Valeurs moyennes de la vitamine B12 de la population d’étude

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Intérêts dans le pronostic et le suivi thérapeutique

L’étude comparative des valeurs usuelles des populations saines et des valeurs des populations malades permet de classer les examens suivant leur pouvoir discriminant.
Les valeurs usuelles permettent également d’évaluer l’effet thérapeutique, et/ou de surveiller un risque dû à la prise de médicaments. On peut ainsi évaluer la position d’une mesure isolée par rapport aux limites de distribution d’une population saine ou sous la même thérapeutique et en tirer des conclusions quant à la suite du traitement (le poursuivre ou le modifier) [5].

Intérêts en épidémiologie

L’établissement des valeurs de référence permet de mesurer la prévalence de certaines pathologies dans une population à un échelon régional, national ou international. Pour cela il est souhaitable que l’influence des variations biologiques soit réduite au minimum.
Une autre application épidémiologique est la comparaison des valeurs observées sur des populations très différentes. On peut ainsi étudier des différences ethniques, de régime alimentaire, de régime socioculturel ou génétique.
On peut également suivre l’évolution à long terme des conditions de santé d’une population. De même les conditions de transmissibilité des valeurs de référence d’un laboratoire à l’autre, ou d’un pays à l’autre, pourront être précisées.
En somme, les intérêts multiples des valeurs de référence dans notre contexte justifient le bien fondé de notre travail [5].

GENERALITES SUR LA VITAMINE B12

Définition

La vitamine B12 est une vitamine hydrosoluble résistante à la chaleur, mais sensible à l’humidité. Elle est stockée en grande quantité par le corps, dans le foie, ce qui permet de disposer de plusieurs années de réserves en vitamine B12. Elle existe dans l’organisme sous différentes formes regroupées sous le nom de cobalamines. Les deux formes physiologiquement actives sont la méthylcobalamine et l’adénosylcobalamine. Elles sont instables car facilement oxydables. La vitamine B12 est apportée par l’alimentation. Elle est indispensable à la synthèse de l’ADN ; de fait, une carence entraîne un retentissement important au niveau des tissus à renouvellement rapide, notamment le tissu hématopoïétique.

Physiologie de la vitamine B12

Structure et propriétés [1]

La vitamine B12 est une vitamine hydrosoluble présente dans pratiquement toutes les cellules humaines, sa molécule est considérée comme la plus grosse et la plus complexe de toutes les vitamines B (environ 1335kD).
Le terme «vitamine B12» dans un sens large fait référence à un groupe de composés organiques appelés «corrinoïdes» à cause de la présence d’un noyau de corrine. Ce noyau comporte en son centre un atome de cobalt lié à un nucléotide, le 5,6-diméthylbenzimidazole. La formule empirique de la vitamine B12 est « C63H88CoN14O14P »( Figure 2).
L’activité biologique de la vitamine B12 est essentiellement due aux formes suivantes : la cyanocobalamine (vitamine B12), l’adénosylcobalamine, la méthylcobalamine et la nitrocobalamine qui contiennent respectivement des unités CN, 5’-désoxyadenosine, CH3 et NO2 reliée à l’atome de cobalt.
La méthylcobalamine et l’adénosylcobalamine sont indispensables à deux réactions enzymatiques chez les mammifères: la conversion de l’homocystéine en méthionine par la méthionine synthétase et la conversion de la méthylmalonyl-CoA en succinyl-CoA par la méthylmalonyl-CoA mutase qui constitue une étape importante dans le métabolisme du propionate.
Le cobalt présent au centre du noyau tétrapyrrolique peut se trouver sous différents degrés d’oxydoréduction : trivalent, divalent ou monovalent.
La cobalamine libre est instable à l’extérieur du corps. En conséquence, plusieurs autres dérivés oxydés stables telles que la cyanocobalamine (la plus stable) et l’hydroxycobalamine ont été développés.
Ces formes oxydées sont les plus susceptibles d’interagir avec d’autres molécules voire d’être inactivées par ces dernières. Ainsi l’absorption de protoxyde d’azote lors d’une anesthésie générale peut révéler une maladie de Biermer par inactivation de la Cbl (Cobalamines) par oxydation irréversible du cobalt.
Les réactions biochimiques faisant intervenir les coenzymes de la Cbl sont alors inactivées et les patients ayant une prédisposition à l’AP (Anémie pernicieuse) peuvent développer ainsi la maladie après une anesthésie générale.

