Variants et modifications des histones associées à la transcription

Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études

Le Médiateur de la transcription par l’ARN polymérase

Que se soit chez l’homme et les mammifères ou chez les eucaryotes unicellulaires, la régulation de la transcription est cruciale pour le développement et la survie de l’organisme.
C’est dans ce processus qu’intervient le Médiateur de la transcription par l’ARN polymérase II.

Le Médiateur de Saccharomyces cerevisiæ

La transcription basale est définie in vitro, par l’activité de Pol II en présence des facteurs généraux. Cependant ce système est incapable de répondre aux signaux de régulation. Ceci à servi de base à la recherche de facteurs qui stimulent la transcription en présence d’activateurs à partir d’extraits protéiques de S. cerevisiae (Kornberg, 2005).

Découverte et caractérisation du Médiateur

La notion de Médiateur est née au début des années 90 grâce aux phénomènes d’interférence entre activateurs (Kelleher et al., 1990). La transcription d’un rapporteur in vitro, est activée par un activateur qui se lie en amont du site d’initiation. Si on ajoute un activateur qui n’a pas la capacité de se lier au promoteur du rapporteur, la transcription du rapporteur est diminué. Une telle interférence a été attribuée à la séquestration par l’activateur non lié à l’ADN d’un facteur requis pour la transcription activée présent en quantité limitante.
Une fraction protéique dont l’addition à la réaction annule l’interférence, a été purifiée à partir d’un extrait brut de levure et est à l’origine de la notion de Médiateur (Flanagan et al., 1991).
Une étude génétique menée en parallèle est venue renforcer cette idée. Un groupe de gènes identifiés comme des suppresseurs extragéniques d’une troncature du CTD de Pol II appelé SRB pour « Suppressor of RNA polymerase B », a pu être isolé : MED20 (SRB2), MED17 (SRB4), MED18 (SRB5), MED22 (SRB6), MED21 (SRB7), MED1 2(SRB8), MED13 (SRB9), CDK8 (SRB10) et CYCC (SRB11). Les protéines codées par ces gènes ont ensuite ét purifiées au sein d’un complexe qui lie le CTD et qui favorise l’initiation de la transcription in vitro (Hengartner et al., 1995; Nonet and Young, 1989; Thompson et al., 1993).
Indépendamment, le Médiateur a été purifié à homogénéité et caractérisé in vitro (Kim et al., 1994). Les grandes activités du Médiateur ont pu être déterminées, il permet l’activation de la transcription par Pol II en réponse aux activateurs, il stimule la transcription basale dont le niveau augmente en sa présence et il favorise la phosphorylation du CTD par TFIIH.

Organisation et structure du Médiateur de S. cerevisiae

L’identification des protéines du complexe Médiateur a montré qu’il était composé de 24 sous-unités (Kornberg, 2005). Récemment, une 25ème sous unité a été découverte simultanément dans notre laboratoire et celui de Claes Gustafsson (Guglielmi et al., 2004; Linder and Gustafsson, 2004). Les protéines du Médiateur de S. cerevisiae sont nommées Med1-22, Med31, Cdk8 et CycC (Bourbon et al., 2004).

Les modules du Médiateur

Le Médiateur comporte quatre modules : la Tête, le Milieu, la Queue et le module Cdk8. Ces sous-complexes peuvent être séparés in vitro sous l’effet de mutations ou en fonction des conditions utilisées au cours de la purification biochimique. En présence d’une concentration de 2 M d’urée, la Tête se sépare du Milieu et de la Queue (Lee and Kim, 1998).
Dans un mutant de la sous-unité Med14, la Queue se sépare du Milieu et enfin dans un mutant de Med19, le Milieu se sépare du reste du Médiateur (Baidoobonso et al., 2007; Li et al., 1995). Enfin, le module Cdk8 copurifie indépendamment du reste des sous-unités par purification à l’aide de l’étiquette TAP (Borggrefe et al., 2002). Le Médiateur existerait sous deux formes, avec ou sans le module Cdk8 dont l’association avec les autres modules influencerait le rôle de tout le complexe (Andrau et al., 2006; Elmlund et al., 2006; van de Peppel et al., 2005).

