UTILISATION DES NANOEMULSIONS COMME NANOVECTEURS DANS LA THERANOSTIQUE ANTICANCEREUSE

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Emulsification par ultrasonication

Deux mécanismes interviennent dans l’émulsification par ultrasons. Premièrement, le champ acoustique crée des ondes interfaciales qui permettent à la phase huileuse de se disperser dans la phase continue sous forme de gouttelettes (émulsions directes). Deuxièmement, les ultrasons provoquent une cavitation acoustique qui produit respectivement la formation et l’effondrement des microbulles en raison des fluctuations de pression d’une seule onde sonore. De cette façon, des niveaux énormes de turbulence très localisée sont générés, ce qui provoque des micro-implosions qui perturbent les grosses gouttelettes de taille inférieure ou égale au micron (McClements and Jafari, 2018; Zhang et al., 2011). Ainsi, l’émulsion pré-mélangée est agitée par vibration de la surface solide à des fréquences de plus de 20 kHz. Il existe des appareils à ultrasons de grande puissance tels que les avertisseurs sonores et les sondes pointues qui provoquent un cisaillement et une cavitation extrêmes entraînant la rupture des gouttelettes. Il a été observé que dans la plupart des systèmes à ultrasons, le champ sonore émis est hétérogène. Pour cette raison, pour que toutes les gouttelettes présentent le taux de cisaillement le plus élevé, une recirculation de l’émulsion dans la région de forte puissance doit être assurée. De plus, en effectuant ce type de recirculation plusieurs fois, il est possible d’obtenir des émulsions ayant une taille de gouttelette uniforme à des concentrations diluées (Mason et al., 2006). Le type d’émulsifiant, la quantité d’émulsifiant et la viscosité des phases sont les paramètres les plus critiques qui affectent l’efficacité de l’homogénéisation (Leong et al., 2009; Maa and Hsu, 1999). Ainsi, l’optimisation de ces paramètres est nécessaire pour préparer des NEs ayant de fines gouttelettes. Cependant, les méthodes de sonication suscitent certaines inquiétudes car elles peuvent induire une dénaturation des protéines, une dépolymérisation des polysaccharides et une oxydation des lipides (Jafari et al., 2006; McClements and Rao, 2011).

Microfluidisation

Il est le plus utilisé dans l’industrie pharmaceutique pour acquérir des émulsions fines. Dans cette méthode, un dispositif appelé microfluidiseur qui fournit des pressions élevées est utilisé (Figure 2). Au cours du processus, une pression élevée force l’émulsion à traverser la chambre d’interaction et ainsi, des NEs avec des gouttelettes de dimension nanométrique peuvent être produites. En effet, il y a une collision entre les jets d’émulsion bruts provenant de deux canaux opposés dans la buse du microfluidiseur, également appelée chambre d’interaction. La mobilité de l’émulsion brute est assurée par une pompe à commande pneumatique capable de comprimer l’air jusqu’à des pressions comprises entre 150 et 650 MPa. Cette pression élevée oblige le flux d’émulsion brute à traverser des microcanaux et après la collision de deux canaux opposés, un niveau de force de cisaillement énorme est obtenu. Par conséquent, à l’aide de cette force, des émulsions fines sont produites (Çinar, 2017). La production uniforme de NEs peut être obtenue en répétant le processus plusieurs fois et en faisant varier la pression de fonctionnement afin d’obtenir la taille souhaitée (Chime and Attama, 2014; Jaiswal et al., 2015; McClements and Jafari, 2018).

