EDC et la molécule aminée à coupler. Cependant, un ordre de la réaction est respecté. D’abord, le peptide N-protégé avec son carboxyle terminal est mis à incuber 15 min avec le HOBt, puis l’EDC et la base sont ajoutés. Enfin, la molécule aminée à coupler est rajoutée goutte à goutte avant la mise en œuvre de la réaction chimique

Couplage direct avec les dérivés du benzotriazole

B.Castro [109][110] a élaboré un réactif, le BOP, liant de l’hydroxybezotriazole à du phosphonium qui évite la formation d’insoluble dicyclohexylurée dans le couplage peptidique lorsqu’on utilise du DCC. Il se forme dans la réaction le même ester activé que dans la réaction EDC/HOBt. Ce système de couplage est largement utilisé dans la synthèse peptidique en phase solide qui permet aisément d’éliminer les réactifs.
Mais la formation dans cette réaction d’hexaméthyltriphosphamide cancérigène a amené à la synthèse et à l’utilisation de réactif moins nocif d’un autre dérivé phosphonium comme le PyBOP (ou d’un dérivé uronium comme l’HBTU [111]:

Synthèse des vecteurs dérivés de L- Poly(éthylèneimine)

La synthèse de ce polymère, L-PEI 2 , a déjà été décrite, dans le chapitre particulier consacré aux poly(éthylèneimines). La synthèse chimique du mPEG-NH2 1, qui est utilisé dans les différentes synthèses, a été décrite dans le chapitre consacré aux poly(éthylèneglycols). Les acides aminés décrits dans ces synthèses sont, par défaut, sous forme L. La forme D éventuelle sera spécifiquement mentionnée.

« Vecteurs substrats » devant fournir : (H-Leu-Trp-Ala)n – PEI : [mPEG-succinyl-(Ala)3 Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-]n-PEI ( 8 )

Dans cette molécule, le clivage par les gélatinases s’effectue, en effet, entre les résidus Gly et Leu. La valeur de n, est normalement égale à 2 si les seuls groupements aminés libres du L-PEI sont substitués. La stratégie de synthèse consiste à greffer le PEI en dernier, étant donné la réactivité éventuelle de ses amines secondaires, son encombrement moléculaire (P.M. 22OOO), son caractère polycationique et éventuellement son insolubilité potentielle.
La première étape de synthèse consiste à succinyler le groupement aminé du mPEG-NH2. Cette réaction chimique peut être effectuée en milieu anhydre ou en milieu aqueux. Le meilleur rendement a été obtenu en milieu aqueux (93%), en utilisant un excès de 200 fois d’équivalents anhydride succinique par rapport aux groupements aminés du mPEG-NH2. Cette molécule est initialement solubilisée par chauffage à 40-50°C. Sa solubilisation est probablement aussi permise par la présence de formes chlorhydrates résiduels. L’opération est effectuée ensuite à T.A. pendant 2H, en ajoutant de petites quantités d’anhydride tout en maintenant le pH à 8.5-9 avec NaOH N sous agitation, en utilisant un pHmètre.
Le dosage des groupements aminés libres au TNBS permet d’évaluer le rendement de couplage. Une purification par passage sur résine échangeuse de cations (Amberlyst (H+)) permet d’éliminer le mPEG-NH2 résiduel.
Plusieurs méthodes de couplage du mPEG-NH-succ-OH au peptide H-(Ala)3 Pro-Leu-Gly-Trp-Ala-OH sont possibles. Une première méthode consiste à utiliser le peptide sous forme d’ester (éthylique, par exemple) et de le coupler au mPEG- NH-succ-OH, par avec une carbodiimide et du HOBt. Cette méthode fournit de faibles rendements. Une autre méthode permettant d’utiliser le peptide natif H-(Ala)3-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-OH sans protection de son groupement C terminal, est de synthétiser l’ester succinimide du mPEG- NH-succ-OH. Cette synthèse a été effectuée avec le N-hydroxysuccinimide (NHS), en présence d’une carbodiimide, le DCC, avec un rendement seulement de 30%. Le couplage au peptide du mPEG-NH-succinylsuccinimide isolé ne fournit pas non plus un bon rendement (20 %), sans doute par son manque de stabilité.
La méthode la plus satisfaisante consiste à effectuer le couplage direct enchaîné : le mPEG-NH-succinylsuccinimide est d’abord synthétisé avec NHS, EDC en milieu semi-aqueux (DMF/H20 1/1 (v/v). Les réactifs sont éliminés aussitôt dans le même milieu par perméation sur gel du milieu réactionnel avec du Sephadex LH20. Les fractions du dérivé PEG, détectées sont aussitôt rassemblées et additionnées du peptide en tampon phosphate pH 8. Le rendement global est de 43 % après réaction. Ce procédé permet de limiter l’instabilité dans le temps du mPEG- NH-succinylsuccinimide.