Structure du Médiateur de S. cerevisiae

Un modèle du complexe Médiateur associé à Pol II a été obtenue à la résolution de 40 Å (Asturias et al., 1999). Le Médiateur lie Pol II par les modules de Tête et du Milieu e englobe l’enzyme en laissant une surface libre importante qui pourrait permettre à d’autres facteurs de s’insérer (Figure 12A). L’obtention de nouveaux modèles a montré que le structure compacte qui s’étire lorsqu’il est associé à Pol II. Cette observation est à l’origine d’un modèle où les changements de conformation revêtent une place importante dans l’activation du complexe (Davis et al., 2002) (Figure 12B). Le Médiateur existerait sous deux états, une forme fermée dans laquelle le module de Queue est repliée sur celui du Milieu, et une forme ouverte associée à l’activation du Médiateur dans laquelle le module de Queue se déplie pour laisser place à l’interaction avec Pol II.

Organisation du Médiateur de S. cerevisiae

L’organisation du Médiateur a été définie grâce aux modèles structuraux. En se basant sur les données de biochimie et sur la masse estimée des modules, une organisation en sous-unité a été déduite (Dotson et al., 2000). Des travaux de co-immunoprécipitation de protéine (Kang et al., 2001) et la définition d’une carte à haute résolution déduite de cribles double-hybride sont venus ensuite confirmer et préciser l’organisation du complexe (Guglielmi et al., 2004) (Figure 13). Le module de Tête est composé de huit protéines (Med6, 8, 11, 17, 18, 19, 20 et 22). Il interagit avec le module du Milieu (Med1, 4, 5, 7, 9, 10, 21 et 31) via l’interaction entre Med17 et Med21. Le module de Queue qui est composé de cinq protéines (Med2, 3, 14, 15 et 16), pourrait se replier sur
le module du Milieu grâce à l’interaction entre Med3 et Med21. Enfin, le module Cdk8 vient s’ajouter au reste du complexe, il est composé de quatre sous-unités (Med12 et 13, Cdk8 et CycC).
Il pourrait s’associer grâce à l’interaction entre Med13 et Med17 aux autres modules (Guglielmi et al., 2004) (Figure 13A).

Le Médiateur des animaux

L’universalité du Médiateur au sein du règne eucaryote est une question fondamentale.
La découverte d’un complexe clef dans la régulation de la transcription chez S. cerevisiae ouvrait de nouvelles perspectives dans la compréhension des mécanismes du contrôle de l’expression génétique qui sont mis en jeu dans de nombreuses maladies et cancers.