Méthodes d’émulsification à faible énergie

Nanoémulsification spontanée

Cette technique se déroule en trois étapes :
i. La première consiste à préparer une solution organique homogène pouvant contenir une huile, un agent stabilisant, un solvant miscible à l’eau en différentes proportions.
ii. Cette phase organique est dans un second temps injecté dans une phase aqueuse sous agitation magnétique afin de former une émulsion.
iii. Dans un dernier temps, le solvant est évaporé sous pression réduite pour récupérer l’émulsion (Solans and Solé, 2012).
En effet, lorsqu’une solution organique homogène (phase huileuse, agent stabilisant, solvant miscible à l’eau) est mélangée à une phase aqueuse, des gouttelettes d’huile se forment spontanément. Le mécanisme dépend du mouvement que la substance dispersible dans l’eau effectue de la phase huileuse vers la phase aqueuse. Ceci entraîne une turbulence interfaciale et donc la formation de gouttelettes d’huile spontanées (McClements and Rao, 2011). Cette méthode peut produire des NEs à température ambiante et aucun dispositif spécial n’est requis (Figure 3). Cependant, les conditions expérimentales rapportées dans la littérature afin d’obtenir des gouttelettes dans la gamme nanométrique est liée à l’usage d’un haut ratio solvant / huile (Li et al., 2011). L’émulsification spontanée est essentiellement soumise à la tension interfaciale, à la viscoélasticité de l’interface, à la région de transition de phase, à la structure de l’agent tensioactif et à la concentration en surfactant (Setya et al., 2014). Dans l’industrie pharmaceutique, les systèmes préparés en utilisant cette méthode sont généralement appelés systèmes de délivrance de médicaments auto-émulsifiants (SEDDS) ou systèmes de délivrance de médicaments auto-nano-émulsifiants (SNEDDS) (Çinar, 2017).

Méthodes d’émulsification par inversion de phase

Ces méthodes utilisent l’énergie chimique libérée à cause des transitions de phase pendant le processus d’émulsification (Anandharamakrishnan, 2014). La quantité requise de transitions de phase est obtenue en modifiant la composition à température constante ou en modifiant la température à composition constante (Singh et al., 2017b).

Température d’inversion de phase (TIP ou PIT)

Dans cette méthode, la température est modifiée à composition constante. Les agents tensioactifs non ioniques qui ont une solubilité dépendante de la température comme les agents tensioactifs polyéthoxylés jouent un rôle important. L’émulsification est obtenue en modifiant les affinités des surfactants pour l’eau et l’huile en fonction de la température (Chime and Attama, 2014; Lovelyn and Attama, 2011) (Figure 4).
Pendant le chauffage des tensioactifs polyéthoxylés, ils deviennent lipophiles en raison de la déshydratation des groupes polyoxyéthylène. Par conséquent, cette circonstance établit le principe de la production de NEs par la méthode PIT (Anandharamakrishnan, 2014). Néanmoins, il a été observé que bien que l’émulsification soit spontanée à la température HLB, le taux de coalescence est très rapide et les émulsions sont très instables (Ee et al., 2008). Il a été rapporté que des gouttelettes d’émulsion stables et fines peuvent être produites par refroidissement rapide de l’émulsion près de la température du PIT (Patil and Waghmare, 2013; Tadros et al., 2004).

Composition d’inversion de phase (CIP ou PIC)

L’inversion de phase est effectuée par variation de la composition du système, à température  constante. Les composants (huile ou eau) sont ajoutés progressivement au reste du système (eau et tensioactif ou huile et tensioactif, respectivement). Cette technique est souvent plus utilisée que la précédente car l’addition d’un composé à un grand volume d’émulsion est souvent plus simple que d’opérer un brusque changement de température du système (Gutiérrez et al., 2008; Izquierdo et al., 2002; Sadurní et al., 2005; Solans and Solé, 2012).

Caractérisation des nanoémulsions

Analyse granulométrique

Diffusion dynamique de la lumière (DLS)

