SAAFA-76-MRRRCH
Validation analytique du dosage de CAT par spectrophotomètre UV
Définition et objectif de validation La Validation d’une méthode est la procédure par laquelle on démontre, preuves expérimentales à l’appui, que les performances de la méthode permettent de répondre aux exigences de l’usage auquel elle est destinée. Il faut donc démontrer que la méthode mise en œuvre par le laboratoire est apte à l’emploi prévu (11). La validation est donc fondée sur une analyse statistique basée sur un certain nombre de critères aboutissant à des méthodes analytiques permettant de donner des résultats fiables. II-2-Critères de validation La validation d’une méthode analytique consiste à vérifier certains critères à savoir (12) : Spécificitéü Linéaritéü FidélitéüJustesseü Limite de détectionü Limite de quantificationü 1-spécificité Capacité d’une méthode d’analyse à déterminer le Principe actif contenu dans un médicament. 2- Linéarité Capacité d’une méthode d’analyse, à l’intérieur d’un certain intervalle, à fournir une valeur d’information ou des résultats proportionnels à la quantité en analyste à doser dans l’échantillon pour le laboratoire. Elle permet de donner des informations sur la sensibilité. La sensibilité : est définie comme étant la pente moyenne d’un minimum deuxü courbes. 3- Fidélité La fidélité à un niveau donné correspond à l’étroitesse de l’accord entre les résultats obtenus en appliquant le procédé expérimental à plusieurs reprises dans des conditions déterminées. Selon les conditions d’exécution de l’essai, cette caractéristique s’exprime sous forme de répétabilité et de reproductibilité. Répétabilité Conditions où les résultats d’essais indépendants sont obtenus par la même méthode sur des individus d’essai identiques dans le même laboratoire, par le même opérateur, utilisant le même équipement et pendant un court intervalle de temps. L’objectif est d’obtenir des mesures dans des conditions plus similaires possibles. b- Reproductibilité La reproductibilité à un niveau donné correspond à l’étroitesse de l’accord entre les résultats individuels obtenus dans des conditions de reproductibilité. L’objectif est d’obtenir des mesures dans des conditions ou une ou plusieurs sources de variabilité sont venues interférer. 4-Justesse Etroitesse de l’accord entre la valeur moyenne obtenue à partir d’une série de résultats d’essais et une valeur de référence acceptée. Elle indique sur quel point la concentration observée approche la valeur réelle elle est exprimée en valeur absolue. 5- Limite de détection La limite de détection d’une méthode est la plus basse concentration pour un composé analysé dans une matrice réelle qui, lorsqu’il subit toutes les étapes d’une méthode complète, incluant les extractions chimiques et le prétraitement, produit un signal détectable avec une fiabilité définie statistiquement différent de celui produit par un « blanc » dans les mêmes conditions. Pour l’estimer on peut calculer la concentration équivalente à 3 fois l’écart type d’un étalon à bas niveau dans un solvant approprié. LD = 3S 6- Limite de quantification La limite de quantification d’une méthode est la concentration minimale qui peut être quantifiée à l’aide d’une méthode d’analyse avec une fiabilité définie. C’est la concentration équivalente à 10 fois l’écart type obtenu lors de l’établissement de la LD. LQ = 10*S II-3-Description du spectromètre UV type ‘’JASCO 530‘’ La spectrophotométrie utilise le photomètre permettant de mesurer l’intensité d’un faisceau de lumière en fonction de sa couleur (longueur d’onde) connu sous le nom des spectrophotomètres. Un certain nombre de méthodes quantitatives décrites font appel à la spectrophotométrie dans l’Ultra Violet (UV : 200-400 nm) ou le Visible (400-800 nm). Le spectrophotomètre peut être à simple faisceau ou à double faisceau. Dans un instrument à simple faisceau, le rayonnement provenant de la source lumineuse passe dans un monochromateur puis traverse la cuve contenant l’échantillon avant d’atteindre le détecteur. Dans un instrument à double faisceau, le rayonnement lumineux sortant du monochromateur passe par un dispositif qui le divise en deux faisceaux, dont l’un traverse la cuve contenant l’échantillon et l’autre traverse la deuxième cuve contenant la substance de référence, avant d’atteindre le détecteur. – La loi de Béer-Lambert Le procédé le plus souvent utilisé de manière quantitative pour déterminer les concentrations d’une espèce d’absorption en solution, en utilisant cette loi : , avec : A : la mesure d’absorbance,· I0 : l’intensité de la lumière incidente à une longueur d’onde donnée,· I : l’intensité transmise,· ε : constante connue sous le nom absorptivité molaire ou coefficient d’extinction,· c :la concentration des espèces absorbantes,· L : la longueur du chemin à travers l’échantillon.· – Principe de l’absorption UV En spectrophotométrie, nous mesurons, grâce aux propriétés physico-chimiques, l’absorbance des échantillons (solutions, gaz…). Lorsqu’un rayon de lumière polychromatique comme la lumière blanche d’une ampoule traverse l’échantillon, celui-ci va absorber une partie des radiations et de ce fait résulte la couleur telle que nous l’observons à l’œil nu. Au sein du spectrophotomètre, où l’enceinte est isolée de toute source lumineuse indésirable .