Identification et composition

Le groupe de Robert Roeder est le premier à avoir identifié chez l’homme, un complexe protéique qui possède des propriétés semblables à celles du Médiateur de S. cerevisiae (Fondell et al., 1996). Il s’agit d’un coactivateur dont certaines sous-unités sont homologues à celle du Médiateur de levure, qui favorise l’activation de la transcription dans un système dépourvu de TAF, in vitro (Oelgeschlager et al., 1998). En parallèle, les Médiateurs de souris, de rat, de drosophile et humain ont été purifiés (Boyer et al., 1999b; Brower et al., 2002; Fondell et al., 1999; Jiang et al., 1998; Naar et al., 1999; Rachez et al., 1999; Ryu et al., 1999). L’importance du Médiateur dans la régulation de la transcription chez les mammifères se reflète dans la variété des systèmes biochimiques qui ont permis de l’isoler. Les complexes Médiateur TRAP/SMCC, DRIP/ARC, le complexe dit « médiateur humain » et les petits complexes PC2, CRSP et NAT ont été purifiés en association avec des activateurs ou ont pu être mis en évidence à partir de fractions stimulant la transcriptio (Conaway et al., 2005b).
TRAP/SMCC
Le premier Médiateur de mammifère à avoir été purifié est le complexe TRAP. Il a été isolé en association avec le récepteur ! de l’hormone thyroïdienne à partir d’extraits de cellules HeLa cultivées en présence de l’hormone (Fondell et al., 1996). Le complexe SMC a ensuite été identifié au cours d’immunopurifications réalisées à l’aide d’anticorps dirigés contre l’étiquette FLAG couplée aux protéines Med21(hSrb7), Cdk8(hSrb10) ou CycC (hSrb11) (Gu et al., 1999). La caractérisation des complexes TRAP et SMCC a révélé qu’ils formaient un seul et même complexe. Ils sont composés d’une vingtaine de sous-unités dont la plupart présentent une homologie avec les protéines du Médiateur de S. cerevisiae (Boube et al., 2002; Bourbon et al., 2004; Ito et al., 1999). Comme lui, ils possèdent la capacité de stimuler la transcription en réponse à des activateurs in vitro (Ito et al., 1999).
DRIP/ARC
La recherche de facteurs associés au récepteur de la vitamine D (VRD) dans les cellules humaines a permis d’isoler le complexe DRIP. Il possède in vitro les propriétés d’un complexe Médiateur puisqu’il est essentiel à l’activation de la transcription médiée par VRD (Rachez et al., 1999; Rachez et al., 1998). Des études similaires ont identifié le complexe ARC qui est essentiel à la régulation de la transcription sur des matrices chromatiniennes en réponse aux activateurs SREBP-1!, VP16 et la sous-unité p65 de NF$B (Näär et al., 1999). Les compositions en sous-unité des complexes DRIP et ARC sont identiques et sont très proches de celle de TRAP/SMCC (Rachez and Freedman, 2001).

Etudes fonctionnelles et pathologies

Le Médiateur a été isolé chez les mammifères en association avec des activateurs et chez la levure grâce à sa capacité d’activer la transcription dans un système in vitro (Conaway et al., 2005b; Kornberg, 2005). Les expériences réalisées in vivo, ont ensuite révélé le rôle essentiel du complexe dans la transcription et la régulation de l’expression des gènes.
Une étude de génomique fonctionnelle réalisée à l’aide de puces à ADN chez S. cerevisiae a révélé que le Médiateur était crucial à la transcription in vivo. En effet, l’analyse d’un mutant thermosensible de la sous-unité du module de tête Med17, a montré une chute de l’expression génique d’environ 90% du génome. Cette diminution est équivalente à celle observée dans un mutant de Pol II ou du facteur général TFIIH (Holstege et al., 1998). Ce résultat témoigne de l’importance du Médiateur dans la transcription basale et activée.
Le Médiateur se trouve impliqué dans de nombreux processus biologiques chez les animaux. Le complexe joue un rôle important dans le développement. Ceci a été déterminé à partir d’études réalisées chez la drosophile, le poisson zèbre et la souris. En effet, le module Cdk8 est impliqué dans la régulation de l’expression des gènes du développement de la patte, la différentiation cellulaire pendant le développement de l’œil, dans le développement des organes sensoriels externes et dans la définition des segments chez la drosophile (Boube et al., 2000; Loncle et al., 2007). Chez le poisson zèbre, le Médiateur est requis pour la différentiation neuronale (Wang et al., 2006). Enfin, des souris invalidées pour les gènes MED1 et MED24 meurent à un stade précoce du développement et présentent de graves malformations (Ito et al., 2002; Ito et al., 2000). Chez l’homme, le Médiateur pourrait également jouer un rôle au cours de l’organogénèse, puisque des mutations de la protéine
Med12 sont à l’origine du Syndrome de Opitz-Kaveggia (Risheg et al., 2007; Schwartz et al., 2007). Il s’agit d’une anomalie congénitale qui entraine de grave altération du développement.
D’autre part, le Médiateur intervient dans des processus physiologiques importants à l’échelle d’un organisme. Chez l’homme, l’interaction entre Med15 et SREBP (sterol regulatory element binding protein) intervient dans le contrôle de l’homéostasie du cholestérol et des lipides (Yang et al., 2006). Le Médiateur est également mis en jeu dans des perturbations du système nerveux central, puisque des patients sujets à des crises d’épilepsie chronique montrent une baisse du niveau d’expression de MED1 (Li et al., 2006).
Enfin, le Médiateur est impliqué dans la différentiation et la prolifération cellulaire. Il intervient dans la différenciation des kératinocytes en interagissant directement avec le récepteur de la vitamine D (Hawker et al., 2007). La baisse du niveau d’expression de Med par ARN interférence entraine une hyper-prolifération des kératinocytes (Oda et al., 2007). Med1 joue également un rôle crucial dans la différentiation des myélomonocytes au cours de l’hématopoïèse (Urahama et al., 2005). 

