Vecteurs de gènes et immunité

Vecteurs de gènes et immunité

Les cellules de l’immunité cutanée

Toutes les cellules de la peau jouent un rôle dans l’immunité cutanée. Les plus importantes sont les kératinocytes, les cellules dendritiques et les lymphocytes.

Les cellules dendritiques

Les cellules dendritiques sont présentes dans l’épiderme (cellules de Langerhans) et dans le derme majoritairement autour des vaisseaux (cellules dendritiques dermiques). Elles ont un rôle de sentinelle grâce à leurs prolongements, les dendrites. Elles ont une activité phagocytaire et internalisent tout microorganisme, molécule ou cellule morte, entrant en contact avec leur membrane. Elles peuvent si besoin jouer un rôle de cellule présentatrice d’antigène (CPA) et activer les lymphocytes après migration dans le nœud lymphatique drainant.

Les kératinocytes

Les kératinocytes interviennent dans l’immunité cutanée en produisant des peptides antimicrobiens (PAM), qui ont principalement une action antibactérienne. Mais il existe également des PAM à action antivirale et antifongique.
Les kératinocytes contribuent aussi à l’initiation de la réponse inflammatoire via la sécrétion de cytokines et chémokines. Ils possèdent également des molécules d’adhésion jouant un rôle important dans le trafic lymphocytaire épidermique.

Les lymphocytes

Il existe une très grande diversité de lymphocytes. Les lymphocytes B et T sont des acteurs de l’immunité acquise. Ils possèdent à leur surface des récepteurs spécifiques d’un motif antigénique unique appelé épitope.Les lymphocytes B (LB) une fois activés se multiplient et se différencient en plasmocytes et produisent des anticorps spécifiques d’un antigène.Les lymphocytes T (LT) produisent des cytokines et ont une fonction cytotoxique. Les LT naïfs, après leur première rencontre avec un antigène, deviennent des LT effecteurs, des LT mémoire ou des LT régulateurs.
Les lymphocytes « natural killer » (NK) sont des acteurs de l’immunité innée présents en faible quantité dans la peau. Ils éliminent toutes les cellules du soi présentant un défaut d’expression des molécules caractéristiques de l’individu, pouvant traduire une infection virale ou un processus tumoral.

Autres cellules de l’immunité cutanée

Les cellules endothéliales des capillaires dermiques sont à la fois cible et source de cytokines pro-inflammatoires. Elles participent à la réponse immunitaire en permettant le recrutement et la migration des cellules immunitaires du sang vers le derme superficiel via l’expression de différentes molécules d’adhésion.Les granulocytes sont des acteurs de l’inflammation aiguë. Ils produisent des protéines antibactériennes et des dérivés du métabolisme oxydatif. Ils ont également une fonction phagocytaire.Les monocytes et macrophages ont eux aussi une fonction phagocytaire. Ils ont également une fonction de CPA aux LT, mais contrairement aux cellules dendritiques, ils ne peuvent pas activer la réponse immunitaire primaire (réponse mise en place lors de la première rencontre du système immunitaire avec un antigène donné).Enfin, certaines cellules du système immunitaire cutané (kératinocytes, cellules dendritiques, mastocytes, macrophages) possèdent à leur surface des récepteurs, les PRR (Pattern Recognition Receptor). Ces récepteurs reconnaissent des patterns moléculaires (PAMPs pour Pathogen-Associated Molecular Patterns), communs à différents pathogènes comme les LPS,les acides nucléiques viraux, l’ARN double brin, … Une fois activés, les PRR initient une série de voies intracellulaires qui aboutissent à la génération d’une réponse inflammatoire.

Fonctionnement de l’immunité cutanée

Si la barrière physique (couche cornée) et chimique (PAM) que représente l’épiderme est franchie, différentes réponses vont se mettre en place.

Réponse inflammatoire précoce

Lorsqu’un pathogène pénètre dans la peau, les PAMPs vont interagir avec les PRR exprimés par les différentes cellules. Il va alors y avoir activation de certaines cellules (augmentation des capacités de phagocytose des cellules dendritiques et macrophages) et libération de médiateurs vasodilatateurs et de cytokines pro-inflammatoires, qui vont favoriser le recrutement des leucocytes du sang vers les tissus.

