Soutenance mémoire
Validation des super spectres et des spectres de référence
Souches bactériennes
Les souches d’Acinetobacter utilisées pour la création des super spectres sont des souches cliniques et environnementales. Parmi les souches cliniques, certaines sont des souches de référence, comme les souches CIP 5377, CIP 107292, et CIP 7034 pour A. baumannii, et CIP 7029T pour A. pittii. Les autres souches cliniques proviennent du laboratoire de bactériologie du CHU d’Angers. Les souches environnementales ont été isolées lors d’études réalisées à La Réunion et au Liban. Les souches d’Acinetobacter utilisées pour valider les spectres de référence et les super spectres sont des souches cliniques isolées au laboratoire de bactériologie du CHU d’Angers. Toutes les souches utilisées ont été conservées en cryobilles à – 80°C ou en gélose viande-foie à température ambiante. La souche d’Escherichia coli ATCC8739 a été utilisée pour la calibration manuelle du laser et comme contrôle interne.
Séquençage rpoB
L’identification au rang d’espèce de toutes les souches utilisées dans cette étude a été confirmée par séquençage partiel du gène rpoB, selon le schéma proposé par Gundi et al.(23). Brièvement, un fragment de 350 pb qui permet de discriminer aisément les différentes espèces d’Acinetobacter est amplifié à l’aide des amorces Ac696F et Ac1093R (séquences respectives 5’-TAYCGYAAAGAYTTGAAAGAAG-3’ et 5’ CMACACCYTTGTTMCCRTGA-3’), selon les conditions de PCR suivantes : après une activation de l’enzyme (GoTaq DNA polymerase – Promega Madison, USA) à 94 °C pendant 15 min, une étape d’amplification de l’ADN cible est réalisée sur 40 cycles. Chaque cycle comprend une phase de dénaturation de 30 sec à 94 °C, une phase d’hybridation de 30 sec à 55 °C et une phase d’élongation de 1 min à 72 °C. Enfin, une étape d’élongation finale est réalisée à 72°C pendant 5 min. L’ADN amplifié est ensuite quantifié avec le
spectrophotomètre NanoDrop 1000 (ThermoScientific, Wilmington, USA), et les amplicons sont purifiés à l’aide du kit NucleofastR (Macherey Nagel, Düren, Germany), selon les recommandations du fournisseur. Puis, la réaction de séquence est réalisée à l’aide du kit BigDye Terminator (v3.1. – Applied Biosystems, Foster City, USA), selon les conditions de PCR recommandées par le fournisseur : activation de l’enzyme à 96 °C pendant 1 min, étape d’amplification réalisée sur 25 cycles, chaque cycle comprenant une phase de dénaturation de 10 sec à 96 °C, une phase d’hybridation de 5 sec à 50 °C et une phase d’élongation de 4 min à 60 °C. Enfin, après purification des produits de séquence à l’isopropanol, une électrophorèse est réalisée avec le séquenceur 3130XL Genetic Analyzer® (Applied Biosystems, Foster City,USA). Les séquences nucléotidiques obtenues sont ensuite analysées sur le serveur NCBI avec le logiciel BlastN (BLAST Basic Local Alignment Search Tool.htm). Un isolat est considéré comme correctement identifié lorsque la séquence obtenue présente une similarité ≥ 98% avec la séquence la plus proche de l’espèce bactérienne donnée par BlastN.
Spectromètre de masse
Le spectromètre de masse de notre étude est le VITEKMS plus de bioMérieux, il est utilisé en mode RUO. La souche d’E. coli ATCC8739 servant à la fois de calibration manuelle du laser et de contrôle interne est déposée en triplicat sur une cible Vitek MS® (DS ref.410893). Les souches d’Acinetobacter étudiées dans ce travail sont déposées en duplicat. Une matrice acide α-cyano-4-hydroxycinnamique (CHCA) est ensuite ajoutée. Les paramètres du laser sont ceux recommandés par le fournisseur (paramètres par défaut). Les masses protéiques analysées sont comprises entre 2000 et 20000 Daltons avec une tolérance de 0.08%.Dans un premier temps, une calibration manuelle du laser est effectuée. Pour cela, un total de 100 tirs est réalisé sur un dépôt comportant la souche d’E. coli ATCC8739. Les résultats sont représentés sous forme de spectre de masse. La calibration est validée si l’intensité des pics correspondant aux masses protéiques est comprise entre 20 et 100 mV, si la somme des intensités des pics est de plus de 3000 mV et si la résolution des pics principaux est à au moins 600.
Lorsque la calibration manuelle est validée, le laser tire à nouveau sur la souche d’E. coli, celle-ci servant alors de contrôle interne. Ensuite, les différentes souches d’Acinetobacter sont analysées, à raison de 100 tirs par spot. Enfin, le laser tire une dernière fois sur le contrôle interne. Lorsque les résultats de ce dernier sont conformes à ceux préconisés par le fournisseur (identification d’E. coli avec un degré de confiance >90%), les données concernant les masses protéiques des souches d’Acinetobacter sont transférées dans le logiciel Launchpad puis interprétées à l’aide de la base de données SARAMISTM.