Métabolisme [1, 2, 3, 30,]

Apport et besoin

La vitamine B12 est apportée exclusivement par l’alimentation, absente dans les végétaux, elle est apportée par la consommation des produits d’origine animale. Les besoins journaliers étant estimés entre 2 et 5μg par l’Association française de sécurité sanitaire des aliments [AFSSA]. Aux États-Unis, l’apport préconisé par la Food and Drug Administration (FDA) est de 2,4μg par jour chez l’adulte, de 2,6μg lors de la grossesse et de 2,8μg lors de l’allaitement (Figure 2).

Absorption

Les cobalamines alimentaires sont libérées des complexes protéiques par la sécrétion gastrique (HCL et pepsine). Libérée des complexes, la vitamine B12 doit se lier à des R-Protéines salivaires dont elle se libère dans le duodénum sous l’effet des protéases pancréatiques. Elle peut alors s’associer au Facteur Intrinsèque (FI) (glycoprotéine synthétisée par les cellules pariétales du corps et du fundus de l’estomac).
La vitamine B12 liée au FI, protégée des dégradations enzymatiques, est transportée jusqu’à l’iléon terminal. A ce niveau le complexe FI-vit B12 est reconnu par des récepteurs spécifiques (cubulines). La vitamine B12 traverse la muqueuse et arrive dans la circulation portale.
On signale qu’une faible portion de cobalamine libre (de l’ordre de 1 à 3ug) est absorbée le long de l’intestin par diffusion passive ce qui explique la possibilité d’une administration de la vitamine B12 par voie orale lors d’une anémie de Biermer.

Transport

Dans le plasma, trois protéines porteuses, les transcobalamines (TC) véhiculent la vitamine B12. La transcobalamine II est synthétisée par l’hépatocyte et transporte la majorité de la vitamine B12 aux cellules utilisatrices (moelle osseuse). Une fois le complexe TC-Cbl intégré dans ces cellules utilisatrice (par phénomène d’endocytose) la TC subit une digestion lysosomale, alors que les cobalamines intracellulaires sont transformées en forme active : méthylcobalamine et adénosylcobalamine par réduction de l’atome de cobalt de l’état trivalent à l’état divalent puis monovalent.
La synthèse du méthylcobalamine a lieu dans le cytoplasme alors que celle de l’adénosylcobalamine a lieu dans la mitochondrie. Ces formes réduites de la vitamine B12 peuvent alors fixer des radicaux monocarbonés à l’intérieur de la cellule. Les transcobalamines I et III sont synthétisés par le granulocyte neutrophile et véhiculent la vitamine B12 aux organes de réserves (foie), La vitamine B12 excédentaire est excrétée dans la bile. Elle subit un cycle entéro-hépatique avec réabsorption au niveau de l’iléon. L’élimination en générale est double, urinaire et digestive mais aussi de façon minime dans les secrétions biologiques et les desquamations cellulaires.

Réserve [1]

Les réserves de vitamine B12 sont essentiellement hépatiques. Le foie contient environ 1,5 mg de cobalamines. Les besoins sont augmentés lors de la grossesse et de la croissance. En pathologie, toutes les situations d’érythropoïèse accélérées (hémolyse, hémorragie …) entraîneront également une consommation plus importante de vitamine B12.
Dans tous les cas, compte tenu des réserves importantes (2 à 4 ans), une carence en vitamine B12 n’aura de retentissement sur l’hématopoïèse que plusieurs mois ou années après son installation.

