Soutenance mémoire
Les bactéries ont été pendant longtemps responsables de maladies, mais aussi d’une forte mortalité surtout chez les enfants et les personnes âgées. Cependant, on note que la découverte du premier antibiotique, la pénicilline, par Alexander Flemming en juin 1929 (25) a entraîné une baisse considérable de cette mortalité. Dès lors les premiers antibiotiques d’origine naturelle, ont vu leur efficacité améliorée par la mise au point de nouveaux antibiotiques produits par synthèse. Des méthodes de dosage établies par les scientifiques permettent de vérifier l’efficacité des antibiotiques utilisés en thérapeutique. En effet, l’arsenal médicamenteux en croissante évolution a rapidement nécessité pour certaines molécules le développement d’un suivi thérapeutique. Ainsi, le dosage des médicaments en général et des antibiotiques en particulier fait maintenant partie des prescriptions classiques à l’hôpital et est devenu le complément nécessaire du bilan biologique (31). Plusieurs méthodes de dosage sont utilisées mais la méthode de diffusion sur gélose reste de loin la méthode la plus accessible et la plus employée en pratique courante au niveau des laboratoires. La mise en route de tels types d’examens exige, comme pour la détermination des paramètres biologiques et biochimiques, une validation des méthodes de dosage mises en œuvre. Cette exigence de validation est pratique courante dans le domaine industriel où toute nouvelleméthode décrite dans un dossier d’autorisation de mise sur le marché (AMM) doit être accompagnée d’une validation complète (31). La validation d’une méthode analytique peut être définie comme une démarche critique visant à s’assurer de sa qualité ou validité. L’objectif de la validation n’est pas de comparer une méthode à une autre mais de mieux connaître ses caractéristiques pour définir et juger la qualité du processus analytique (22, 31).
RAPPELS SUR LES BACTERIES
HISTORIQUE – DEFINITION
Le monde vivant est constitué de trois règnes : le règne animal, le règne végétal et le règne des protistes. Le règne des protistes proposé par Haeckel (1866) a été subdivisé par Chatton (1937) en protistes supérieurs ou Eucaryotes (Algues, Protozoaires, champignons) et en protistes inférieurs ou protocaryotes (bactéries, Algues bleues) constitués d’un chromosome unique et dépourvu de membrane nucléaire. Les bactéries ou Schizomycetes constituent le groupe le plus important et le plus diversifié des protistes protocaryotes. Elles sont caractérisées par l’existence d’une paroi rigide le peptidoglycane qui conditionne les trois formes morphologiques fondamentales : sphérique (coque), cylindrique (bacille), spiralée. Les bactéries se multiplient habituellement par scissiparité mais peuvent aussi présenter des recombinaisons génétiques partielles. Il faut cependant distinguer les protistes des virus.
STRUCTURE DES BACTERIES
Moyens d’étude
L’étude des bactéries se fait selon plusieurs techniques et utilise soit :
• Le microscope optique : permet de faire : Un état frais entre lame et lamelle qui renseigne sur la forme et la mobilité des bactéries ;
Un examen après fixation et coloration pour mieux apprécier leur morphologie. Il existe de nombreuses colorations et la plus utilisée est la coloration de Gram.
• Le microscope électronique : utilisé pour les travaux de recherche et permet l’étude fine de la bactérie.
• Le fractionnement des bactéries : il utilise différents moyens qui font intervenir des procédés physiques (utilisation de micro-billes), chimiques (utilisation d’antibiotiques et de détergents) et physico-chimiques (centrifugation différentielle, filtration).
Anatomie des bactéries
Les enveloppes bactériennes
• la capsule : c’est le constituant le plus superficiel, elle joue un rôle dans la virulence de la bactérie et permet une classification antigénique des bactéries capsulées.
• Le glycocalyx : c’est un feutrage des fibres polysaccharidiques qui entoure les bactéries placées dans leur milieu naturel et qui leur permet d’adhérer à leur support. Il joue un rôle dans l’élaboration de la plaque dentaire par Streptococcus mutans.
• La paroi : c’est une enveloppe rigide qui assure la forme de la bactérie. Elle est absente chez les Mycoplasmes. Sa structure est différente selon qu’il s’agit de bactéries Gram (+) ou Gram (–) mais elles ont en commun le péptidoglycane, un polymère macromoléculaire entourant la bactérie.
