Soutenance mémoire
Une brève histoire de la microbiologie
Durant une longue période, l’existence même des micro-organismes fut ignorée de l’Humanité. Les premières suppositions de l’existence de microbes furent avancées au XVIème siècle et portées par Girolamo Fracastoro (1483-1553), mais sans preuves concrètes. Il fallut attendre pour les “découvrir” la mise au point d’outils optiques performants dus à l’ingéniosité de plusieurs hommes de sciences. Ces observations commencèrent dans la deuxième moitié du XVIIème siècle et furent effectuées la première fois par Antoni Van Leeuwenhoek (1632-1723), un prospère drapier danois et scientifique autodidacte (Meunier et al., 2016). Robert Hooke (1635- 1703) confirma ces observations (Howard, 2005), et la Royal Society britannique puis l’Académie des sciences française les adoptèrent. Ces observations mirent à bas les théories qui étaient alors communément admises sur la génération spontanée des organismes soutenues par William Harvey (1578-1657) ou Reinier de Graaf (1641-1673), et combattues par Francesco Redi (1626- 1697) et Jan Swammerdam (1637-1680) à propos des insectes et a fortiori du vivant dans sa globalité.
Cependant, il fallut attendre le XVIIIème siècle pour qu’une terminologie moderne apparaisse avec le mot « bactérie » par Christian Gottfried Ehrenberg (1795-1876), qui entreprit une étude et une description systématique des micro-organismes (EHRENBERG, 1838), et le mot « germe » par Jakob Henle (1809-1885) pour parler des micro-organismes pathogènes . Le développement des techniques de ce siècle permit le premier essor de la microbiologie en tant que science à part entière. Ainsi, Louis Pasteur (1822-1895) démontre que les « levures lactiques », maintenant connues comme lactobacilles, étaient capables de fermentation, et que certains micro-organismes pouvaient se développer sans apport d’oxygène. Il les définit comme « anaérobies ». Il développa à cette occasion les « cultures pures » développant grandement les possibilités d’études des micro-organismes. Il mit au point plus tard les premières vaccinations qui furent une grande avancée pour la santé publique, bien que ne comprenant pas l’ensemble des mécanismes exacts de la vaccination (Meunier et al., 2016). En parallèle des travaux de Louis Pasteur, Robert Koch (1843-1910) participe à mettre au point la compréhension des différents cycles de vie des bactéries et met en place des moyens de coloration et de culture pour les bactéries. Il développe aussi « Les postulats de Koch » permettant de lier une maladie à un germe spécifique (Carter, 1985; Meunier et al., 2016). D’autres parts, des travaux de la communauté scientifique apparaissent aussi pour mettre en évidence les liens bénéfiques des bactéries avec le vivant, comme les interactions entre différentes souches bactériennes pour se développer plus vite mises en avant par Sergei Winograsky (1856-1953), ou comme le système symbiotique bactérie plante démontré par Martinus Beijerinck (1851-1931). Ces travaux ouvrirent la voie à l’écologie microbienne. C’est aussi à cette époque, que Martinus Beijerinck a démontré l’existence de germes plus petits que les bactéries, les virus (Lustig & Levine, 1992).
La microbiologie est née, sur la base des études des maladies infectieuses, et surtout bactériennes. Mais ces recherches, précédemment exposées, étaient empiriques et basées quasiment exclusivement sur l’observation. Il faudra attendre le développement de la biochimie et la découverte dans les années 1950 de l’ADN par James Watson (1928-), Francis Crick (1916- 2004) et Rosalind Franklin (1920-1958) (Franklin & Gosling, 1953a, 1953b; Watson & Crick, 1953), suivie par la naissance de la biologie moléculaire pour qu’émerge une nouvelle période dans la compréhension des mécanismes des systèmes microbiens (Meunier et al., 2016). La biologie moléculaire ainsi que la biochimie permirent de caractériser pleinement les différents métabolismes et leurs différentes voies de régulation, aussi bien chez les procaryotes que chez les eucaryotes, puis de perfectionner les méthodes d’étude sur des souches modèles de laboratoire. Cette caractérisation des métabolismes des micro-organismes montra l’ampleur de la diversité du vivant. Dans les années 1970, Carl Woese (1928-2012) et George E. Fox (1945-) se basant sur l’analyse génétique et les observations phénotypiques décrivent alors le vivant, non plus séparé entre procaryotes et eucaryotes, mais en trois domaines : Bacteria, Eukarya et Archaea (Woese & Fox, 1977).