« Vecteurs substrats » devant fournir : PEI-succ-(Ala)3- Pro- Leu-Gly-OH (substrats inverses) [mPEG-NH-Ala-Trp-Leu-Gly-Leu-Pro-(Ala)3-succ]n-PEI 16

Le produit de la réaction enzymatique gélatinase donnera avec ce « substrat vecteur » le dérivé PEI suivant : [OH-Gly-Leu-Pro-(Ala) 3-succ]n–PEI. Dans ce vecteur, l’inversion du sens des liaisons amides du peptide, est obtenu par insertion du groupement succcinyl entre le peptide et le PEI.
La première étape consiste à introduire un groupement Fmoc sur le groupement aminé terminal du peptide avec du Fmoc-Cl. Cette étape, fournissant la molécule 13, s’effectue avec un rendement proche de 100%. Par contre, le couplage au mPEG-NH2 1, avec la carbodiimide EDC et l’HOBT, fournit un rendement médiocre de 20%.
En effet, le couplage de peptide sur leur côté carboxyle est extrêmement difficile, en partie par la probable cyclisation des deux derniers amino-acides en C terminal, aboutissant à la formation d’oxazolidinone. Au lieu d’utiliser un dérivé peptidique comme le Fmoc-peptide-OH qui aboutit à ce rendement faible, une solution serait de construire ce peptide par élongation d’acides aminés, à partir du groupement aminé du mPEG-NH2, comme pour la synthèse d’un peptide en phase solide, sur résine substituée. Nous avons effectué cette synthèse, en précipitant à chaque étape, le dérivé mPEG formé, avec Et 2O. Les premières étapes ont été satisfaisantes. Mais, au fur et à mesure de l’élongation des amino-acides, la précipitation à l’éther devenait de moins en moins efficace, sans doute en raison de l’augmentation de l’hydrophobicité de la chaîne peptidique synthétisée.
La molécule 14 a été malgré tout purifiée, le mPEG-NH 2 non couplé, étant retenu sur résine Amberlyst [H+]. La molécule 14 est ensuite recueillie dans le premier pic de Sephadex G25, puis déprotégé du groupement Fmoc à la pipéridine (Fig.28).
Celle-ci, est alors couplée à du L-PEI-succinylé 7 , avec de l’EDC et du HOBt, pour fournir le « vecteur-substrat » inverse 16.
Les résultats de 1-H RMN permettent de mettre en évidence pour cette molécule 16 un rapport molaire du PEG par rapport au PEI très élevé (20), à partir du calcul du rapport des surfaces intégrées de leurs protons. Cela peut être dû à un mauvais couplage de 14 avec les deux amines primaires du L-PEI. Mais, ce qui apparaît plus probable, c’est qu’une succinylation des amines secondaires du L-PEI se soit produite. En effet, le spectre 1-H RMN du L-PEI-succinylé 15, fournit, non seulement le pic des unités « aminoéthane » du PEI (2,87 ppm), mais un autre nouveau pic à 3,49 ppm, qui correspondrait peut-être à des amines secondaires substituées par les groupements succinyl et protonées. Ainsi, un certain nombre de molécules 14, ( H-(Ala)3-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-NH-PEGm), pourraient peut-être substituer les groupements succinyl couplés aux amines secondaires du L-PEI, dans le L-PEI succinylé 15.
Ce rapport PEG / PEI élevé, a ainsi empêché le compactage de l’ADN sur le PEI de ce vecteur-substrat, probablement par l’important encombrement des nombreux PEG. Une solution pour éviter ce processus, serait de succinyler, non pas le L-PEI, mais le groupement amino-terminal de la molécule 14, H-(Ala)3-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-NH-PEGm.