Le principe de la DLS repose sur le mouvement brownien des gouttelettes et la diffusion de la lumière par celles-ci. Ainsi, les petites gouttelettes se déplacent plus rapidement que les grosses gouttelettes sous l’effet du mouvement brownien. Les appareils basés sur la DLS projettent un faisceau laser sur l’échantillon. Puis, des dispositifs optiques adaptés mesurent la fluctuation de l’intensité de la lumière diffusée (Tscharnuter, 2000). Le diamètre mesuré par DLS est le diamètre hydrodynamique DH et défini comme le diamètre d’une sphère équivalente qui a le même coefficient de diffusion translationnelle que la gouttelette. Il est donné par l’équation de Stokes-Einstein (Bizmark et al., 2014):
Où ηc est la viscosité de la phase continue (Pa.s), D est le coefficient de diffusion translationnelle (m2.s -1), kB est la constante de Boltzmann (J.K-1) et T est la température absolue (K).
Deux théories peuvent être utilisées pour l’interprétation de la diffusion de la lumière :
 La première est la théorie de Rayleigh qui est appliquée pour des tailles de particules plus petites que la longueur d’onde de la lumière utilisée (λ) (typiquement DH < λ/10, λ = 633 nm pour le laser hélium-néon actuellement utilisé dans certains appareils). Les gouttelettes de cette taille diffusent la lumière de façon isotrope, c’est-à-dire que la lumière diffuse avec la même intensité dans toutes les directions. Cette intensité est proportionnelle à DH6 et à 1/ λ4.
 La deuxième est la théorie de Mie. Celle-ci suggère que pour les tailles des gouttelettes λ > DH > λ/10, la diffusion devient anisotrope (dépendante de la direction), et quand DH ≥ λ l’intensité de la lumière diffusée montre un minimum et un maximum de diffusion.
La DLS permet également de calculer le PDI de la distribution de taille. Cependant, quand la distribution de taille est bimodale ou polymodale, l’interprétation de la diffusion de la lumière devient compliquée et les résultats deviennent moins représentatifs (Benita and Levy, 1993; Jamting et al., 2011).

Microscopie

La microscopie peut être utilisée comme technique d’imagerie directe pour les NEs. En plus de fournir des informations importantes sur la morphologie et la structure des NEs, les techniques de microscopie peuvent également fournir des informations précieuses sur leur taille. Elles sont souvent utilisées en complément d’autres techniques de dimensionnement (Hosseini et al., 2015). Différentes techniques de microscopie sont disponibles, les plus couramment utilisées pour analyser les NEs étant la microscopie électronique (Li et al., 2017), la microscopie confocale à balayage laser (LSCM) (Su and Zhong, 2016) et la microscopie à force atomique (AFM) (Ghasemi et al., 2018). Ces techniques ont généralement une meilleure résolution et sont plus sensibles que la microscopie optique conventionnelle.

Charge de surface des nano-gouttelettes

Les gouttelettes d’une NE possèdent généralement une charge électrique à cause de l’adsorption de surfactants ioniques, de nanoparticules solides, d’ions minéraux ou de biopolymères à leur surface. La charge des gouttelettes joue un rôle important dans la stabilité des NEs et leur adhésion sur les membranes biologiques lors d’une application thérapeutique (McClements, 2011b). La charge de gouttelettes est reflétée par le potentiel au plan du cisaillement (ou potentiel Zêta) (Figure 5).
La méthode la plus répandue, pour la mesure du potentiel Zêta, est basée sur la mesure de la mobilité électrophorétique (UE) des particules. Dans cette méthode, l’échantillon est soumis à un champ électrique. Les gouttelettes vont alors se déplacer avec une vitesse qui dépend du champ électrique appliqué, de la constante diélectrique (εr), de la viscosité de la phase continue (ηc) et du potentiel Zêta (ζ). L’équation de Henry permet de calculer le potentiel Zêta à partir de la mobilité électrophorétique : ζ où est f(Ka) est la fonction d’Henry qui dépend du rapport du rayon de la goutte et de l’épaisseur de la double couche électrique (Ali, 2016).

Propriétés physicochimiques des nanoémulsions

Les caractéristiques physico-chimiques des NEs, telles que leurs propriétés optiques et rhéologiques, jouent un rôle majeur dans la détermination de leur aptitude à des applications particulières. Les propriétés optiques et rhéologiques des NEs sont principalement déterminées par leur composition et leur structure.

Propriétés optiques

Les propriétés optiques des NEs dépendent à la fois de la manière dont la lumière est diffusée et des effets d’absorption (Mason et al., 2006; McClements, 2002; Michels et al., 2008). La turbidité ou l’opacité d’une nanoémulsion dépend du profil de diffusion de la lumière, qui dépend de la concentration, de la taille et du contraste de l’indice de réfraction des gouttelettes. La couleur d’une nanoémulsion dépend de la présence de tout chromophore qui absorbe sélectivement la lumière à des longueurs d’onde particulières, et la présence de gouttelettes diffusant la lumière différemment à différentes longueurs d’onde. La diffusion de la lumière par des gouttelettes est généralement très faible lorsque leurs dimensions sont beaucoup plus petites que la longueur d’onde de la lumière, ce qui conduit à un système optiquement clair (Figure 6).

