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Les cofacteurs du photosystรจme II
Questions
Lorsque les premiรจres structures cristallographiques de PSII dans les cyanobactรฉries ont รฉtรฉ obtenues, la rรฉsolution nโรฉtait pas suffisante pour dรฉtecter lโion Ca2+ 78,79. Pourtant, sa prรฉsence et son utilitรฉ ont รฉtรฉ dรฉmontrรฉes dans le PSII de plante. La question sโest posรฉe de savoir si le Ca2+ รฉtait prรฉsent dans le PSII de cyanobactรฉrie. Il a donc รฉtรฉ donnรฉ lโidรฉe au laboratoire de dรฉvelopper une mรฉthode pour remplacer biosynthรฉtiquement le Ca2+ par du Sr2+ dans T. elongatus110. Plusieurs raisons ont expliquรฉ le choix du strontium :
Le strontium est le seul cation capable de maintenir lโactivitรฉ du PSII en remplacement du calcium80. La reconstitution de PSII dรฉplรฉtรฉ en Ca2+ avec du Sr2+ restaure 40% de lโactivitรฉ sous รฉclairement continu, aussi bien chez T. elongatus que chez les plantes.
Dans les plantes, cette baisse dโactivitรฉ est due au ralentissement des transitions des รฉtats Sn 117,87, 81 , ce qui peut รชtre particuliรจrement intรฉressant dans le cas dโรฉtudes enzymologiques et spectroscopiques pour piรฉger des รฉtats intermรฉdiaires.
Les techniques de titrage du calcium sont difficiles ร mettre en oeuvre, le strontium est plus facile ร doser et ร dรฉtecter spectroscopiquement.
Toutes les รฉtudes รฉtaient rรฉalisรฉes auparavant sur du PSII dans lequel le Ca2+ a รฉtรฉ รฉchangรฉ par du Sr2+ selon une mรฉthode biochimique. En gรฉnรฉral, ces traitements consistent ร laver le PSII purifiรฉ dans des solutions tampons ร forte concentration en sels et ร la lumiรจre, ou par des traitements ร bas pH. A cause de ces traitements sรฉvรจres, il a รฉtรฉ suggรฉrรฉ que les effets observรฉs sur ces รฉchantillons รฉchangรฉs biochimiquement รฉtaient dus ร des effets secondaires du traitement biochimique. De plus, ces procรฉdures pour enlever le Ca2+ induisent une inhibition cโest ร dire une perte du cluster de Mn4Ca dans une petite fraction de centres PSII82,. Enfin, la substitution par le Sr2+ nโest pas forcรฉment 100% efficace et le matรฉriel obtenu est souvent instable. Tous ces effets contribuaient ร lโhรฉtรฉrogรฉnรฉitรฉ des รฉchantillons de PSII substituรฉs par le Sr2+.
Lโรฉchange biosynthรฉtique paraissait donc la meilleure solution pour avoir ร disposition un รฉchantillon de PSII homogรจne et actif contenant du Sr2+ ร la place du Ca2+, en faisant pousser des cyanobactรฉries T. elongatus dans un milieu contenant du Sr2+. La prรฉsence dโun Sr2+ par PSII dans ce type de PSII a รฉtรฉ mise en รฉvidence. Au mรชme moment, une structure de PSII avec une rรฉsolution de 3.5ร
a montrรฉ la prรฉsence dโun Ca2+ en interaction avec le cluster de Mn4Ca9. Des mesures de cristallographie aux rayons X plus rรฉcentes et de spectroscopie EXAFS ont confirmรฉ que le Sr2+ est bien associรฉ รฉtroitement au cluster de Mn4Ca, et dans une position similaire ร celle du Ca2+ 83,84 (Figure 29).
Figure 29 : Localisation du strontium par rapport au calcium dans lโรฉtat S1, dรฉduite de mesures EXAFS.
(Tirรฉ de rรฉfรฉrence 83). Lโatome de Ca est en vert et lโatome de Sr est en jaune. Le distances sont les suivantes : Sr-MnB,C,D โ 3,5 ร
et Sr-MnA โ 4,0 ร
.
Lorsque ce travail a dรฉbutรฉ, lโincertitude รฉtait totale concernant la localisation du deuxiรจme cofacteur du photosystรจme II : le chlorure. Les questions suivantes รฉtaient en suspens : Le chlorure est-il nรฉcessaire ? Si oui, combien dโatomes sont impliquรฉs dans le mรฉcanisme ? Quel est le rรดle du chlorure dans le mรฉcanisme de dรฉgagement dโoxygรจne ?
