Soutenance mémoire
Description de la graine d’arachide
L’arachide domestique (Arachis hypogaea L.) est une légumineuse originaire d’Argentine. Elle appartient à la sous-famille des Papilionacées et accumule ainsi dans ses cotylédons ses réserves nutritives principalement constituées de protéines, de grains d’amidon et de lipides (Chevalier, 1933). Malgré cette appartenance taxonomique à la famille des légumineuses, et à l’instar de sa similarité visuelle, l’arachide présente une composition en macronutriments plus proche de celle des fruits à coques (tableau I.1). En effet, bien que riche en protéines comme la plupart des légumineuses, l’arachide est également riche en lipides et pauvre en sucres comme la plupart des fruits à coques (ANSES, 2017) . Dans le tableau I.1, les concentrations massiques sont indiquées pour 100g de matière fraîche (ou humide), la teneur en eau de la graine fraîche étant généralement de 4 g/100g. Les concentrations peuvent cependant aussi parfois être données pour 100 g de matière sèche (après évaporation de l’eau). De façon générale, et sauf indications contraire, les compositions massiques données sont exprimées par rapport à la matière fraîche. Alors que l’Asie et l’Afrique multiplient les variétés d’arachide, l’Amérique suit la classification proposée par les Etats-Unis et classe sa production d’arachide en quatre variétés principales: Spanish, Runner, Valencia et Virginia (tableau I.2). La Runner, créée par hybridation en 1969, correspond aujourd’hui à plus de 90 % du volume de production aux Etats-Unis (Bilello, 2016; CRB, 2007). 50 % de la production mondiale d’arachide servent à la confection de beurre de cacahuètes, produit par grillage et broyage de l’arachide blanchie (Bilello, 2016; Chun, 2002; CRB, 2007).
Aleurones
Les aleurones sont les structures permettant le stockage des protéines de réserve de la graine. Elles se situent également dans les cellules parenchymateuses des cotylédons de l’arachide. Ce sont des globules de diamètre compris entre 3 et 10 µm (Young and Schadel, 1991), qui proviennent de la déshydratation de vacuoles cellulaires (une vacuole donne un aleurone) lors de la croissance de la plante. Leur membrane est donc une membrane lipidique semi-perméable composée de lipides neutres et de phospholipides. Lors de la croissance de la plante, la vacuole se remplit de protéines de réserve, stockées sous la forme d’une phase protéique amorphe au sein de l’aleurone (Amonsou et al., 2011; Bethke et al., 1996). Un aleurone d’arachide peut parfois contenir une ou plusieurs inclusion(s) cristalline(s) sphérique(s) appelées globoïde(s), riche(s) en phytine (Chevalier, 1934). Ces inclusions mesurent entre 0,5 et 4 µm et sont principalement constituées de protéines (35 g/100g) et de phosphore sous forme d’acide phytique et de phytine (28g/100g), ainsi que d’eau (9 g/100g), de magnésium (2,5 g/100g), de potassium (2 g/100g) et de calcium (0,5 g/100g) (Sharma and Dieckert, 1975). Les protéines contenues dans les globoïdes ne dépassent pas 1 g/100 g des protéines totales d’une aleurone, elles n’ont pas été identifiées à notre connaissance. Leur nombre et leur taille varient d’un grain d’aleurone à un autre, ce qui induit une variabilité dans leur composition biochimique. C’est au sein des aleurones que se trouvent les réserves de phosphore de l’arachide, principalement stockées sous forme d’acide phytique et à un degré moindre de phytine. La structure de ces aleurones est particulièrement sensible aux solutions aqueuses et salines, qui ont pour effet de déstabiliser leur membrane par différence de pression osmotique (Mikola et al., 1975).