Propriétés rhéologiques et viscosité des nanoémulsions

Propriétés rhéologiques

La rhéologie est la discipline scientifique qui traite de la déformation et de l’écoulement de la matière (Mehrnia et al., 2017; Rao, 2013). La rhéologie d’une nanoémulsion déterminera sa capacité à traverser un tuyau, l’efficacité des processus de mélange et ses attributs sensoriels (tels que la douceur, l’onctuosité ou la sensation en bouche). Les propriétés rhéologiques des NEs peuvent varier considérablement en fonction de leur composition, de leurs interactions et de leur structure, allant des liquides à faible viscosité aux matériaux semi-solides (Berli et al., 2005; Genovese et al., 2007). Les propriétés rhéologiques d’une NE sont caractérisées par la mesure de la relation entre la contrainte de cisaillement appliquée et la vitesse résultante de la contrainte de cisaillement (liquides ou solides). Les paramètres les plus couramment mesurés sur les NEs sont généralement la viscosité apparente du cisaillement (η) ou le module de cisaillement dynamique (G), mais d’autres paramètres peuvent être plus importants pour certaines applications (Mehrnia et al., 2017). Les mesures des propriétés rhéologiques des NEs peuvent fournir des informations précieuses sur l’organisation structurelle et les interactions des gouttelettes qu’elles contiennent (Quemada and Berli, 2002; Tadros, 2011). Les facteurs les plus importants qui déterminent la rhéologie des NEs sont les interactions entre la viscosité de la phase continue, la concentration en gouttelettes et la taille des gouttelettes (McClements and Jafari, 2018).

Viscosité

Nanoémulsion diluée et nanoémulsion concentrée

Dans les NEs diluées ( <5%), les gouttelettes peuvent être considérées comme agissant indépendamment les unes des autres, c’est-à-dire que le profil d’écoulement autour d’une gouttelette n’a pas d’impact sur le profil d’écoulement autour d’une autre gouttelette. En première approximation, la viscosité d’une nanoémulsion diluée peut être décrite par l’expression de Albert Einstein (Hunter, 2001):
Ici, η est la viscosité de la nanoémulsion, η0 est la viscosité de la phase continue, et est la fraction volumique de la phase dispersée. Cette équation prédit que la viscosité d’une nanoémulsion diluée devrait augmenter linéairement à mesure que la concentration des gouttelettes augmente. Cependant, lorsque dépasse environ 5%, les gouttelettes commencent à interagir par des interactions hydrodynamiques et colloïdales qui peuvent avoir un impact marqué sur la viscosité de cisaillement (Tadros, 2011). Dans ces circonstances, la viscosité de cisaillement est généralement nettement supérieure à celle prédite par l’équation d’Einstein en fonction de la nature des interactions colloïdales entre les gouttelettes (Figure 7).

Phénomènes d’instabilité des NEs

Une nanoémulsion est instable thermodynamiquement. La stabilité des nanoémulsions ne peut être atteinte que si le formulateur est capable de ralentir ou d’inhiber les mécanismes physiques qui conduisent normalement à la démixtion des phases non miscibles (BROCHETTE, 2013). Ces mécanismes sont explicités ci-dessous.