Pour rรฉpondre ร ces questions, nous avons dรฉcidรฉ dโutiliser la mรชme approche que pour le calcium, ร savoir un รฉchange biosynthรฉtique du chlorure par le bromure.
En parallรจle avec cet รฉchange biosynthรฉtique du Cl- par Br-, nous avons dรฉcidรฉ dโรฉtudier le remplacement du Cl- par un autre anion : I-. Lโiodure รฉtant photorรฉactif et รฉlectrochimiquement actif, nous ne pouvons pas rรฉaliser dโรฉchange biosynthรฉtique, mais seulement biochimique. Pour avoir matiรจre ร comparaison, nous avons en parallรจle rรฉalisรฉ un รฉchange biochimique du Cl- par Br- et par F- (qui est un inhibiteur connu du dรฉgagement dโoxygรจne). On trouve dans la littรฉrature un grand nombre dโรฉtudes oรน le Cl- a รฉtรฉ substituรฉ biochimiquement par un autre anion, et dont les rรฉsultats sont parfois en contradiction. Cette hรฉtรฉrogรฉnรฉitรฉ pourrait รชtre due au fait que lโรฉchange biochimique nโa pas รฉtรฉ efficace.
Comparer les rรฉsultats obtenus aprรจs รฉchange biosynthรฉtique et aprรจs รฉchange biochimique peut nous permettre de rรฉpondre ร cette question.
Nous avons pu ainsi en mรชme temps รฉtudier la question de lโรฉchangeabilitรฉ du Cl-. La question sโest posรฉe de savoir si un รฉchantillon de PSII purifiรฉ oรน le Cl- a รฉtรฉ remplacรฉ biosynthรฉtiquement par du Br- peut รชtre replacรฉ dans un milieu contenant du Cl-, sans rรฉรฉchanger le Br- par du Cl- au sein du complexe dโoxydation de lโeau. Cette donnรฉe peut nous รชtre particuliรจrement utile dans le cas des mesures Br-EXAFS. LโEXAFS est une technique qui peut รชtre difficile ร mettre en oeuvre car tous les ions sont dรฉtectรฉs, aussi bien ceux du milieu environnant que ceux fixรฉe ร la protรฉine. Pour ne pas avoir de Br- dans le milieu ร lโexception de celui ou ceux fixรฉ(s) au PSII, deux situations sont envisageables : 1) On peut enlever tous les halogรฉnures du milieu. La difficultรฉ dans ce cas est de conserver lโactivitรฉ de lโรฉchantillon ; 2) On peut replacer lโรฉchantillon dans un milieu contenant du Cl- sans pour autant รฉchanger le Br- du site catalytique. Cette situation correspond ร celle de lโรฉchange Ca2+/Sr2+ : on peut rรฉaliser lโEXAFS du Sr2+ dans un milieu contenant du Ca2+.
Par notre รฉtude cinรฉtique sur le PSII contenant du Br-, nous avons pu montrer lโimplication du Cl- dans le dรฉgagement dโoxygรจne (chapitre III). Au cours de ma thรจse, en 2008, une structure cristallographique de PSII contenant du Br- a รฉtรฉ publiรฉe (chapitre IV).
Deux sites de fixation au Br- ont รฉtรฉ identifiรฉs dans lโenvironnement du cluster de Mn4Ca.
Puis en 2009, est sortie une publication prรฉsentant la structure cristallographique de PSII avec I- 85 . Les informations concernant le chlorure et le photosystรจme II se sont donc considรฉrablement enrichies au cours de ces derniรจres annรฉes. Nous les aborderons dans la suite du document.
Les principaux signaux RPE connus en fonction des รฉtats S
Pour faciliter la comprรฉhension des paragraphes suivants, nous allons maintenant aborder lโintroduction des principaux signaux RPE connus en fonction des รฉtats S. La technique proprement dite est expliquรฉe dans le chapitre suivant.
Etat S2
Le cluster de Mn4Ca donne lieu ร plusieurs signaux RPE dans lโรฉtat S2 : un signal multilignes et des signaux provenant dโau moins deux diffรฉrents รฉtats haut-spin.