Table des matières

AVANT-PROPOS
INTRODUCTION
Chapitre I : La transcription des gènes de classe II
I.1 Séquences régulatrices de l’ADN
I.1.1 Structure du promoteur
I.1.2 Les éléments de régulation
I.2 Les facteurs généraux de la transcription par l’ARN polymérase II
I.2.1 TFIID
I.2.2 TFIIA
I.2.3 TFIIB
I.2.4 TFIIF
I.2.5 TFIIE
I.2.6 TFIIH
I.3 L’ARN Polymérase II
I.3.1 Organisation de l’ARN polymérase II
I.3.3 Le domaine Carboxy-terminal de Rpb1 (CTD)
I.3.2 Structure de l’ARN Polymérase II
I.4 La transcription par l’ARN polymérase II
I.4.1 Initiation de la transcription
I.4.2 Elongation de la transcription
I.4.3 Terminaison de la transcription
I.5 La transcription dans un contexte chromatinien
I.5.1 Variants et modifications des histones associées à la transcription
I.5.2 Initiation de la transcription dans un contexte chromatinien
I.5.3 L’élongation de la transcription dans un contexte chromatinien
I.6 La régulation de la transcription
I.6.1 Les répresseurs
I.6.2 Les activateurs
I.6.3 Les coactivateurs
Chapitre II: Le facteur général de la transcription TFIIH
II.1 Les sous-unités de TFIIH
II.1.1 Le cœur de TFIIH
II.1.2 Le sous-complexe TFIIK/CAK
II.2 La structure de TFIIH
II.3 Les fonctions de TFIIH
II.3.1 Rôle dans la réparation de l’ADN
II.3.2 Rôle dans le cycle cellulaire
II.2.3 Rôle dans l’initiation de la transcription par l’ARN polymérase II
Chapitre III: Le facteur d’élongation TFIIS
III.1 Identification et caractérisation de TFIIS
III.2 Structure et mode d’action de TFIIS
Chapitre IV: Le Médiateur de la transcription par l’ARN polymérase II
IV.1 Le Médiateur de Saccharomyces cerevisiæ
IV.1.1 Découverte et caractérisation du Médiateur
IV.1.2 Organisation et structure du Médiateur de S. cerevisiae
IV.2 Le Médiateur des animaux
IV.2.1 Identification et composition
IV.2.2 Conservation du Médiateur
IV.2.3 Etudes fonctionnelles et pathologies
IV.3 Mécanismes de la régulation de l’expression des gènes par le Médiateur
IV.3.1 Interactions entre le Médiateur et les activateurs spécifiques
IV.3.2 Interactions entre le Médiateur et l’ARN polymérase II
IV.3.3 Interaction entre le Médiateur et les facteurs généraux
IV.3.4 Etudes du recrutement du Médiateur sur l’ADN in vivo
IV.3.5 Le Médiateur et les autres coactivateurs
IV.3.6 Le Médiateur, une plateforme pour la réinitiation
IV.3.7 Activité de modification des histones du Médiateur
IV.3.8 Régulation négative de la transcription par le Médiateur
IV.3.9 Le Médiateur : un facteur général de la transcription
RESULTATS ET DISCUSSION
I Rôle du Médiateur et de TFIIS dans l’étape d’initiation
I.1 Contexte du travail
I.2 Article 1
II Rôle du Médiateur dans la mise en place du PIC in vivo
II.1 Contexte du travail
II.2 Article 2
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
BIBLIOGRAPHIE

Télécharger le rapport complet