Le rôle métabolique de la vitamine B12:

Seules deux formes de cobalamines sont des coenzymes intervenant dans le métabolisme: la 5′ désoxyadénosyl-cobalamine ou l’adenosylcobalamine (AdoCbI) et la méthycobalamine (MeCbl) (Figure 3).
Les réactions où intervient I’AdoCbl semblent très diverses. En fait, elles sont toutes régies par un mécanisme de transfert d’hydrogène. I’AdoCbl se comporte comme un donneur ou un accepteur d’hydrogène. L’exemple le plus connu de transfert intramoléculaire dans le métabolisme de I‘homme est la réaction qui permet l’interconversion intra mitochondriale entre le méthylmalonyI-CoA et le succinyI-CoA. En cas de carence en AdoCbl, il y a augmentation du méthylmalonyI-CoA circulant qui est excrété dans les urines sous forme d’acide méthylmalonique. Une deuxième réaction mise en évidence chez les mammifères, qui met en jeu I’AdoCbl, correspond à l‘isomérisation de la bêta-leucine en présence de la leucine 2,3-aminomutase.
La transformation des ribonucléotides en désoxyribonucleotides peut se faire par transfert intramoléculaire en présence d’AdoCbl, chez Lactobacillus. L’enzyme impliquée est la ribonucleoside-triphosphate réductase. Cette réaction n’a pas encore été démontrée de manière formelle chez l’homme.
La principale réaction qui met en jeu la MeCbt comme coenzyme est la méthylation intracytoplamique de l’homocysteine en méthionine puis en S-adénosylmethionine (SAM). Cette réaction a été démontrée chez les mammifères et en particulier chez l’homme. Elle existe aussi chez les bactéries. La MeCbl est un facteur coenzymatique de la méthyl-transferase. Le transfert du groupement méthyle se fait sous forme d’ion carbonium (CH3+).
Cette réaction permet donc la régénération du tétrahydrofolate (THF) à partir du N5-méthyl tétrahydrofolate (acide folique). Le blocage de cette réaction a deux consequences:
1) le blocage de la régénération de la méthionine qui perturbe le métabolisme des acides aminés soufrés et explique l’excrétion urinaire augmentée d’homocysteine.
2) I’absence de régénération du tétrahydrofolate qui empêche la régénération de N5-méthylène FH4, qui est un coenzyme de la thymidylate synthétase. II y a donc blocage de la conversion de dUMP (déoxyuridylate) en dTMP (thymidylate) et par conséquent blocage de la synthèse de I’ADN, ce phénomène est particulièrement sensible pour les globules rouges.
Parmi les autres rôles métaboliques possibles de la Cbl, il faut citer l’hypothèse de sa participation dans le métabolisme des cyanures chez l’homme. Elle permettrait l’élimination des cyanures au niveau cellulaire par conversion de I’OHCbl en CNCbI. Cette hypothèse aurait le mérite d’expliquer la présence de traces de CNCbl dans le sang circulant. Il faut signaler que Les analogues de la vitamine B12 sont des corrinoides dépourvus d’activité vitaminique. Chez l’homme, les analogues plasmatiques pourraient avoir deux origines: synthèse par les micro-organismes de la flore digestive et/ou produit du catabolisme de la cobalamine.
II est actuellement démontré qu’un certain nombre d’analogues peuvent agir comme inhibiteurs compétitifs de la vitamine B12. Leur présence dans le plasma, de même que leur neurotoxicité, demeurent cependant mal connues [13].

Exploration du métabolisme de la vitamine B12

Dosage de la vitamine B12 circulante.

– Dosage radio-immunologique (technique par compétition) : Consiste à saturer un récepteur de la vitamine B12 (FI purifié de porc, ou transcobalamine) par de la B12* radiomarquée ; le complexe B12*-récepteur est ensuite mélangé à différentes dilutions de sérum : la B12 sérique déplace pour partie la B12* radiomarquée (mesure de la radioactivité du surnageant) [29].
– Technique froide d’électrochimiluminescence (méthode par compétition sur automate). Utilise du FI marqué au ruthénium : la vitamine B12 de l’échantillon entre en compétition avec de la B12 biotinylée sur le FI marqué (plusieurs trousses commercialisées) [10].
Intérêt : L’electrochimiluminescence (ECL) est conçue pour la réalisation des tests immunologiques. Reposant sur cette technologie, le système Elecsys® fournit, en association avec des tests immunologiques bien conçus, spécifiques et sensibles, des résultats fiables. Le développement des dosages immunologiques par ECL se base sur l’utilisation d’un complexe de ruthénium et de tripropylamine (TPA). La réaction de chimiluminescence permettant la détection du complexe de réaction est déclenchée en appliquant une tension électrique à la solution d’échantillon, de sorte a obtenir une réaction contrôlée avec précision. La technologie ECL s’adapte au principe de nombreux dosages immunologiques tout en offrant un niveau de performance supérieur.