La paroi des bactéries Gram (+) est relativement épaisse et constituée en majeure partie par le péptidoglycane. Les polyosides, responsables de la spécificité antigénique des bactéries, sont branchés sur la paroi.
La paroi des bactéries Gram (-) possède une mince couche de péptidoglycane recouverte d’une couche tri-lamellaire appelée « enveloppe externe ». Cette couche contient des protéines, des lipides et le lipopolysaccharide. Ce dernier porte l’antigène O ou antigène de surface utilisé pour la classification de certaines espèces bactériennes. La perméabilité de la paroi à l’alcool explique le caractère Gram (-) des bactéries. La paroi est douée de plusieurs fonctions surtout :
– Dans la coloration de Gram
La coloration de Gram est une coloration différentielle basée sur la perméabilité plus grande de la paroi des bactéries Gram (-) à l’alcool. Elle consiste dans un premier temps à réaliser un complexe colorant soluble dans l’alcool (cristal-violet, lugol) qui colore en violet le cytoplasme de toutes les bactéries.Dans un second temps, intervient la décoloration par l’alcool qui traverse bien la paroi des bactéries Gram (-) et dissout le complexe colorant. Chez les bactéries Gram (+), la paroi ne se laisse pas traverser. Dans un troisième temps, on fait une contre coloration par la fushine. Seules les bactéries décolorées par l’alcool fixent la fushine et apparaîtront rouges : on les dit bactéries Gram (-). A l’inverse les bactéries Gram (+) ont conservé la coloration du premier temps :
Dans la forme des bactéries
Dans l’antigénicité
Dans l’action des antibiotiques .
Membrane cytoplasmique : située sous la paroi à son contact. L’adhésion n’est pas toujours parfaite, elle délimite l’espace péri-plasmique. La membrane forme une barrière osmotique, contient des systèmes de transport et des enzymes. La cellule se divise par scissiparité.
Les constituants internes
• Le cytoplasme : il est constitué d’une machinerie nécessaire aux synthèses protéiques et de nombreux ribosomes constitués de protéines et d’ARN. Il possède 2 sous-unités qui, chez les bactéries sont de 50S et 30S. On y retrouve aussi des granulations, formes de stockage des constituants.
• Le noyau : il est mis en évidence au microscope optique après coloration de Feulgen. En microscopie électronique on a une structure fibrillaire. Le chromosome bactérien est un filament d’ADN bicaténaire, circulaire nu, organisé en certain nombre de boucles stabilisées par un noyau d’ARN.
• L’ADN extra-chromosomique ou plasmide .
Les appendices externes
• Flagelle : il assure la mobilité de la bactérie
• Les pili ou fimbriae : ils existent chez de nombreuses bactéries Gram (-) et ne sont apparents qu’en microscopie électronique. Nous avons des pili communs qui interviennent dans la fixation de la bactérie et des pili sexuels qui interviennent dans la conjugaison bactérienne.
La spore
Certaines espèces de bactéries, dites sporulées, ont la propriété, quand elles sont placées dans des conditions d’environnement défavorables, de donner naissance à des spores qui vont pouvoir résister indéfiniment au froid et à la dessiccation. Quand des conditions favorables se manifestent de nouveau, la spore redonne des bactéries végétatives identiques à celles qui lui ont donné naissance. La spore possède des constituants que l’on ne rencontre pas chez la bactérie en phase végétative et inversement. La sporulation représente donc un modèle intéressant pour approcher l’étude de la différenciation cellulaire. Parmi les propriétés les plus remarquables des spores, il faut citer la thermorésistance. Les méthodes de stérilisation par la chaleur doivent donc tenir compte de cette propriété.