Le signal multilignes (Figure 30) est centrรฉ autour de g = 2 environ et sโรฉtend sur environ 1800 G. Il est composรฉ dโenviron 18 lignes sรฉparรฉes dโenviron 87 G. Il a รฉtรฉ proposรฉ quโil provient dโun spin 1/2, trรจs certainement dโun tรฉtramรจre de Mn, probablement MnIV 3MnIII (cf. Chapitre I. III) 3) ), pour plusieurs raisons : 1) Le signal disparait lorsque le Mn est extrait ; 2) Le signal multilignes est trรจs proche dโun spectre RPE de composรฉs binuclรฉaires86 MnIIIMnIV de spin 1/2 dans lequel les ions MnIV de spin S = 3/2 et MnIII de spin S = 2 sont couplรฉs antiferromagnรฉtiquement ; 3) Les raies hyperfines sont dues au couplage avec les noyaux de spin I = 5/2. Le nombre de raies implique lโexistence dโun tรฉtramรจre.
Lorsque le Sr2+ est substituรฉ au Ca2+, on observe un signal multilignes modifiรฉ87. 2500 3000 3500 4000 4500
Champ magnรฉtique (gauss)
Figure 30 : Exemple de signal multilignes observรฉ dans lโรฉtat S2 (Spectre de diffรฉrence ยซ aprรจs moins avant รฉclairement ยป). Le spectre dโun รฉchantillon adaptรฉ ร lโobscuritรฉ a รฉtรฉ enregistrรฉ, puis lโรฉchantillon a รฉtรฉ รฉclairรฉ pour induire lโรฉtat S2 (par un รฉclairement ร 200 K) et un nouveau spectre a รฉtรฉ enregistrรฉ. La partie centrale du spectre correspondant au signal de la TyrD a รฉtรฉ รฉliminรฉe. Ce spectre est enregistrรฉ dans les conditions suivantes : tempรฉrature 8,5 K, amplitude de modulation 25 G, puissance micro-ondes 20 mW, frรฉquence des micro-ondes 9,4 GHz, frรฉquence de modulation 100 kHz. Les รฉtoiles rouges se rapportent ร une expรฉrience dรฉcrite ultรฉrieurement. Le signal de haut spin le plus souvent observรฉ en S2 est celui qui donne lieu ร un signal autour de g โ 4. De tels signaux sont observรฉs dans deux types de conditions expรฉrimentales : Premiรจrement, le signal g โ 4 peut รชtre gรฉnรฉrรฉ par illumination ร tempรฉrature ambiante ou ร 200 K. La fraction des centres donnant naissance au signal g โ 4 dรฉpend du prรฉtraitement de lโenzyme, particuliรจrement augmentรฉe par a) la prรฉsence de sucrose dans le milieu88,141 , b) certains traitements pour enlever le chlorure du milieu127,124, ou pour le remplacer par F-134, I- 134 , des amines89, ou NO3 -134, et c) le remplacement du Ca2+ par Sr2+87. Deuxiรจmement, le signal g โ 4 peut รชtre aussi gรฉnรฉrรฉ par une illumination infrarouge du multilignes S2, entre 77 K et 170 K. Ceci correspond ร une transition de lโรฉtat de spin du cluster de Mn4Ca, du spin 1/2 au spin 5/290,91. Au dessus de 170 K, lโรฉtat S2 de spin 5/2 induit par lโinfrarouge est reconverti en multilignes S2 de spin 1/2. Les signaux g โ 4 observรฉs dans les diffรฉrentes conditions dรฉjร dรฉcrites proviennent dโรฉtats de spin 5/2, mais qui ont des stabilitรฉs diffรฉrentes en termes de tempรฉrature91. Un troisiรจme type de signal dans lโรฉtat S2 a รฉgalement รฉtรฉ dรฉcrit. Des signaux pour des valeurs de g>5 ont รฉtรฉ observรฉs quand lโรฉtat de spin 1/2 est illuminรฉ par une lumiรจre infrarouge ร une tempรฉrature infรฉrieure ร 77 K. Entre 77 et 170 K, un processus de relaxation donne lieu ร la formation du signal g โ 4. Le nouveau signal g > 5 a รฉtรฉ attribuรฉ ร un รฉtat de haut spin (probablement 5/2) reprรฉsentant un รฉtat du cluster de Mn4Ca similaire ร celui qui donne le signal g โ 4 mais dans un environnement lรฉgรจrement diffรฉrent (non relaxรฉ)92,93.