Au début des années 1990, certains microbiologistes recommencèrent à s’intéresser aux développements plus naturels des micro-organismes, passant des cultures liquides optimisées aux cultures aux interfaces air-liquide et solide-liquide, ainsi qu’en passant d’études monoespèces à des études de communautés multi-espèces, plus représentatives des conditions de croissance naturelle. Comme le disait Carl Woese en 2005 : « I see the question of biological organization taking two prominent directions today. The first is the evolution of (proteinaceous) cellular organization, […] The second major direction involves the nature of the global ecosystem. This is both a very practical and a very basic problem, involving biological organization on a level over and above the cellular/organismal. Bacteria are the major organisms on this planet — in numbers, in total mass, in importance to the global balances. Thus, it is microbial ecology that matters most […] and it is microbial ecology that is most in need of development, both in terms of facts needed to understand it, and in terms of the framework in which to interpret them. ». (Woese, 2005 ) .
Les bactéries
Les bactéries, pilier de la biosphère
De nos jours, les bactéries appartiennent à l’un des trois grands domaines du vivant : les Eubacteria. Ce sont des cellules uniques sans noyaux dont la taille varie grandement d’une espèce à l’autre, mais qui est en général comprise entre 0.5µm et 5µm. Les estimations les plus récentes évaluent que les bactéries représentent près de 95 % de la biomasse totale de la biosphère terrestre (Hans Curt Flemming & Wuertz, 2019; Muller & Nebe-von-Caron, 2010; Whitman, Coleman, & Wiebe, 1998). Les bactéries sont des espèces clés dans la biosphère, et pas seulement en considérant leur quantité. Il apparaît que les bactéries sont une pierre angulaire du cycle du carbone (Crapart et al., 2007; Goffredi, Warén, Orphan, Van Dover, & Vrijenhoek, 2004; Hügler, Wirsen, Fuchs, Taylor, & Sievert, 2005; Takai et al., 2005) car elles participent grandement dans les océans à la fixation du carbone dans des structures les entourant, et formant des concrétions macroscopiques (Bosak, Greene, & Newman, 2007; Walker, Spear, & Pace, 2005). Elles jouent aussi un rôle important dans l’oxygénation des océans et de l’atmosphère de notre planète. En effet, les bactéries ont été les premiers organismes à effectuer de la photosynthèse enrichissant et augmentant la concentration en dioxygène de la surface terrestre (Martin, Bryant, & Beatty, 2018; Robert E. Blankenship and Martin F. Hohmann Marriott, 2011; Woodward W. Fischer, James Hemp, 2016; Xiong & Bauer, 2002). De plus, il semblerait aussi que les bactéries jouent un rôle dans le cycle de l’eau, via les bactéries stratosphériques se développant en altitude dans les nuages. En effet, ces bactéries sécrètent des protéines qui changent la microtension de surface de l’eau, augmentant la cohésion des gouttes d’eau qui forment les nuages (Amato et al., 2015; Bauer et al., 2003; DeLeon-Rodriguez et al., 2013; O. Möhler, P. J. DeMott, G. Vali, 2007). L’étude des bactéries semble donc primordiale à la bonne compréhension de notre planète. Mais comment se développent-elles ? Elles le font de deux façons. La première est la croissance en condition planctonique, c’est à dire en milieu liquide, généralement à l’état de cellules uniques cohabitant dans un même environnement. Cette première voie de développement est la plus étudiée depuis le début de la microbiologie moderne, car elle permet de contrôler aisément la composition du milieu dans lequel les bactéries croissent, de bien sélectionner les espèces, de les faire pousser de manière optimisée et reproductible. Mais cette façon de se développer ne semble représenter qu’une petite partie du cycle de vie des bactéries (L Hall-Stoodley, Costerton, & Stoodley, 2004; Kolter & Greenberg, 2006), et non celle privilégiée pour la croissance, dans la nature, mais plutôt celle de la recherche d’un milieu adéquat à la prolifération. Le second mode de développement, qui semble majoritaire pour les bactéries, est la croissance en communauté aux interfaces — air-liquide, solide-air ou solide-liquide. Ces communautés sont appelées ‘Biofilms’. Ce second mode de prolifération est, dans la nature, largement multi-espèces, mêlant bien souvent plusieurs bactéries, archées et/ou eucaryotes, et créant une grande complexité des écosystèmes, où émergent interactions, interdépendances et compétitions.
