Soutenance mémoire
Les Apicomplexa représentent un embranchement de plus de 5000 espèces de parasites protozoaires intracellulaires obligatoires (Tonkin 2020; Briquet, Gissot, et Silvie 2022). Parmi les membres les plus notables de ce phylum figurent Eimeria sp., agent pathogène pour la volaille et le bétail, Cryptosporidia, pathogène opportuniste pour les humains et les animaux, Babesia et Theileria, parasites du bétail, Toxoplasma gondii (T. gondii), responsable de la toxoplasmose et Plasmodium falciparum (P. falciparum), la cause la plus mortelle du paludisme (Hu et al. 2006a). T. gondii et P. falciparum sont les deux espèces dont la motilité et l’invasion ont été les plus étudiées en raison de leur accessibilité génétique et expérimentale (Frénal and Soldati-Favre 2013a).
La toxoplasmose est une infection d’origine alimentaire présente à l’échelle mondiale. Sa fréquence et son mode de transmission sont influencés par le mode de vie, la présence de félidés (hôtes définitifs) dans l’environnement et les comportements alimentaires différents et propres à chaque pays (Giraud, 2004). Ainsi, dans diverses régions du monde, il a été démontré que plus de 60% des populations sont infectées avec une prédominance dans les zones à climat chaud, humide et à basse altitude (CDC, 2018). T. gondii est la seule espèce du genre et ce parasite fait l’objet de nombreuses études à travers le monde à cause de son impact sanitaire. En effet, il est capable d’infecter toutes les cellules des organes de l’organisme humain, en particulier celles du cerveau provoquant des lésions graves et peut être fatal en cas d’immunodéficience liée au virus du SIDA. La toxoplasmose est également responsable d’affections oculaires qui peuvent être invalidantes de l’enfance jusqu’à l’âge adulte. Une infection par T. gondii pendant le premier trimestre de la grossesse, peut entraîner des avortements, des mortalités natales et des anomalies cérébrales irréversibles chez le nouveau-né.
Toxoplasma gondii et Plasmodium falciparum, deux parasites Apicomplexa
Généralités sur T. gondii
T. gondii est un protozoaire intracellulaire obligatoire et constitue un véritable modèle dans la biologie cellulaire des organismes Apicomplexa. C’est sans doute le plus répandu des parasites du phylum Apicomplexa, capable d’infecter presque tous les vertébrés à sang chaud, une cause courante d’infection chez les animaux domestiques et sauvages, de même que la population humaine mondiale (Robert-Gangneux et al, 2012). Historiquement, la découverte de T. gondii est attribuée à Charles Nicolle et Louis Manceaux en 1908, tous deux chercheurs à l’Institut Pasteur de Tunis. Dans l’optique d’explorer les réservoirs environnementaux de la leishmaniose, ils isolent un nouveau parasite au cours de prélèvements sur Ctenodactylus gundi, un rongeur autochtone de l’actuelle Tunisie . Ce parasite morphologiquement proche d’amastigotes de leishmanie mais avec des propriétés biologiques différentes : plus allongé, sans centrosome et ne pouvant pas se multiplier dans des milieux de culture spécifiques aux leishmanies (Nicolle et Manceaux, 1908 ; Dubey, 2008). De son côté, Alfonso Splendore à São Paulo a confirmé l’existence de T. gondii la même année chez un lapin de laboratoire au Brésil (Splendore, 1908 ; Hamidović, 2020). Le nom du genre du parasite provient de sa morphologie ; Toxoplasma (du grec toxon signifiant arc pour sa morphologie) et son nom d’espèce, gondii, a été donné pour sa découverte chez le rongeur Ctenodactylus gundi (Bittame, 2011).