Etat S0
Lโรฉtat S0 donne รฉgalement un signal multilignes centrรฉ autour de g = 2 94 95. Il est rรฉparti sur environ 2380 G et est constituรฉ dโenviron 25 lignes rรฉsolues espacรฉes de 65-95 G. Il provient du cluster de Mn4Ca en spin 1/2. Le signal multilignes S0 a รฉtรฉ observรฉ chez les plantes en prรฉsence de mรฉthanol94,95 et chez T. elongatus96. Bien que la prรฉsence dโalcool ne soit pas requise pour observer le signal S0 chez T. elongatus, lโaddition de mรฉthanol amรฉliore sa rรฉsolution. Les signaux obtenus chez les plantes et chez T. elongatus sont similaires mais non identiques.
Etat S1
Lโutilisation de techniques de RPE plus avancรฉes permet la dรฉtection de signaux dans lโรฉtat S1. Deux signaux ont รฉtรฉ reportรฉs : 1) un large signal ร g = 4,897,98 et 2) un signal multilignes centrรฉ autour de g = 12 avec au moins 18 lignes sรฉparรฉes de 32 G50. Le signal multilignes S1 a รฉtรฉ observรฉ sur du PSII purifiรฉ de Synechocystis et de plante dans lequel les protรฉines extrinsรจques de 17 et 23 kDa ont รฉtรฉ enlevรฉes.
Etat S3
Une publication rรฉcente a dรฉcrit dans le dรฉtail le spectre RPE complet de lโรฉtat S3 chez T. elongatus47. Des signaux ร g โ 8 et g โ 4 et un certain nombre dโautres signaux qui ont รฉtรฉ reportรฉs (Figure 31). Ces signaux ont รฉtรฉ expliquรฉs par un รฉtat de spin S = 3.
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Table des matiรจres
CHAPITRE I. INTRODUCTION
I) LA PHOTOSYNTHESE
1) Photosynthรจse et vie terrestre
2) Organismes photosynthรฉtiques
3) Pigments photosynthรฉtiques
4) La chaรฎne photosynthรฉtique
5) La photosynthรจse artificielle
II) LE PHOTOSYSTEME II
1) Rรดle
2) Premiรจre รฉtape : lโabsorption de la lumiรจre
3) Structure du photosystรจme II
4) Mรฉcanisme :
a) Chaรฎne de transfert dโรฉlectrons
b) Le cycle de Kok
c) Voie secondaire de transfert dโรฉlectrons
d) La tyrosine D
III) LE SITE CATALYTIQUE : LE CLUSTER DE MN4CA
1) Structure du cluster de Mn4Ca
a) La spectroscopie RPE
b) LโEXAFS
c) La cristallographie aux rayons X
d) Conclusion
2) Ligands du cluster de Mn4Ca
3) Etats redox des Manganรจse
4) Accรจs du substrat
5) Mรฉcanisme dโoxydation de lโeau
a) Localisation du substrat
b) Formation de la liaison O-O
6) Transfert de protons
IV) LES COFACTEURS DU PHOTOSYSTEME II
1) Questions
2) Les principaux signaux RPE connus en fonction des รฉtats S
a) Etat S2
b) Etat S0
c) Etat S1
d) Etat S3
3) Le calcium
a) Mรฉthodes dโextraction du Ca2+
b) Stoechiomรฉtrie du calcium dans le PSII
c) Affinitรฉ de liaison
d) Calcium et avancement des รฉtats S
e) Cofacteurs alternatifs
4) Le chlorure
a) Mรฉthodes dโextraction du chlorure
b) Chlorure et avancement des รฉtats S
c) Stoechiomรฉtrie du chlorure
d) Affinitรฉ de liaison
e) Cofacteurs alternatifs
i. Gรฉnรฉralitรฉs
ii. Cas particulier de lโiodure
iii. Cas particulier du fluorure
CHAPITRE II.MATERIEL ET METHODES
I) UN ORGANISME DE CHOIX : THERMOSYNECHOCOCCUS ELONGATUS
II)METHODES
1) Culture des cellules et purification des thylakoides et du PSII
a) Conditions de culture
b) Purification des thylakoides
c) Purification du PSII
d) Dรฉplรฉtion en manganรจse
2) Dรฉgagement dโoxygรจne sous รฉclairement continu
3) Oxymรฉtrie rรฉsolue en temps
a) Mรฉthode
b) Analyse des donnรฉes : รฉmission dโoxygรจne sur une sรฉquence de flashs