Quelques exemples de biofilms
Biofilms naturels
Les biofilms sont présents dans toutes les niches de la biosphère. Des océans aux nuages, des rochers aux organismes pluricellulaires aussi bien végétal et animal que fongi (Hans Curt Flemming & Wuertz, 2019). La première niche d’importance où ils se sont développés est les océans (Guillonneau, Baraquet, Bazire, & Molmeret, 2018). On trouve aujourd’hui des biofilms sur les planchers océaniques, principalement au niveau des fumerolles des dorsales océaniques (Crapart et al., 2007; Goffredi et al., 2004) et près des côtes, mais aussi sur les premiers mètres sous la surface des eaux sous forme de tapis plus ou moins épais. Une deuxième grande niche où se forment les biofilms est constituée par le sol qu’ils enrichissent en biodégradant les autres organismes (Friedman, Higgins, & Gore, 2017; Raghupathi et al., 2018). La troisième grande niche est liée aux autres êtres vivants. Ainsi, on trouve des biofilms se développant sur les plantes (Antoun, 2013; Niu, Paulson, Zheng, & Kolter, 2017; Pérez-Montaño et al., 2014; Rinaudi & Giordano, 2010), ces biofilms font partie de ce que l’on appelle leur microbiome (communauté de micro organismes se développant dans un très proche voisinage de la surface des eucaryotes multicellulaires). Ces microbiomes sont en symbiose avec leur hôte et possèdent une action de protection contre les micro-organismes infectieux, de promotion de la croissance par synthèse d’hormones et augmentent la biocompatibilité des minéraux présents dans le sol. Ces bénéfices sont promulgués contre la mise à disposition de nutriments que relarguent les plantes via leur surface. Outre les microbiomes des plantes, il en existe aussi liés aux animaux. Cependant, pour les animaux, en plus des communautés se développant sur leur surface, il y a aussi des biofilms se développant en leur sein et qui forment la majorité des biofilms inter-réagissant avec eux. Ces microbiotes symbiotiques sont essentiellement liés au trafic intestinal. Ainsi, on en retrouve dans les cavités bucco-dentaires (Amarasinghe, Scannapieco, & Haase, 2009; Paster, Olsen, Aas, & Dewhirst, 2006; Peyyala, Kirakodu, Ebersole, & Novak, 2011; Alexander H. Rickard, Gilbert, High, Kolenbrander, & Handley, 2003) et dans les intestins (Lu et al., 2019; Parshukov et al., 2019; Patterson et al., 2014; Sarmiento et al., 2019). Ces communautés bactériennes ont un rôle prépondérant dans la dégradation des aliments et leur assimilation, et synthétisent certains des nutriments essentiels au bon fonctionnement de l’organisme.