Dosage du facteur intrinsèque dans le liquide gastrique.

Par technique isotopique (taux effondré dans la maladie de Biermer)

Recherche de la composante immune [29].

Du fait de la nature auto-immune de la maladie de Biermer, il existe dans le sérum (et dans le  liquide gastrique) des auto-anticorps anti facteur Intrinsèque (FI) :
– de type I (effet inhibiteur de la formation du complexe B12-FI ; leur dosage se fait par radio immunologie en testant l’effet inhibiteur sur le FI),
– de type II, inhibant la fixation du complexe sur les récepteurs iléaux.
Et des anticorps anti cellules pariétales gastriques (anti-estomac) [spécificité imparfaite].
Principe
– Radio-immunologie : ce fut le premier test développé, il consiste à mettre en compétition les éventuels anticorps du patient avec de la vitamine B12 radio-marquée au cobalt 57 vis-à-vis de FI purifié et fixé. ce test ne détecte que les anticorps de type I, il est sensible à la prise récente de vitamine B12 à titre thérapeutique ou diagnostique (test de schiling). la vitamine B12 sérique se fixe sur FI ce que donne des faux positifs.
– ELISA ou immuno-dot : les techniques en compétition ont les mêmes faiblesses que la radio-immunologie. Les techniques classiques en sandwich détectent les 2 types d’anticorps et ne subissent pas l’interférence de la vitamine B12, l’antigène est du FI de porc purifié ou du FI recombinant humain.

Le test de Schilling.

Evalue l’absorption de la B12 radio-marquée : il n’est plus réalisé aujourd’hui (sauf exception). Principe : après injection préalable IM de 1000 μg de B12 froide (saturation des récepteurs pour éviter une absorption non spécifique), on administre per os (2 heures après) 0,5 à 2 μg de B12* radio marquée au 58 Co puis on mesure la radioactivité urinaire des 24 heures.
Résultats :
– Sujet normal : radioactivité urinaire > 10 % de la radioactivité ingérée.
– Sujet carencé en B12 : radioactivité < 3 % de la radioactivité ingérée. Dans ce cas on peut refaire le test en administrant du FI en même temps que la B12* marquée : si l’épreuve se normalise, le déficit en FI est confirmé, et si l’épreuve reste perturbée une malabsorption iléale doit être évoquée (les 2 épreuves peuvent se réaliser simultanément avec 2 isotopes différents du cobalt)

Physiopathologie

les manifestations neurologiques

Plusieurs mécanismes physiopathologiques probablement associés sont actuellement discutés. L’hypothèse biochimique classiquement admise repose sur le blocage des réactions enzymatiques cellulaires dont la vitamine B12 est cofacteur. Ce blocage provoque l’accumulation de substrats neurotoxiques comme le méthyl malonate et l’homocystéine ainsi qu’un déficit en produits de conversions enzymatiques, la méthionine et la tétrahydrofolate. Le déficit en méthionine entraine un défaut de méthylation des gaines de myéline, alors que l’accumulation du méthyl malonate entraine des anomalies de synthèse (nombre anormal de carbones) des acides gras incorporés dans les feuillets de la gaine de myéline. Le déficit en tétrahydrofolate est responsable de la plupart des signes non neurologiques [17].

les manifestations hématologiques :

L’anémie mégaloblastique est une manifestation hématologique classique de la carence en vitamine B12. Dans son expression complète, elle est caractérisée par une anémie macrocytaire franche (VGM élevé), normochrome, arégénérative avec mégaloblastose médullaire (donnant un aspect de « moelle bleue »), une leucopénie et une thrombopénie modérée sont parfois associées. Avec des anomalies caractéristiques sur le frottis sanguin : hématies de grande taille, anisocytose, corps de Jolly, déformations globulaires avec ovalocytes [1,2, 10,].
La vitamine B12 impliquée dans la méthylation de l’homocystéine en méthionine est nécessaire à la régénération du tétrahydrofolate (THF) à partir du N5-méthyl tétrahydrofolate. La carence en Vitamine B12 bloque cette réaction ce qui empêche la régénération de N5-méthylène FH4, qui est un coenzyme de la thymidylate synthétase. II y a donc blocage de la conversion de dUMP (déoxyuridylate) en dTMP (thymidilate) [13].