c) Analyse des donnรฉes : vitessse dโรฉmission dโoxygรจne
4) Thermoluminescence
a) Principe
b) Matรฉriel
c) Analyse des donnรฉes
5) Spectroscopie de changements dโabsorption UV-visible
a) Mรฉthode : matรฉriel et intรฉrรชt
b) Simulation des oscillations
6) Rรฉsonance Paramagnรฉtique Electronique
a) Principe
b) Protocole
CHAPITRE III. ECHANGE BIOSYNTHETIQUE DES COFACTEURS
I) INTRODUCTION
II) RESULTATS
1) Croissance des cellules
2) Purification enzymatique
3) Dรฉgagement dโoxygรจne sous รฉclairement continu
a) Sur cellules entiรจres
b) Sur PSII
4) Changements dโabsorption
a) Introduction
b) Changements dโabsorption ร 292 nm
c) Cinรฉtiques ร 433 nm
d) Cinรฉtiques ร 292 nm
e) Cinรฉtiques ร 440 โ 424 nm
5) Oxymรฉtrie rรฉsolue en temps
a) Sรฉquences de dรฉgagement dโoxygรจne
b) Cinรฉtiques de dรฉgagement dโoxygรจne
6) Etudes des propriรฉtรฉs thermodynamiques par thermoluminescence
7) Mesure des รฉnergies dโactivation
8) Caractรฉrisation par Rรฉsonance Paramagnรฉtique Electronique
a) Introduction : Cas de lโรฉchantillon contrรดle Ca/Cl dans lโรฉtat S2
i. Spectre ร 4 K
ii. Spectre ร 8,5 K
iii. Spectre ร 15 K
b) Spectres ร 4 K
c) Spectres ร 8,5 K
d) Spectres ร 15 K
III) DISCUSSION
CHAPITRE IV. ECHANGE BIOCHIMIQUE DU CHLORURE
I)MISE AU POINT DโUN PROTOCOLE DโECHANGE BIOCHIMIQUE
1) Introduction
2) Dans des thylakoides
a) Comparaison des rรฉsultats obtenus sur les deux types dโรฉlectrode (45 minutes)
b) Rรฉsultats de thermoluminescence : 5 heures
c) Electrode rรฉsolue en temps : purification de cellules Sr/Br dans milieux Cl-
3) Dans le PSII
4) Conclusion
II) ETUDE DES PROPRIETES DE LโIODURE
1) Dรฉgagement dโoxygรจne sous รฉclairement continu
2) Cinรฉtiques de dรฉclin du radical TyrZ
3) Sรฉquences de dรฉgagement dโoxygรจne
4) Cinรฉtiques de dรฉgagement dโoxygรจne
5) Courbes dโรฉmission de thermoluminescence
6) Caractรฉrisation par Rรฉsonance Paramagnรฉtique Electronique
a) Rรฉsultats des รฉchantillons biochimiquement modifiรฉs
i. Eclairement ร 200 K
i.i Echantillon Ca/Cl
i.ii Echantillon Ca/F
i.iii Sans halogรฉnure
i.iv Echantillon Ca/I
ii. Eclairement par flashs
ii.i Aprรจs un flash
ii.ii Aprรจs deux flashs
ii.iii Aprรจs 3 flashs
7) Discussion
CHAPITRE V. STRUCTURE
I) ETUDE DU BLOCAGE DES ETATS SN EN FONCTION DE LA TEMPERATURE
1) Introduction
2) Mรฉthodes de mesure
a) Transitions S1โS2 et S0โS1 : Rรฉsonance Paramagnรฉtique Electronique
i. Protocole blocage S1 ร S2
ii. Protocole blocage S0 ร S1
b) Transitions S2โS3 et S3โS0 : Thermoluminescence
3) Rรฉsultats
a) Blocage S2โS3
i. Dรฉpendance en tempรฉrature de la transition S2โS3 dans les thylakoides
ii. Dรฉpendance en tempรฉrature de la transition S2โS3 dans le PSII
iii. Effet du pH sur la dรฉpendance en tempรฉrature de la transition S2โS3
b) Blocage S3โS0
c) Blocage S1โS2
d) Blocage S0โS1
e) Mise en รฉvidence dโun ยซ split ยป signal par RPE dans le PSII Sr/Br
4) Discussion
II) ETUDE DE LA FIXATION DES MOLECULES DโEAU SUBSTRAT
1) Introduction
2) Matรฉriel et mรฉthode
a) Principe
b) Matรฉriel
c) Analyse des rรฉsultats
3) Rรฉsultats
4) Discussion
III) STRUCTURE PAR CRISTALLOGRAPHIE AUX RAYONS X
1) Introduction
2) Publication
IV) DISCUSSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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