Sédimentation et crémage

La sédimentation et le crémage sont le résultat d’un même phénomène, dont le moteur est la pesanteur. Parce que le système est nécessairement en équilibre cinétique, une gouttelette de phase dispersée est animée d’un mouvement brownien induit par les molécules de solvant, la quantité de mouvement étant conservée lors des chocs solvant/particules. Ainsi la même gouttelette est soumise au champ de pesanteur terrestre, qui tend à imposer un mouvement vers le bas si la gouttelette est plus dense que la phase continue ou vers le haut dans le cas contraire (BROCHETTE, 2013). Cette compétition entre agitation brownienne et pesanteur aboutit à une inhomogénéité de nanoémulsion laissée sans agitation.
Considérons le cas d’une nanoémulsion eau dans huile laissée au repos ; la concentration en gouttelettes risque de diminuer avec la hauteur à la manière d’une exponentielle décroissante. Si le volume v des gouttelettes est important, la majorité des gouttelettes sera rassemblée au bas du tube de stockage, et l’on pourra alors observer un culot de sédimentation (BROCHETTE, 2013). Si l’on avait considéré une émulsion huile dans eau, la loi de distribution serait identique, mais l’on observerait une accumulation de gouttelettes dans la partie supérieure du tube de stockage : on parle alors de crémage (Abend and Lagaly, 2001; Begbeg, 2008; BROCHETTE, 2013; Langevin et al., 2004; Robins, 2000; Thieme et al., 1999; Torres et al., 2008). Cependant, ces phénomènes sont rarement observés avec les nanoémulsions.
La sédimentation ou le crémage des gouttelettes émulsionnées aboutit à une perte d’homogénéité évidente à l’œil nu. La vitesse du processus est donnée par la loi de Stokes (BRIANT, 1989; Hamoudi, 2012; Langevin et al., 2004) :
v = vitesse de sédimentation (m/s)
r = rayon des gouttelettes (μm)
g = accélération due à la pesanteur terrestre (m/s2) (g = 9,807 m/s2)
D1 ; D2 = densités respectives de la phase dispersée et de la phase continue = viscosité de la phase continue en centpoise (cPo)

Floculation

Quelquefois les gouttelettes formées ne restent pas indépendantes les unes des autres, mais tendent à se regrouper pour former des grappes. Ce phénomène, appelé floculation est souvent précurseur de la sédimentation des grappes ainsi formées (BRIANT, 1989). La floculation a pour origine une adhésivité des gouttelettes, dont l’origine est une compétition entre agitation thermique et forces de Van der Waals (BROCHETTE, 2013). Les gouttelettes d’une nanoémulsion sont en effet animées d’un mouvement brownien, qui induit des chocs entre gouttelettes. Si une interaction attractive suffisante existe entre les gouttelettes ainsi mises en contact, elles restent associées. Afin de comprendre, puis de contrôler la floculation des nanoémulsions, il est nécessaire de connaitre la théorie de base sur laquelle elle est fondée. Les nanoémulsions étant des dispersions liquides, on peut considérer que la théorie DLVO des émulsions colloïdales hydrophiles leur est applicable. En tenant compte de l’influence des couches interfaciales susceptibles de modifier cette théorie, cette approche peut être utilisée semi-quantitativement, mais aucune théorie ne peut prédire la stabilité des émulsions à long terme. Les raisons en sont nombreuses, notamment (BRIANT, 1989):
 l’hétérogénéité de la distribution de la taille des particules et les variations de cette distribution avec la coalescence ;
 la mobilité des émulsions à la fois par passage latéral au point de contact de deux particules et par diffusion à travers la couche interfaciale vers la phase aqueuse ou vers la phase huileuse ;
 les modifications de l’émulsion due au mûrissement ;
 la nécessite d’avoir une barrière mécanique.

Coalescence

La floculation, la sédimentation et le crémage sont des phénomènes réversibles (une agitation faible permet la « redispersion »). Tel n’est pas le cas de la coalescence, qui est le phénomène de dégradation ultime des nanoémulsions (BROCHETTE, 2013).
Ce mécanisme irréversible fait suite au rapprochement de deux ou plusieurs globules, puis à l’amincissement suivi de la rupture du film mince de phase continue située entre les gouttelettes (Begbeg, 2008; Cheng and Velankar, 2009; Langevin et al., 2004; Rondon Anton, 2006; Tcholakova et al., 2008).

Mûrissement d’Ostwald

Le mûrissement d’Ostwald dépend d’une part de la granulométrie et d’autre part de la surpression de Laplace (BRIANT, 1989; BROCHETTE, 2013).
À l’issue de l’étape d’émulsification, la population de gouttelettes n’est pas homogène en taille. On observe généralement une granulométrie se rapprochant d’une distribution log-normale (Rojas and Patricia, 2007). Il existe un flux de matière des petites gouttelettes vers les grosses gouttelettes, au travers de la phase continue. Les petites gouttelettes se vident au profit des grosses, et la granulométrie se modifie puisque les classes de faibles tailles disparaissent. Ce phénomène irréversible constitue le mûrissement d’Ostwald (Galenica., 1983; Langevin et al., 2004; Thieme et al., 1999; Xu et al., 2005).