Profil en acide gras de la graine d’arachide
Les lipides sont les principaux constituants de la graine d’arachide. La teneur en lipides de la graine varie entre 44 et 56 g/100 g, en masse fraîche (Toomer, 2017). Il s’agit principalement de triglycérides (~97 g /100 g de lipides), le reste est composé de phospholipides (réparti environ en 50 % de phosphatidylcholine, 25 % de phosphatidyléthanolamine et 25 % de phosphatidylsérine, en masse) (Yoshida et al., 2005) et de stérols (réparti environ en 75 % de β sitostérols, 13 % de campestérols et 12 % de stigmastérols, en masse) (Sheppard and Rudolf, 1991). Le profil en acides gras diffère selon la variété d’arachide considérée (figure I.4), mais également en fonction des conditions géographiques et climatiques de sa production. Les données présentées ici sont donc à considérer comme des valeurs indicatives, susceptibles de varier selon ces différents facteurs. On constate que l’acide oléique (C18 :1) et l’acide linoléique (C18 :2) sont les deux acides gras majoritaires de l’arachide. Le ratio entre ces deux composés (C18 :1/C18 :2) varie d’une variété à l’autre : 1 pour les variétés Spanish et Valencia, 1,7 pour la variété Virginia et 1,9 pour la variété Runner. Il est démontré que ce ratio est directement corrélé à une meilleure stabilité à l’oxydation des lipides et permet ainsi de conduire à des produits avec une durée de conservation plus élevée (Brown et al., 1975). C’est pour leur ratio C18 :1/C18 :2 naturellement élevé que des cultivars ont été génétiquement sélectionnés pour produire des arachides dites à haute teneur en acide oléique (HO, pour « High Oleic ») : environ 38 g/100 g en acide oléique et 2 g/100 g en acide linoléique.
Prétraitement du fruit jusqu’à la graine dépelliculée
Pour tout type d’utilisation des graines de légumineuses et de leurs composants, on retrouve initialement une même succession d’étapes décrites ci-dessous. Dans un premier temps, l’étape de tri à la suite de la récolte permet d’éliminer les impuretés présentes dans un stock d’arachide, telle que poussière, sable, feuilles, tiges, vers, etc. Ensuite, le décorticage se fait le plus souvent par succession d’étapes de frottement des arachides contre des tamis. Les coques, plus légères, sont soufflées par un flux d’air tandis que les graines tombent dans le tamis suivant, où l’opération est renouvelée jusqu’à l’élimination complète des coques (Stalker and Wilson, 2016). Dans l’utilisation industrielle qui nous intéresse, il est également nécessaire de retirer la pellicule qui entoure la graine, car cette dernière contient des facteurs antinutritionnels comme des inhibiteurs de l’α-amylase et des tannins. Ce procédé s’appelle le blanchiment et s’effectue généralement entre 50°C et 120°C, à sec ou par trempage dans de l’eau avec des ratios arachide:eau de 1:3 à 1:10 (p/p). Le blanchiment par trempage dure de 1 à 3 heures, tandis que le blanchiment à sec peut durer de quelques secondes à plusieurs heures. Généralement, plus le traitement thermique est important, plus le temps choisi est court, mais un couple température élevée / temps long peut être choisi dans certaines applications où la graine est consommée cuite, par exemple en bouillie ou en sauce. A la suite du traitement, l’enveloppe est alors séparée à la main ou par passage dans un dispositif de soufflerie une fois la graine sèche. Un traitement de 3 heures dans une eau de trempage à 50°C permettrait de diminuer de 25 % la concentration en facteurs antinutritionnels tels que les inhibiteurs de l’α-amylase et de diffuser l’intégralité des tannins contenus dans la graine dans l’eau de trempage (Ejigui et al., 2005). Le blanchiment présente de nombreux autres avantages, tels que l’arrêt complet de la croissance des champignons et la diminution de 72 à 78 % du taux d’aflatoxines produites au cours du stockage (Darko et al., 2018). Cette technique permet également d’allonger la durée de conservation de la graine en stoppant l’activité enzymatique résiduelle (Schirack et al., 2006b) et en améliorant la stabilité de l’huile à l’oxydation par la génération de composés antioxydants et antibactériens tels que l’α-limonène, le γ-terpinène et le p-cymène à des concentrations massiques comprises entre 55 et 70 µg/100g d’huile, comme mesuré lors d’un blanchiment à sec (de Camargo et al., 2016). Il en résulte des temps de conservation du produit plus longs. Ainsi une graine blanchie à sec peut se conserver 200 jours à 25°C contre 100 jours pour une graine blanchie par trempage et séchée (Angelo et al., 1977). Enfin, le choix des conditions de prétraitement conditionne également les propriétés organoleptiques de la graine. En effet, lors du blanchiment, une température élevée (95°C à 110°C) et un temps de traitement court (10 minutes) permettent également de ne pas développer de flaveurs non désirées comme la note « torréfiée » ou « brûlée » et de conserver les deux cotylédons de la graine ensemble, ce qui est préféré dans certaines utilisations telles que la production de snacks (Hoover, 1979; Schirack et al., 2006b).