Recrutement des cellules de l’immunité innée

Certaines cellules de l’immunité innée sont résidentes de la peau (kératinocytes, cellules dendritiques) et vont pouvoir agir dès qu’ils vont rencontrer un pathogène. D’autres cellules, comme les granulocytes, monocytes et macrophages, ne sont présentes qu’en faible quantité dans la peau dans des conditions physiologiques et vont devoir être recrutées lors de la présence d’un pathogène. Ce recrutement est possible grâce aux cytokines libérées lors de la réponse inflammatoire précoce : elles vont provoquer l’expression de molécules d’adhésion par les cellules endothéliales des vaisseaux, qui vont permettre la migration des leucocytes sanguins dans le derme. Le type de cellules recrutées dépend des cytokines produites, qui dépendent elles-mêmes du type de pathogène présent.Si cette immunité innée ne suffit pas, les mécanismes de l’immunité acquise vont se mettre en place.

Recrutement des cellules de l’immunité acquise

• LT : Les cellules de Langerhans vont subir un phénomène de maturation, puis migrer vers le nœud lymphatique de drainage. Elles vont alors apprêter les antigènes rencontrés puis les présenter à leur surface couplés à des molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH). Ces antigènes ainsi apprêtés vont pouvoir interagir avec les LT porteurs de récepteurs spécifiques. En présence de signaux de costimulation complexes, il va alors y avoir production de clones de LT spécifiques de l’antigène, qui vont ensuite migrer vers le site infectieux cutané grâce à l’action de différentes cytokines. Le profil (cd4 ou cd8) des LT produits dépend de la classe des molécules du CMH présentant l’antigène, qui dépend elle-même de l’origine (endogène ou exogène) de l’antigène.
• LB : Des antigènes vont être drainés par la lymphe jusqu’au nœud lymphatique, où ils vont pouvoir interagir avec les LB porteurs de récepteurs spécifiques. Ces derniers vont alors être activés, se multiplier puis se différencier en plasmocytes, producteurs d’anticorps spécifiques.

Table des matières

LISTE DES ILLUSTRATIONS
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES GRAPHIQUES
LISTE DES ABREVIATIONS
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
I. Etude de la peau du chien
A. Histologie topographique de la peau
1. L’épiderme
2. La membrane basale
3. Le derme
4. L’hypoderme
5. La vascularisation de la peau
B. Structure histologique de l’épiderme
1. Les kératinocytes
2. Les mélanocytes
3. Les cellules de Langerhans
4. Les cellules de Merkel
C. Le système immunitaire cutané
1. Les cellules de l’immunité cutanée
2. Fonctionnement de l’immunité cutanée
II. Vecteurs de gènes et immunité
A. Vecteurs non viraux
1. Les plasmides / ADN nu
2. Liposomes
B. Vecteurs viraux
1. Vecteurs de gène rétroviraux
2. Virus associés aux adénovirus
3. Vecteurs adénoviraux
4. Bilan : les principales caractéristiques des vecteurs de gènes
DEUXIEME PARTIE : ETUDE EXPERIMENTALE
I. Matériels et méthodes
A. Animaux
B. Vecteurs de gènes
1. Promoteurs
2. Fluorochromes
3. Autres éléments de construction des lentivecteurs
4. Niveau de pureté
5. Bilan : les différents lentivecteurs utilisés
C. Administration épidermique
1. Injection
2. Tape Stripping
3. Raclage
4. Application topique de la solution de lentivecteurs après Tape Stripping ou Raclage
D. Suivi non invasif de l’expression du transgène
1. Cellvizio® Dual Band
2. Méthode d’acquisition
E. Analyses
F. Contrôle de la fluorescence par biopsie
G. Bilan : liste des différents essais réalisés
II. Résultats
A. V0.1 : Administration du lentivecteur par injection
B. V0.2 : Administration topique des lentivecteurs après abrasion de l’épiderme
1. Raclage
2. Tape Stripping
C. V0.3 : essai d’un nouveau promoteur
D. V0.4
1. U : Comparaison de deux administrateurs différents
2. DK : essai d’un promoteur inductible
E. V0.5 : Comparaison de deux promoteurs avec le même fluorochrome
III. Discussion
A. Animaux
B. Vecteurs de gènes
1. Promoteurs
2. Fluorochromes
3. Niveau de pureté
C. Méthode d’administration
1. Injection intradermique
2. Abrasion de l’épiderme et administration topique des lentivecteurs
3. Nouvelle méthode d’administration
D. Suivi non invasif de l’expression du transgène
1. Influence de l’ordre de lecture des points
2. Temps de chauffage du laser
E. Analyse
F. Biopsies
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE
Annexe 1 : Méthode d’analyse des vidéos
Annexe 2 : Analyse statistique des moyennes d’intensité des essais V0.2 à V0.5

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