Différents types
L’analyse génétique de populations de T. gondii isolées en Europe et en Amérique du nord, a permis de les classer en 3 lignées clonales nommées types I, II et III (Howe et Sibley 1995). Les différences génétiques entre ces trois différentes lignées sont estimées entre 1% et 3% tandis qu’elles sont très faibles au sein d’une même lignée (< 0,01%) (Aïjoka, 1998). Les différences phénotypiques entre les lignées se remarquent au niveau de leur virulence. Connue pour son extrême virulence, la souche RH est une souche de type I isolée dans un cas d’encéphalite aigüe chez l’homme Les génotypes avec une majorité d’allèles de type I sont généralement les plus virulents (Mercier et al, 2010) avec une dose létale de 100% (DL100) pour un parasite moins de 10 jours post-infection (Sibley and Boothroyd 1992).
Le type II présente une virulence intermédiaire avec une dose létale DL50 supérieure à 10³ . Le type III est quasiment non-virulent avec une dose létale supérieure à 10⁵ (Sibley and Ajioka 2008). De plus, le taux de multiplication chez le type I est le plus élevé. Cependant, depuis une vingtaine d’années, en Guyane française et en Amérique latine, des souches atypiques sont décrites. Ces souches ont la particularité d’être extrêmement pathogènes chez les patients immunocompétents et sont à la base de la définition d’une nouvelle entité clinique : la toxoplasmose amazonienne (Simon et al. 2019) .
Cycle biologique
T. gondii se démarque des autres apicomplexes par son aptitude à parasiter n’importe quel organisme homéotherme. Ces organismes représentent les hôtes intermédiaires, chez qui le parasite effectue un cycle évolutif incomplet composé exclusivement d’une phase asexuée. Par contre, chez les hôtes définitifs que sont le chat et autres félidés, le parasite développe un cycle évolutif complet comprenant une phase sexuée et une phase asexuée (Bittame, 2011). La majorité des mammifères a la capacité de convertir l’acide linoléique en acide arachidonique. La première étape de cette conversion est catalysée par la Δ-6 désaturase. Les chats étant dépourvus de cette enzyme, ils puisent l’acide arachidonique de leur alimentation et l’acide linoléique est accumulée. Cette forte présence d’acide linoléique dans les intestins des félidés favorise la progression des bradyzoïtes vers les mérozoïtes puis vers les macro et microgamètes. C’est ce qui ferait d’eux les hôtes définitifs du parasite (Sinclair et al. 1979 ; English et Striepen, 2019).
Cycle sexué
L’hôte définitif est contaminé par carnivorisme (consommation d’animaux infectés contenant des bradyzoïtes enkystés) ou via l’ingestion d’oocystes sporulés dispersés dans la nature. Ces bradyzoïtes sont évacués des kystes sous l’effet des enzymes intestinales et de l’acidité du milieu puis ils envahissent les cellules épithéliales de l’intestin grêle. Malgré l’aptitude du parasite à se disséminer dans le corps de l’hôte définitif, l’infection ne donne lieu à des signes cliniques sévères que rarement (Calero-Bernal et Gennari, 2019). Les bradyzoïtes se développent dans l’intestin grêle en l’espace de quelques jours et donnent lieu à différents stades morphologiques (Speer et Dubey, 2005). La reproduction sexuée débute deux jours après l’ingestion des kystes. La formation des gamètes mâles et femelles dans l’épithélium intestinal commence deux jours après l’ingestion des kystes et dure jusqu’à 15 jours. La fusion de ces gamètes donnent naissance à des oocystes diploïdes recouverts d’une enveloppe imperméable. Ces oocystes sont libérés dans l’environnement via les fèces des félidés. Il faut rappeler que les chats ont l’habitude d’enfouir leurs selles dans la terre ou le sable, ce qui procure les conditions idéales à la survie des oocystes de T. gondii. Plusieurs facteurs tels que le vent, les animaux, la pluie participent à la prolifération des oocystes et cette dissémination est freinée par la fermeté et la densité des fèces. (Dubey, 2010).