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Table des matières
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : Etudes Bibliographiques
CHAPITRE I : Généralités Sur Les Antibiotiques
1. Rappels sur les bactéries
1.1 Historique – Définition
1.2 Structure des bactéries
1.2.1 Moyens d’étude
1.2.2 Anatomie des bactéries
1.2.2.1 Les enveloppes bactériennes
1.2.2.2 Les constituants internes
1.2.2.3 Les appendices externes
1.2.2.4 La spore
1.3 Croissance des bactéries
1.3.1 En milieu solide
1.3.2 En milieu liquide
2. Rappels sur les antibiotiques
2.1 Classification des antibiotiques antibactériens
2.1.1 Classification générale
2.1.2 Les bêta lactamines
2.1.2.1 Les pénicillines
2.1.2.2 Les autres
2.1.3 Aminosides ou oligossacharides
2.1.4 Tétracyclines
2.1.5 Macrolides et apparentés
2.1.6 Sulfamide et triméthoprime
2.2 Propriétés des antibiotiques
2.2.1 Les bêta lactamines
2.2.1.1 Mécanisme d’action
2.2.1.2 Indications
2.2.1.3 Caractères physiques
2.2.2 Les aminosides
2.2.2.1 Mécanisme d’action
2.2.2.2 Indications
2.2.2.3 Caractères physiques
2.2.3 Les cyclines
2.2.3.1 Mécanisme d’action
2.2.3.2 Indications
2.2.3.3 Caractères physiques
2.2.4 Les macrolide
2.2.4.1 Mécanisme d’action
2.2.4.2 Indications
2.2.4.3 Caractères physiques
2.2.5 Sulfaméthoxazole + triméthoprime
2.2.5.1 Mécanisme d’action
2.2.5.2 Indications
2.2.5.3 Caractères physiques
CHAPITRE II : Dosage Des Antibiotiques
1. Dosages micro-biologiques
1.1 Diffusion sur gélose
1.2 Turbidimétrie
2. Autres méthodes de dosage
2.1 Dosages immunologiques
2.2 Caractérisations physico-chimiques
3. Paramètres de la validation
3.1 Linéarité ou domaine d’analyse
3.2 Limite de Détection
3.3 Précision ou Fidélité
3.4 Répétabilité et Reproductibilité
3.4.1 Répétabilité
3.4.2 Reproductibilité
3.5 Spécificité et Sélectivité
3.6 Sensibilité
3.7 Exactitude ou Justesse
DEUXIEME PARTIE : Expérimentation au Laboratoire
MATERIELS ET METHODES
1. Cadre de l’étude
2. Réactifs et matériels
2.1 Souches tests
2.1.1 Escherichia coli
2.1.1.1 Isolement
2.1.1.2 Examen microscopique
2.1.2 Staphylococcus aureus
2.1.2.1 Isolement
2.1.2.2 Examen microscopique
2.2 Milieux de culture
2.2.1 Compositions
2.2.1.1 Antibiotic medium 1
2.2.1.2 Antibiotic medium 2
2.2.1.3 Antibiotic medium 11
2.2.1.4 Muller Hinton
2.2.1.5 Gélose pour entretien des souches
2.2.2 Préparation
2.3 Solvants et diluants
2.3.1 Composition
2.3.1.1 Tampon 1 pH
2.3.1.2 Tampon 3 pH 7 – tampon 3 pH 8
2.3.1.3 Tampon 4 pH 4,5
2.3.1.4 Autres
2.3.2 Préparation
2.4 Substances de référence
2.5 Antibiotiques à doser
2.6 Matériels
3. Dosage par diffusion sur gélose
3.1 Principe
3.2 Mode opératoire
3.2.1 Préparation suspension de germes
3.2.2 Préparation gamme de dilution
3.3 Titrage
3.4 Lecture et expression des résultats
4. Applications
4.1 Tests de stérilité
4.1.1 Milieux de culture
4.1.2 Tampons
4.2 Tests d’efficacité
4.3 Dosage des bêta lactamines
4.3.1 Ampicilline
4.3.1.1 Réactifs
4.3.1.2 Mode opératoire
4.3.2 Amoxicilline
4.3.2.1 Réactifs
4.3.2.2 Mode opératoire
4.4 Dosage des Cyclines
4.4.1 Tétracycline gélule 250mg
4.4.1.1 Réactifs
4.4.1.2 Mode opératoire
4.4.2 Tétracycline pommade
4.4.2.1 Principe
4.4.2.2 Réactifs
4.4.2.3 Mode opératoire
4.5 Dosage des Aminosides
4.5.1 Amikacine
4.5.1.1 Réactifs
4.5.1.2 Mode opératoire
4.5.2 Gentamicine
4.5.2.1 Réactifs
4.5.2.2 Mode opératoire
4.6 Dosage macrolides
4.6.1 Réactifs
4.6.2 Mode opératoire
4.7 Dosage Sulfaméthoxazole + Triméthoprime
4.7.1 Réactifs
4.7.2 Mode opératoire
4.8 Validation des méthodes de dosage
4.8.1 Répétabilitéé
4.8.2 Reproductibilité
RESULTATS
DISCUSSION
CONCLUSION