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Table des matières
I. Introduction
I.1. Généralités
I.1.A. Une brève histoire de la microbiologie
I.1.B Les bactéries
I.1.B.1. Les bactéries, pilier de la biosphère
I.1.B.2. Quelques exemples de biofilms
I.1.B.2.a. Biofilms naturels
I.1.B.2.b. Biofilms et activité humaine
I.2. La formation d’un biofilm
I.2.A. Initiation d’un biofilm
I.2.B. La matrice extracellulaire
I.2.C. Les interactions inter-espèces
I.2.D. Hydrodynamique
I.3. Approches méthodologiques de l’étude des biofilms
I.3.A. Types de communauté étudiés
I.3.B. Microscopie optique et rapporteurs fluorescents
I.3.C. Cytométrie en flux
I.3.D. Les techniques -omiques
II.Matériels et méthodes
II.1. Microbiologie
II.1.A. Souches
II.1.A.1. Escherichia coli
II.1.A.2. Espèces de la communauté bactérienne
II.1.A.2.a. Pseudomonas fluorescens
II.1.A.2.b. Bacillus thuringiensis
II.1.A.2.c. Kocuria salsicia
II.1.A.2.d. Rhodocyclus sp.
II.1.A.2.e. Communauté 4-espèces en biofilm
II.1.B. Protéines fluorescentes
II.1.C. Milieux de culture
II.1.C.1. Pré-cultures d’Escherichia coli
II.1.C.2. Pré-cultures des membres de la communauté 4S
III.1.C.3. Préparations spécifiques des différentes expériences
II.1.C.3.a. Expérience biofilm
II.1.C.3.b. Expérience cytométrie
II.1.C.3.c. Expérience tecan
II.2. Dispositif milli-fluidique
II.3. Microscopie optique
II.3.A. Montage expérimental
II.3.A.1. Microscope
II.3.A.2. Imagerie
II.3.B. Analyse d’image
II.4. Lecteur de plaque
II.4.A. Appareillage
II.4.B. Analyse
II.5. Cytométrie
II.5.A. Principe de la cytométrie en flux
II.5.B. Appareillage et acquisition
II.5.C. Analyses de cytométrie en flux
II.5.C.1. Mise au point de l’analyse MACSQuant VYB
II.5.C.2. Mise au point de l’analyse FACS Calibur
III. Résultats et interprétations
III.1. Rapporteurs génétiques fluorescents en biofilm bactérien. Introduction d’un nouveau rapporteur à fluorescence inductible : FAST
III.1.A. Linéarité et distribution spatio-temporelle de la fluorescence de la GFP et représentativité avec la µOD
III.1.B. Impact de la concentration hétérogène en O2 sur la fluorescence de la GFP en biofilm
III.1.C. Comparaison FAST avec la GFP et la mCherry en contexte de biofilm croissant
III.2. Etude cinétique du développement d’un biofilm quatre espèces sous flux
III.2.A. L’origine du biofilm 4 espèces
III.2.B. Formation et développement d’un biofilm 4 espèces en flux
III.2.C. Etude des marqueurs quantitatifs du biofilm 4S
III.2.C.1 Protéines fluorescentes : Limitations en biofilm 4S
III.2.C.2 Quantification des signaux de fluorescence
III.2.C.3 Le coefficient de corrélation et la dynamique spatiale au sein du biofilm.
III.2.D Structure et dynamique de la formation du biofilm 4S
III.2.D.1 Comportements individuels en contexte 4S Bacillus thuringiensis
a) Cinétique de croissance
b) Distribution spatiale
c) Dynamique spatiale
Pseudomonas fluorescens
a) Cinétique de croissance
b) Distribution spatiale
c) Dynamique spatiale
Kocuria salsicia
Rhodocyclus sp
III.2.D.2 Composition de l’état stationnaire
III.2.D.3 Phases individuelles versus phases collectives
III.2.E Conclusion
III.3. Les différents mélanges de biofilm : analyse combinatoire
III.3.A. Les associations de Pseudomonas fluorescens
III.3.B. Les cas complémentaires contenant Bacillus thuringiensis
III.3.C. Les cas particuliers de Kocuria salsicia et/ou Rhodocyclus sp.
III.3.C.1. Kocuria salsicia
III.3.C.2. Rhodocyclus sp
III.3.C.3. Biofilm 2S Kocuria salsicia et Rhodocyclus sp.
III.3.D. Conclusion
IV. Conclusions
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