Cycle asexué
Les oocystes retrouvés dans l’environnement sont ingérés par hôte intermédiaire et débutent un nouveau cycle qui se manifestent sous la forme d’une reproduction asexuée. En effet, les sporozoïtes envahissent les cellules de l’hôte et se différencient très vite en tachyzoïtes à l’intérieur d’une vacuole parasitophore. Les tachyzoïtes sont aptes à la prolifération rapide et sont à la base des manifestations cliniques de la toxoplasmose aigüe (Tilley et al, 1997). Ils ont la capacité de se propager à travers les vaisseaux sanguins ou la lymphe et de contaminer divers organes (muscles, viscères et tissus nerveux) et diverses cellules comme les fibroblastes, les cellules endothéliales et les globules blancs (Dubey, 2010). Ce qui devient encore plus inquiétant lorsque l’infection est contractée pendant la grossesse car il y a des risques de transmission de la mère au fœtus des tachyzoïtes qui franchissent aisément la barrière placentaire. Par ailleurs, le fœtus ne dispose pas d’un système immunitaire propre. Cependant, le système immunitaire de l’hôte intervient et pousse les tachyzoïtes à se différencier en bradyzoïtes qui s’enkystent pour y échapper. La phase chronique de l’infection se manifeste ainsi et perdure en théorie toute la vie de l’hôte (Elbez-Rubinstein et al, 2009). En outre, le mode de contamination dépend du stade parasitaire. Les herbivores subissent une infection environnementale par ingestion des oocystes contenus dans l’eau ou les végétaux souillés par les excréments des félins. Les carnivores sont infectés par consommation des kystes retrouvés dans les tissus de leurs proies. Les omnivores tels que l’homme peuvent être contaminés des deux manières. Une bonne hygiène passant par le nettoyage des mains, des aliments et la consommation d’eau propre peut prévenir l’infection par les oocystes et une cuisson de la viande à plus de 60°C la contamination par les kystes (El-Nawawi et al, 2008).
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Table des matières
Introduction
GENERALITES
I- Toxoplasma gondii et Plasmodium falciparum, deux parasites Apicomplexa
A- Généralités sur T. gondii
1- Différents types
2- Cycle biologique
3- Différentes formes parasitaires
4- Toxoplasmose
5- Diagnostic
6- Manifestations physiopathologiques
7- Traitement pharmacologique
8- Ultrastructure de T. gondii
9- Mécanisme d’invasion de la cellule hôte
B- Généralités sur P. falciparum
1- Ultrastructure de P. falciparum
2- Cycle biologique
3- Paludisme
II- Trafic intracellulaire des protéines des organites sécrétoires apicaux chez T. gondii
III- Famille des récepteurs à domaine Vps10p-D chez les mammifères
A- Origine et description
B- Localisation
C- Structure et Fonction
PROBLEMATIQUE
MATERIELS ET METHODES
I- Culture cellulaire
A- Culture de T. gondii
1- Culture des fibroblastes humains
2- Entretien des parasites T. gondii
3- Purification des parasites T. gondii
B- Culture de P. falciparum
II- Biologie moléculaire
A- Construction des plasmides d’expression des protéines recombinantes N-SORT, N-SORT tronquée, ROP16, ROP18, MIC5
B- Transformation des souches P. pastoris
C- Criblage des transformants P. pastoris par PCR
D- Complémentation fonctionnelle par CRISPR-Cas9 de TgSORT dans le mutant iKOTgSORT
III- Biochimie
A- Expression de protéines recombinantes N-SORT, MIC5, ROP16 et ROP18
B- Chromatographie d’affinité et gel filtration ou chromatographie d’exclusion stérique
C- Electrophorèse en gel de polyacrylamide et Western blot
D- Test de l’activité anti-toxoplasmique d’inhibiteurs : dosage de la bêta-galactosidase
IV- Biologie cellulaire
A- Immunofluorescence indirecte sur T. gondii
B- Test de l’activité antipaludique des inhibiteurs : cytométrie en flux
V- Analyses statistiques
RESULTATS
I) Expression optimisée de TgN-SORT et ses partenaires dans la levure méthylotrophique P. pastoris
II) Evaluation des activités anti-toxoplasmique et anti-paludique de composés
DISCUSSION
CONCLUSION
PERSPECTIVES