Principe de la base de données SARAMISTM
La base de données SARAMISTM comprend i) des « super spectres » qui sont des spectres obtenus à partir des 40 masses protéiques les plus spécifiques et représentées d’une espèce bactérienne. Brièvement, un super spectre est réalisé à partir des spectres protéiques d’au moins huit souches d’une même espèce, chaque souche étant analysée elle-même dans différentes conditions. Parmi tous les spectres obtenus, ceux retenus pour la réalisation du super spectre doivent avoir un nombre de masses protéiques compris entre 70 et 160 et plus de 65% de masses communes entre eux. Par ailleurs, pour une même souche analysée sous différentes conditions de culture, les spectres doivent avoir une homologie de plus de 70%. La bonne homologie est visualisée à l’aide d’un dendrogramme; ii) des spectres de référence, ce sont des spectres de souches bactériennes qui ont servis à compléter la base de données spectrale. Ces spectres de référence ont servis ou non à la réalisation de super-spectres.
Lorsqu’une souche bactérienne est analysée par spectrométrie de masse, le spectre obtenu est dans un premier temps comparé aux super spectres présents dans la base de données. Si aucune identification n’est retrouvée, le spectre obtenu est comparé aux spectres de référence.
Cette base de données RUO « non figée » a pour avantage principal de permettre à l’expérimentateur d’incrémenter de nouveaux spectres bactériens.
Création des super spectres
Dix souches d’A. baumannii et d’A. pittii (dont les souches de référence) ainsi que 8 souches d’A. nosocomialis ont été utilisées pour la création des super spectres. Chaque souche a été ensemencée sur 6 milieux différents : 2 géloses au sang Oxoid (Thermo Fisher Scientific, United Kingdom) 2 géloses Chromogènes de type UTI® Oxoid et 2 géloses Mueller-Hinton (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, USA). Une gélose de chaque type a été incubée à 29°C et une autre à 37°C, pendant 48 heures au total. Pour chaque milieu, des dépôts ont été réalisés après 24 et 48 heures d’incubation, en duplicat. Pour chaque duplicat, un seul spectre a été sélectionné, il devait présenter un nombre de masses compris entre 70 et 160 et un bon pourcentage d’homologie avec les autres souches de son espèce dans le dendrogramme. Après avoir été incrémentés dans la base de données SARAMISTM comme spectres de référence dans leur espèce respective, ces spectres ont servi à la création de super spectres.Plusieurs étapes ont été nécessaires à la création des super spectres. Tout d’abord, les masses protéiques communes à au moins 2 des 3 espèces d’intérêt ont été exclues. Ensuite,pour chaque espèce, les 40 masses les plus représentées dans les spectres de référence ont été sélectionnées. Un poids plus ou moins important a été attribué à chacune de ces masses, en fonction de leur fréquence au sein des différents spectres. Enfin, les super spectres obtenus ont été validés après comparaison avec les spectres de toutes les espèces bactériennes présentes dans la base de données SARAMISTM afin de s’assurer de leur spécificité d’espèce.Pour ne pas interférer avec notre étude, les super spectres d’Acinetobacter déjà présents dans la base de données SARAMISTM ont été inactivés.
|
Guide du mémoire de fin d’études avec la catégorie Création des super spectres |
|
Étudiant en université, dans une école supérieur ou d’ingénieur, et que vous cherchez des ressources pédagogiques entièrement gratuites, il est jamais trop tard pour commencer à apprendre et consulter une liste des projets proposées cette année, vous trouverez ici des centaines de rapports pfe spécialement conçu pour vous aider à rédiger votre rapport de stage, vous prouvez les télécharger librement en divers formats (DOC, RAR, PDF).. Tout ce que vous devez faire est de télécharger le pfe et ouvrir le fichier PDF ou DOC. Ce rapport complet, pour aider les autres étudiants dans leurs propres travaux, est classé dans la catégorie Résultats du séquençage du gène rpoB où vous pouvez trouver aussi quelques autres mémoires de fin d’études similaires.
|
Table des matières
1 Introduction
2 Matériels et méthodes
2.1 Souches bactériennes
2.2 Séquençage rpoB
2.3 Spectromètre de masse
2.4 Principe de la base de données SARAMISTM
2.5 Création des super spectres
2.6 Validation des super spectres et des spectres de référence
3 Résultats
3.1 Caractéristiques des spectres de référence et des super spectres de notre étude
3.2 Validation des super spectres et des spectres de référence
3.3 Résultats du séquençage du gène rpoB et comparaison avec les résultats obtenus par
spectrométrie de masse
4 Discussion
5 Conclusion
BIBLIOGRAPHIE
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
TABLE DES MATIERES
ANNEXE 1
ANNEXE 2
Télécharger le rapport complet