Gélification thermique
La gélification des protéines par traitement thermique est une des voies principales de formation de gels de protéines. Le principe est le suivant : à une température supérieure à leur température de dénaturation, les protéines globulaires (dont la structure interne est stabilisée par des ponts disulfures, des liaisons hydrogènes et des forces de Van der Waals) perdent leur structure native : elles se déplient et exposent les résidus jusqu’alors enfouis dans la structure globulaire. Ce dépliement permet d’exposer les groupements hydrophobes ainsi que certains groupements SH qui peuvent être situés au cœur de la structure. Les protéines s’agrègent alors en un réseau tridimensionnel via des interactions non covalentes et covalentes (liaisons S-S). Il s’agit donc d’un procédé en deux étapes : dénaturation des protéines puis agrégation (Totosaus et al., 2002). La structure du gel dépend de la cinétique de chacune des étapes et de la nature des protéines, ainsi que du pH et de la force ionique du milieu (Utsumi and Kinsella, 1985). Par exemple, pour une même température de traitement thermique, il a été observé sur des protéines de pois qu’un chauffage plus lent permettait au réseau de se former à des températures plus basses (point de gel à 61°C lors d’un chauffage à 0,5°C/min, contre 84°C lors d’un chauffage à 4°C/min) (Sun and Arntfield, 2010). Sur ces mêmes protéines, les auteurs ont observé qu’un refroidissement plus lent (0,5°C/min au lieu de 2°C/min) permettait au réseau de mieux se former, avec pour effet un module élastique cinq fois plus important, de 2 000 Pa Page 31 sur 213 (refroidissement à 2°C/min) à 10 000 Pa (refroidissement à 0,5°C/min), pour une concentration en protéines de 12 g/100 mL chauffées à 95°C (Sun and Arntfield, 2012). Les auteurs expliquent cela par l’implication de ponts disulfures (liaison forte) dans le réseau pour une vitesse de refroidissement ≤ 1°C/min, tandis qu’ils n’ont pas le temps de se former (ou de façon minoritaire) lors de refroidissements plus rapides. Pour un refroidissement rapide (≥1°C/min), ce sont les liaisons hydrogènes et hydrophobes qui pilotent le module élastique du gel. Le pH est susceptible de modifier l’agrégation des protéines lors d’un traitement thermique. Comme illustré en figure 1.16, à un pH éloigné du pHi des protéines, on observe un déroulement de la structure des protéines du fait des répulsions électrostatiques au sein de la protéine, ce qui favorise la formation d’un gel filamenteux. Ce type de gel se structure en chaînes linéaires de protéines, d’épaisseur et d’élasticité variables. Le même processus peut être observé à faible force ionique. A l’inverse, à un pH proche du pHi, les répulsions électrostatiques sont faibles et les protéines dénaturées se présentent sous une structure repliée. Le gel est alors formé par agrégation de particules partiellement sphériques (Lefèvre and Subirade, 2000; Morris, 2009; Yang, 2016). Figure I.16 : Gélification de β-lactoglobuline par traitement thermique : impact du pH sur la structuration du gel au cours du traitement. Adapté de Lefèvre and Subirade, 2000 Il est généralement observé que les gels filamenteux ont une force de gel, une élasticité et une capacité de rétention d’eau (CRE) plus importantes que les gels particulaires. Ces derniers sont plus grossiers (taille de pores comprise entre 1,5 et 2,0 µm, contre 0,02 à 0,12 µm pour des gels filamenteux) et forment des structures plus opaques (Urbonaite et al., 2016). De par leur concentration importante, notamment chez les végétaux, les globulines sont des protéines particulièrement étudiées lors de l’utilisation de ce procédé (Nicolai and Chassenieux, 2019). La pHpI pH≈pI Page 32 sur 213 diversité de leurs structures et de leurs propriétés fonctionnelles permet, par le biais des paramètres d’extraction des protéines et de gélification, d’obtenir une grande variété de structures et de textures