« Vecteurs substrats » témoins, théoriquement non enzymatiquement hydrolysables

Plusieurs types de témoins ont été synthétisés pour valider le rôle des substrats de gélatinases dans le ciblage des cellules transformées. Il s’agit de substrats théoriquement non clivables par ces enzymes.
Ce seront d’abord des vecteurs contenant des séquences peptidiques différentes de celle des gélatinases.
Il s’agira d’abord d’une séquence polyGly. En effet, les gélatinases A et B, reconnaissent particulièrement les séquences de type -Pro-Leu-Gly-Leu-, clivant normalement le site P1-P’1, c’est à dire la liaison amide entre Gly et Leu, le résidu P’1 devant être hydrophobe. Ainsi, nous avons également synthétisé un témoin substrat contenant la séquence –(Ala)3-(Gly)4- comme dans les travaux de Peng et al [57][58]. Et puis, nous avons synthétisé un vecteur contenant un substrat dont la séquence peptidique est identique à celle du substrat, mais dont le site de clivage normal Gly-Leu est transformé en site non clivable par remplacement de la L-Leucine en D-Leucine. Enfin, un témoin-vecteur sans peptide a été synthétisé.
[mPEG-NH-succ-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly]n-PEI 23
La construction de ce témoin, est effectuée à partir de sous unités commercialement disponibles, H-(Gly)3-OEt. Le premier couplage s’effectue sur l’amine primaire du mPEG-suc-OH 4 avec la carbodiimide EDC, en présence de HOBt en milieu tamponné à pH 8, pour év iter l’estérolyse du groupement Ethyl ester que pourrait provoquer l’addition d’une base. Le produit 22a obtenu purifié après élimination des réactifs et des composés non couplés, est soumis à une estérolyse avec NaOH 2N. Ce processus entraîne souvent une énantiomérisation du résidu C-terminal, mais, la présence de glycine – n’ayant pas d’énantiomères – à cette position, évite ce genre de problèmes. Ce processus d’allongement est répété deux fois pour aboutir à la molécule 22 .
La molécule dérivée mPEG contenant le peptide polyGly, 22c, est ensuite couplée aux groupements aminés du L-PEI 2 avec l’EDC, l’HOBt. Mais le rendement de couplage obtenu est très faible (20%), sans doute encore par la probable cyclisation de deux résidus glycine terminaux. La molécule couplée a pu néanmoins être purifiée par passage sur Sephadex G50 en NaCl 0.15M puis G25 avec l’eau comme éluant. L’absence constitutive de chaîne latérale dans la glycine, pouvant apporter un encombrement stérique, favorise probablement ce genre de processus. Le rapport molaire PEG / PEI de l’ordre de 20, calculé à partir de la surface des protons en RMN, laisse penser, par ailleurs, à une substitution de certaines amines secondaires du L-PEI par le dérivé PEG-peptide-OH.
[mPEG-NH-succ-(Ala)3-Gly-GlyGly-Gly-Ser]n-PEI 27
Initialement, le peptide de même séquence que celle utilisée par Peng et al. [57][58] (Ala)3-Gly-Gly-Gly-Gly. Mais encore une fois, le couplage de résidus polyGly terminaux donna un très mauvais rendement de couplage au L-PEI, même si l’on forme, avec le NHS, un ester de succinimide, réputé plus stable qu’un ester de HOBt. Un nouveau résidu substitué –Ser-O(tBu)-OH a donc été ajouté à cette séquence, afin d’apporter un encombrement stérique, pouvant éviter une cyclisation des deux résidus terminaux lors du couplage au L-PEI.

Table des matières

 Chapitre 1 : Introduction 
1.1 La thérapie génique 
1.2 La thérapie génique anticancéreuse 
1.3 Les vecteurs synthétiques 
1.4 Cancers et gélatinases 
1.5 Stratégie de ciblage 
Chapitre 2 : Objectif et plan de travail 
Chapitre 3 : Mise en œuvre 
3.1 Conception des vecteurs 
3.1.1 Eléments constitutifs 
3.1.1.1 Substrats peptidiques 
choix du substrat 
synthèse peptidique 
3.1.1.2 Poly(éthylèneglycol), PEG 
Généralités 
Propriétés physico-chimiques 
Utilisation chimique 
Propriétés biologiques de biochimiques 
Synthèse des mPEG-NH2
3.1.1.3 Poly(éthylèneimine), PEI 
Généralités 
Structure des PEI 
Physico-chimie des PEI 
Capacité de transfection de l’ADN et des oligonucléotides 
Ciblage des cellules 
Caractères toxiques 
Synthèse du L-PEI 
3.1.2 Effets du mPEG-OH, et du L-PEI sur l’activité gélatinase 
3.2 Assemblage chimique des vecteurs 
3.2.1 Réactions-clefs 
3.2.1.1 Couplages EDC / HOBt 
3.2.1.2 Couplages directs avec les dérivés benzotriazole 
3.2.1.3 Réactions secondaires 
3.2.1.4 Couplages avec le SPDP 
3.2.2 Synthèse des vecteurs dérivés du PEI 
3.2.2.1 Vecteurs-substrats sources de (H-L-W-A)n-PEI 
3.2.2.2 Vecteurs-substrats, sources de L-PEI-succ(A)3-P-L-G-OH 
3.2.2.3 Vecteurs-substrats-témoins non hydrolysables 
3.2.2.4 Vecteurs témoins 
3.2.2.5 Produits de la réaction enzymatiqu
3.3 Evaluation biochimique et biologique  des vecteurs
3.3.1 Cinétique d’hydrolyse de substrat synthétique 
3.3.2 Hydrolyse de ce substraT par les surnageants cellulaires 
3.3.3 Evaluation physico-chimique des vecteurs 
3.3.4 Transfections du gène de la luciférase par les polyplexes vecteurs-substrats 
3.3.4.1 Transfection du PEI et effet de l’actinonine 
3.3.4.2 Effets du rapport N / P
3.3.4.3 Comparaisons des transfections dans 2 types de cellules, en NaCl 0,15M
3.3.4.4 Comparaison de transfections dans 2 types de cellules en NaCl glucosé 1
3.3.4.5 % de restauration de transfections dans 3 types de cellules
3.3.4.6 Comparaison de transfections avec différents témoins et vecteurs substrats 
Chapitre 4 : Conclusions, Perspectives 
Chapitre 5 : Méthodes expérimentales 
5.1 Méthodes biochimiques 
5.2 Méthodes biologiques 
5.3 Méthodes analytiques et préparatives 
5.4 Méthodes de synthèses chimiques

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