Inversion de phase

Pour certains auteurs, l’inversion de phase est un phénomène de dégradation de la nanoémulsion. Cette analyse est correcte si l’on considère qu’au cours de l’inversion, la phase continue de la nanoémulsion devient la phase dispersée et inversement, et que les propriétés du milieu diphasique s’en trouvent bouleversées. D’autre part les études récentes qui sont le fruit d’un demi-siècle de recherche, laissent entrevoir que les phénomènes à prendre en compte sont différents de ceux décrits par les études précédentes. A travers l’inversion, on peut en effet obtenir des nanoémulsions avec des caractéristiques particulières (par exemple, une très faible taille des gouttelettes) dans des conditions complètement différentes de celles décrites par les recherches portant sur l’émulsification directe (Rondón González, 2007).
L’inversion de phase peut être produite soit par :
 le changement d’une variable de formulation, comme la température, la salinité (les surfactifs ioniques) ou encore le surfactif,
 le changement d’une variable de composition, comme la fraction de la phase aqueuse ou la concentration du surfactif ou d’alcool utilisée.
Le premier type d’inversion est défini comme transitionnel, tandis que le deuxième est dit catastrophique (Rondón-González et al., 2007).
Les différents phénomènes d’instabilité sont représentés sur la figure 9.

Table des matières

INTRODUCTION
CHAPITRE I : GENERALITES SUR LES NANOEMULSIONS (NEs) 
I. Méthodes de formulation et de caractérisation des nanoémulsions
I.1. Méthodes de formulation
I.1.1. Méthodes d’émulsification à haute énergie
I.1.1.1. Homogénéisation à haute pression
I.1.1.2. Emulsification par ultrasonication
I.1.1.3. Microfluidisation
I.1.2. Méthodes d’émulsification à faible énergie
I.1.2.1. Nanoémulsification spontanée
I.1.2.2. Méthodes d’émulsification par inversion de phase
I.1.2.1.1 Température d’inversion de phase (TIP ou PIT)
I.1.2.1.1 Composition d’inversion de phase (CIP ou PIC)
I.2. Caractérisation des nanoémulsions
I.2.1. Analyse granulométrique
I.2.1.1. Diffusion dynamique de la lumière (DLS)
I.2.1.2. Microscopie
I.2.2. Charge de surface des nano-gouttelettes
II. Propriétés physicochimiques des nanoémulsions
II.1. Propriétés optiques
II.2. Propriétés rhéologiques et viscosité des nanoémulsions
II.2.1. Propriétés rhéologiques
II.2.2. Viscosité
II.2.2.1. Nanoémulsion diluée et nanoémulsion concentrée
II.2.2.2. Nanoémulsion et émulsion
III. Phénomènes d’instabilité des NEs
III.1. Sédimentation et crémage
III.2. Floculation
III.3. Coalescence
III.4. Mûrissement d’Ostwald
III.5. Inversion de phase
CHAPITRE II : NANOVECTEURS ET CIBLAGE THERAPEUTIQUE 
I. Nanovecteurs
I.1. Les différentes classes de nanovecteurs
I.1.1. Les nanovecteurs de première génération
I.1.2. Les nanovecteurs de deuxième génération
I.1.3. Les nanovecteurs de troisième génération
I.2. Propriétés des nanovecteurs
I.2.1. Le système réticulo-endothélial
I.2.2. Le système rénal
I.2.3. La barrière hémato-encéphalique
II. Techniques de ciblage thérapeutique
II.1. Ciblage passif
II.2. Ciblage actif
CHAPITRE III : UTILISATION DES NANOEMULSIONS COMME NANOVECTEURS DANS LA THERANOSTIQUE ANTICANCEREUSE
I. Rappels sur le cancer
II. Apport des nanotechnologies dans la théranostique anticancéreuse
II.1. Utilisation thérapeutique des NEs
II.1.1. Utilisation de nanoémulsions comme inhibiteurs de l’angiogenèse
II.1.2. Utilisation de nanoémulsions pour une bithérapie pH-dépendante
II.2. Intérêt des NEs en théranostique anticancéreuse
CONCLUSION
REFERENCES

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