Autres pathologies

– Dysfonction immunitaire : une augmentation de l’incidence de la tuberculose chez les végétariens, les réponses immunitaire anormales au vaccin anti-pneumocoque chez les sujets âgés qui présente une carence en cobalamine et les anomalies de la population lymphocytaire chez les carencés en vitamine B12 suggèrent un rôle immunitaire de cette vitamine [7].
– D’autre part, les sujets carencés en vitamine B12 présentent également une diminution du taux des lymphocytes totaux et des CD8 et des troubles de l’activité des CD8 killer, qui se corrigent par des doses élevées de methylCbl, ce qui suggère un effet pharmacologique du Cbl dans les dysfonctions immunitaires [19,26].
– Ostéoporose : Les faibles taux sériques de Cbl augmentent le risque d’ostéoporose [9,28].

principe de mesure

– Chimiluminescence flash non enzymatique
– Longue stabilité des réactifs
– Marquage ABEI, stable dans les tampons acide et alcalin

caractéristiques principales

– Cadence maximale jusqu’à 160 test/heure
– Temps pour le premier résultat 17 minutes
– Jusqu’à 25 tubes primaires
– Chargement continu, mode urgence disponible
– Compartiments échantillons réfrigérés avec alimentation électrique indépendante

chargement des réactifs

– Chargement continu
– Technologie RFID pour les informations réactives
– Compartiment réactifs réfrigéré

caractéristiques des réactifs

– Kit intégré, prêt à l’emploi, pas de prétraitement requis
– Kit intégré comprenant les calibrateurs
– Utilisation de particules superparamagnétiques
– Toutes les informations des réactifs stockées dans l’étiquette RFID
– Etiquette RFID intégrant une courbe maitresse
– Stabilité de calibration : maximum 4 semaines

Table des matières

PREMIERE PARTIE
I. CONCEPT DE VALEURS USUELLES
I.1. Définition
I.2. Intérêts des valeurs usuelles
I.2.1. Intérêts dans le diagnostic médical
I.2.2. Intérêts dans le pronostic et le suivi thérapeutique
I.2.3. Intérêts en épidémiologie
II. GENERALITES SUR LA VITAMINE B12
II.1. Définition
II.2. Physiologie de la vitamine B12
II.2.1. Structure et propriétés
II.2.2. Métabolisme
II.2.3. Le rôle métabolique de la vitamine B12:
II.3. Exploration du métabolisme de la vitamine B12
II.3.1. Dosage de la vitamine B12 circulante.
II.3.2. Dosage du facteur intrinsèque dans le liquide gastrique.
II.3.3. Recherche de la composante immune
II.3.4. Le test de Schilling.
II.4. Physiopathologie
II.4.1. les manifestations neurologiques
II.4.2. les manifestations hématologiques
II.4.3. Autres pathologies
DEUXIEME PARTIE
I. OBJECTIFS
II. Type et cadre d’étude
III. Population d’étude
IV. Critères d’inclusion
V. Critères de non inclusion
VI. Recueil et traitements des échantillons
VII. Matériels et méthodes
VII.1. Matériels
VII.2. Appareillage
VII.2.1-principe de mesure
VII.2.2-caractéristiques principales
VII.2.3.-chargement des réactifs
VII.2.4-caractéristiques des réactifs
VII.3 contrôle de qualité interne
VII.4 Procéduredutest.
X. Analyses statistiques
XI. RESULTATS
XI.1 Caractéristiques de la population d’étude
XI.2 Valeurs moyennes de la vitamine B12 de la population d’étude
XI -3 Valeurs usuelles de la vitamine B12 de la population d’étude
X-DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES

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