Composition et Usage traditionnels de la plante :
Toutes les parties de la plante renferment les principes toxiques, principalement la racine, et en décroissance, la tige, les bractées, la fleur, la graine et la feuille. Les parties Aériennes sont les moins toxiques. La partie la plus toxique est la racine, a l’état frais. Le latex, qui compose la glu, est un véritable chewing-gum, « El eulk », mâché par les enfants. Les composants responsables de la toxicité sont les deux glycosides: l’atractyloside et le carboxyatractylatoside. C’est à ce dernier que l’on attribue la forte toxicité de la plante fraiche. L’atractyloside (ATR), encore appelé atractylate de potassium ou atractyline, est un hétéroside complexe (figure 4), qui libère par hydrolyse acide une molécule de D-glucose, une molécule d’acide iso valérianique. Ce composé a été isolé pour la première fois des racines d’Atractylis gummifera L. par Lefranc en 1868. Quand à la carboxyatractyloside (gummiferine), elle a été isolée pour la première fois en 1964 (Stanislas et vignais, 1964) et identifiée ensuite en 4-carboxyatractyloside. Il diffère d’ATR par la présence d’un second groupement carboxylique en position C- Le CATR est présent dans la racine fraiche mais pas dans la racine sèche ; c’est une décarboxylation de CATR en ATR qui se produit lors du sèchement ou du vieillissement des racines d’Atractylis gummifera L. I-3-b-Usage de la plante Les enquêtes ethnobotaniques ne révèlent pas d’usage avéré de l’ « addad » et les Racines séchées se trouvent parfois sur les étals des herboristes qui proposent le Latex desséché, cependant, on peut s’en procurer en insistant. Alors qu’il reste très utilisé en Algérie et au Maroc. En usage interne : la racine desséchée est utilisée, après cuisson prolongée dans l’eau,· pour arrêter les hémorragies, faciliter les accouchements, provoquer les vomissements (6). En usage externe : la plante semble intervenir, en friction ou en cataplasmes, dans le· traitement de la gale, des taches de rousseur sur le visage, des boutons d’acné, des chancres syphilitiques, des abcès et des furoncles. La décoction était autrefois utilisée en bain de bouche pour blanchir les dents et reste toujours utilisée pour les soins de la chevelure (6). En fumigation: on l’emploie dans le traitement des rhumes, des vertiges, des céphalées· et des paralysies. Les femmes enceintes qui respirent de la fumée du chardon à glu brulé, voient leur accouchement facilité. Ces fumigations, le plus souvent de la racine, sont également utilisées pour détruire les mouches (6). I-4-mode d’action ou physiopathologie de l’intoxication Les deux glycosides inhibent Le transport des nucléotides phosphoryles ADP et ATP à travers la membrane mitochondriale interne, ce qui empêche la phosphorylation oxydative. L’action de l’atractyloside se situe au niveau de l’adénine nucléotide translocase ou ADP/ATP translocase. Cette enzyme est chargée du transfert de l’ADP dans la matrice mitochondriale. L’atractyloside, en raison de son analogie structurale avec I’ADP, entre en compétition avec ce dernier et se fixe sur la translocase, l’empêchant de pénétrer dans la matrice mitochondriale et, par suite, d’être transformé en ATP (7). Lorsque l’atractyloside se fixe à la translocase, ni l’ADP ni l’ATP ne peuvent s’y lier, empêchant ce dernier de sortir de la matrice mitochondriale. L’affinité du carboxy atractyloside pour le transporteur, qu’il inhibe de façon non compétitive, est supérieure à celle de l’atractyloside; ceci s’explique par les interactions qu’établissent le groupe carboxylique supplémentaire avec les acides aminés proches du site de fixation. Ces toxiques sont des inhibiteurs de la chaine respiratoire mitochondriale (figure 5); en effet, l’inhibition de la seule translocase par l’un de ces toxiques entraine l’inhibition de toute la chaine respiratoire. L’atractyloside et le carboxyatractyloside sont, d’ ailleurs, utilisés comme inhibiteurs spécifiques de l’adénine nucléotide translocase dans les études du transport mitochondrial de l’ADP et l’ATP .L’atractyloside facilite la perméabilisation cellulaire. Les effets cytotoxiques de l’atractyloside, in vivo et in vitro, sont dus à sa capacité d’induire l’ouverture du pore de transition de perméabilité et par conséquent la perméabilisations de la membrane mitochondriale. Les cellules les plus vulnérables sont celles du foie, du rein, du pancréas et du myocarde. L’action des deux glycosides entraine l’augmentation de la consommation du glucose, l’épuisement du stock hépatique et musculaire en glycogène et l’inhibition de la glycogénogenèse (8 ; 9 ; 10).
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Table des matières
Présentation générale du laboratoire
Remerciements
Introduction
I- Le chardon à glu
I-1 Description botanique
I-2 Répartition géographique
I-3 Composition et Usage traditionnels de la plante
I-4 Mode d’action
I-5Les symptômes de l’action toxique
I-6 Traitement
II- Validation analytique du dosage de CAT par spectrophotomètre UV
II-1 Définition et objectif de la validation
II-2 Les critères de validation
II-3 description de spectrophotomètre UV (jasco 530)
III- Matériel et méthodes
1- Matériel
2- Mode opératoire
2-1 Préparation de la solution mère
2-2 Dosage du CAT
IV- Résultats
V – Conclusion
Références bibliographiqu
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