lors de leur gélification thermique, qu’il s’agisse de globulines animales (Chihi et al., 2016) ou végétales (Berghout et al., 2015; Nicolai and Chassenieux, 2019; O’Kane et al., 2004), voire de globulines différentes issues d’une même source végétale, comme étudié pour le soja (Renkema et al., 2001; Utsumi and Kinsella, 1985) et pour l’arachide (Wang et al., 2014). Concernant l’arachide, ce sont les arachines et les conarachines, les deux principales familles de globulines de la graine, qui pilotent les propriétés des gels (Chiou, 1990; Wang et al., 2014). Les températures de dénaturation ont été mesurées par calorimétrie différentielle à balayage (Differential Scanning Calorimetry, DSC) en milieu aqueux entre 89,4 et 95,8 °C pour la conarachine et entre 101,1 et 111,6 °C pour l’arachine, pour des concentrations en protéines allant de 60 à 5 g/100 g (Colombo et al., 2010). Cela suggère que la structure de l’arachine est plus résistante au traitement thermique que celle de la conarachine, ce qui est confirmé par d’autres travaux (Chiou, 1990; Evans et al., 1962). Il est cependant possible de former des gels à partir d’arachine par des traitement thermique à 90 et 95°C, soit entre 5 et 15°C de moins que la température de dénaturation mentionnée plus haut, ce qui pourrait suggérer que cette donnée est fortement dépendante des conditions dans lesquelles elle est étudiée (Wang et al., 2014; Wang, 2017). Concernant la conarachine, des gels peuvent être formés à partir de 85°C, soit à une température proche (2,7°C d’écart) de la température de dénaturation la plus faible mesurée par Colombo et. al.. Les gels formés par traitement thermique (90°C pendant 60 min) à partir de conarachine ont, à concentration égale en protéine, une force de gel 1,5 fois supérieure à ceux formés à partir d’arachine (Mujoo et al., 2003; Renkema et al., 2001; Wang et al., 2014). Cela pourrait traduire des différences en termes de force ou de densité de liaisons dans les gels formés à partir de ces deux types de protéines. Cette différence a été attribuée aux acides aminés soufrés : la conarachine possède 1,5 fois plus de cystéine que l’arachine, elle est donc susceptible de former plus de ponts disulfures.
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Table des matières
Introduction générale
Chapitre I : Etude bibliographique
I.1 Description, organisation et composition de la graine d’arachide
I.1.1 Description de la graine d’arachide
I.1.2 Organisation d’une graine d’arachide.
I.1.2.1 Organisation générale
I.1.2.2 Grains d’amidon
I.1.2.3 Sphérosomes
I.1.2.4 Aleurones
I.1.3 Composition biochimique de la graine d’arachide
I.1.3.1 Profil en acide gras de la graine d’arachide
I.1.3.2 Profil glucidique de la graine d’arachide
I.1.3.3 Profil protéique de la graine d’arachide
I.1.3.4 Micro-constituants des graines d’arachide
I.2 Solubilité et extraction des protéines de légumineuses
I.2.1 Prétraitement du fruit jusqu’à la graine dépelliculée
I.2.2 Traitements à sec de la graine dépelliculée
I.2.3 Solubilisation et extraction des protéines
I.2.3.1 Solubilisation des protéines
I.2.3.2 Fractionnement des protéines solubilisées
I.3 Propriétés fonctionnelles et structuration de systèmes protéiques
I.3.1 Propriétés gélifiantes
I.3.1.1 Gélification thermique
I.3.1.2 Gélification par acidification
I.3.1.3 Gélification par traitement enzymatique
I.3.1.4 Gélification des protéines d’arachide : bilan des travaux déjà réalisés
I.3.1.4 Théorie fractale et gélification des protéines
I.3.2 Impact d’une phase dispersée lors de la gélification d’une solution de protéines
I.3.3 Gélification de matrices protéiques contenant des polyoses
I.3.4 Propriétés interfaciales des protéines
Chapitre II : Stratégie de recherche
Chapitre III : Matériels et Méthodes
III.2 Matières premières et réactifs
III.3 Méthodes
III.3.1 Transformation de la graine
III.3.1.1 Broyage
III.3.1.2 Préparation de la suspension
III.3.1.3 Fractionnement des composants du mix par centrifugation
III.3.1.3.1 Fractionnement « standard »
III.3.1.3.2 Fractionnement pour l’extraction « douce » du surnageant
III.3.1.3.3 Fractionnement pour l’extraction « propre » du culot
III.3.1.4 Préparation d’extraits protéiques de concentration et de force ionique maîtrisées
III.3.1.4.1 Préparation d’un concentrat protéique
III.3.1.4.2 Préparation d’une solution de protéines de concentration et de force ionique maîtrisées
III.3.2 Analyse biochimique de la suspension
III.3.2.1 Mesures de stabilité de la graine et du broyat
III.3.2.2 Détermination de la matière sèche
III.3.2.3 Extraction et quantification des lipides
III.3.2.4 Quantification des protéines par la méthode de Kjeldahl
III.3.2.5 Dosage des protéines solubles par spectrophotométrie
III.3.2.6 Dosage des groupements SH des protéines de la fraction intermédiaire
III.3.2.7 Mesure de l’hydrophobicité de surface des extraits protéiques
III.3.2.8 Analyse du profil protéique de la fraction intermédiaire par électrophorèse SDS-PAGE
III.3.3 Analyse structurale de la suspension et de ses fractions
III.3.3.1 Mesure de taille
III.3.3.1.1 Mesure des tailles par diffraction laser
III.3.3.1.2 Mesure des tailles par diffusion dynamique de rayonnement
III.3.3.2 Observation microscopique
III.3.3.2.1 Microscopie optique
III.3.3.2.2 Microscopie optique confocale laser
III.3.3.3 Analyse de la sédimentation des échantillons
III.3.4 Mesures des propriétés mécaniques et rhéologiques des gels
III.3.4.1 Caractérisation des propriétés rhéologiques
III.3.5 Tests statistiques
Chapitre IV : Caractérisation de la suspension d’arachide et de sa capacité gélifiante
IV.1 Composition biochimique du broyat et de la suspension
IV.2 Distribution des composants dans les différentes fractions et structure des différentes phases
IV.2.1 Répartition des composants dans les différentes fractions
IV.2.2 Etude du surnageant
IV.2.3 Etude de la fraction intermédiaire
IV.2.4 Etude du culot
IV.3 Capacité gélifiante de la suspension
IV.4 Propriétés rhéologiques et structurales d’un gel de suspension d’arachide obtenu par traitement thermique précédé ou non d’un traitement enzymatique
Chapitre V : Gélification et propriétés de gels formés à partir des protéines d’arachide extraites dans la phase intermédiaire
V.1 Effets combinés de la force ionique et d’un prétraitement enzymatique dans la gélification thermique d’extraits de protéines d’arachide
V.1.1 Introduction
V.1.2 Materials & Methods
V.1.2.1 Materials
V.1.2.2 Methods
V.1.2.2.1 Sample preparation
V.1.2.2.2 Protein characterization
V.1.2.2.3 Gelation and gel characterization
V.1.3. Results and discussion
V.1.3.1 Protein extracts characterization
V.1.3.2 Gelation and rheological properties
V.1.3.2.1 Evolution of the rheological properties during gelation
V.1.3.2.2 Sol-gel transition
V.1.3.2.3 Fractal-like scaling of the storage modulus
V.1.3.3 Gels microstructure
V.1.4. Conclusion
V.2 Résultats complémentaires
V.2.1 Etude de l’impact de la lyophilisation sur les propriétés physico-chimiques et rhéologiques de la fraction intermédiaire
V.2.2 Etude de l’impact du traitement enzymatique sur l’agrégation des protéines d’arachide
Chapitre VI : Rôle des fractions dispersées dans les processus de gélification
VI.1 Effets de l’incorporation de corps lipidiques sur les propriétés des gels de protéines
VI.1.1 Evolution des cinétiques de gélification en fonction de la fraction volumique en lipides
VI.1.2 Effet de la fraction volumique en lipide sur les propriétés rhéologiques finales des gels
VI.1.3 Etude de la microstructure
VI.2 Etude de la gélification du culot en présence ou non de protéines solubles
VI.2.1 Etude de la capacité gélifiante du culot
VI.2.2 Propriétés rhéologiques des gels formés à partir du culot
VI.2.3 Etude de la microstructure des gels
Conclusion générale et perspectives
Valorisations scientifiques
Références
ANNEXES
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