UN ORGANISME DE CHOIX : THERMOSYNECHOCOCCUS ELONGATUS

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Les cofacteurs du photosystème II

Questions

Lorsque les premières structures cristallographiques de PSII dans les cyanobactéries ont été obtenues, la résolution n’était pas suffisante pour détecter l’ion Ca2+ 78,79. Pourtant, sa présence et son utilité ont été démontrées dans le PSII de plante. La question s’est posée de savoir si le Ca2+ était présent dans le PSII de cyanobactérie. Il a donc été donné l’idée au laboratoire de développer une méthode pour remplacer biosynthétiquement le Ca2+ par du Sr2+ dans T. elongatus110. Plusieurs raisons ont expliqué le choix du strontium :
Le strontium est le seul cation capable de maintenir l’activité du PSII en remplacement du calcium80. La reconstitution de PSII déplété en Ca2+ avec du Sr2+ restaure 40% de l’activité sous éclairement continu, aussi bien chez T. elongatus que chez les plantes.
Dans les plantes, cette baisse d’activité est due au ralentissement des transitions des états Sn 117,87, 81 , ce qui peut être particulièrement intéressant dans le cas d’études enzymologiques et spectroscopiques pour piéger des états intermédiaires.
Les techniques de titrage du calcium sont difficiles à mettre en oeuvre, le strontium est plus facile à doser et à détecter spectroscopiquement.
Toutes les études étaient réalisées auparavant sur du PSII dans lequel le Ca2+ a été échangé par du Sr2+ selon une méthode biochimique. En général, ces traitements consistent à laver le PSII purifié dans des solutions tampons à forte concentration en sels et à la lumière, ou par des traitements à bas pH. A cause de ces traitements sévères, il a été suggéré que les effets observés sur ces échantillons échangés biochimiquement étaient dus à des effets secondaires du traitement biochimique. De plus, ces procédures pour enlever le Ca2+ induisent une inhibition c’est à dire une perte du cluster de Mn4Ca dans une petite fraction de centres PSII82,. Enfin, la substitution par le Sr2+ n’est pas forcément 100% efficace et le matériel obtenu est souvent instable. Tous ces effets contribuaient à l’hétérogénéité des échantillons de PSII substitués par le Sr2+.
L’échange biosynthétique paraissait donc la meilleure solution pour avoir à disposition un échantillon de PSII homogène et actif contenant du Sr2+ à la place du Ca2+, en faisant pousser des cyanobactéries T. elongatus dans un milieu contenant du Sr2+. La présence d’un Sr2+ par PSII dans ce type de PSII a été mise en évidence. Au même moment, une structure de PSII avec une résolution de 3.5Å a montré la présence d’un Ca2+ en interaction avec le cluster de Mn4Ca9. Des mesures de cristallographie aux rayons X plus récentes et de spectroscopie EXAFS ont confirmé que le Sr2+ est bien associé étroitement au cluster de Mn4Ca, et dans une position similaire à celle du Ca2+ 83,84 (Figure 29).
Figure 29 : Localisation du strontium par rapport au calcium dans l’état S1, déduite de mesures EXAFS.
(Tiré de référence 83). L’atome de Ca est en vert et l’atome de Sr est en jaune. Le distances sont les suivantes : Sr-MnB,C,D ≈ 3,5 Å et Sr-MnA ≈ 4,0 Å.
Lorsque ce travail a débuté, l’incertitude était totale concernant la localisation du deuxième cofacteur du photosystème II : le chlorure. Les questions suivantes étaient en suspens : Le chlorure est-il nécessaire ? Si oui, combien d’atomes sont impliqués dans le mécanisme ? Quel est le rôle du chlorure dans le mécanisme de dégagement d’oxygène ?
Pour répondre à ces questions, nous avons décidé d’utiliser la même approche que pour le calcium, à savoir un échange biosynthétique du chlorure par le bromure.
En parallèle avec cet échange biosynthétique du Cl- par Br-, nous avons décidé d’étudier le remplacement du Cl- par un autre anion : I-. L’iodure étant photoréactif et électrochimiquement actif, nous ne pouvons pas réaliser d’échange biosynthétique, mais seulement biochimique. Pour avoir matière à comparaison, nous avons en parallèle réalisé un échange biochimique du Cl- par Br- et par F- (qui est un inhibiteur connu du dégagement d’oxygène). On trouve dans la littérature un grand nombre d’études où le Cl- a été substitué biochimiquement par un autre anion, et dont les résultats sont parfois en contradiction. Cette hétérogénéité pourrait être due au fait que l’échange biochimique n’a pas été efficace.
Comparer les résultats obtenus après échange biosynthétique et après échange biochimique peut nous permettre de répondre à cette question.
Nous avons pu ainsi en même temps étudier la question de l’échangeabilité du Cl-. La question s’est posée de savoir si un échantillon de PSII purifié où le Cl- a été remplacé biosynthétiquement par du Br- peut être replacé dans un milieu contenant du Cl-, sans rééchanger le Br- par du Cl- au sein du complexe d’oxydation de l’eau. Cette donnée peut nous être particulièrement utile dans le cas des mesures Br-EXAFS. L’EXAFS est une technique qui peut être difficile à mettre en oeuvre car tous les ions sont détectés, aussi bien ceux du milieu environnant que ceux fixée à la protéine. Pour ne pas avoir de Br- dans le milieu à l’exception de celui ou ceux fixé(s) au PSII, deux situations sont envisageables : 1) On peut enlever tous les halogénures du milieu. La difficulté dans ce cas est de conserver l’activité de l’échantillon ; 2) On peut replacer l’échantillon dans un milieu contenant du Cl- sans pour autant échanger le Br- du site catalytique. Cette situation correspond à celle de l’échange Ca2+/Sr2+ : on peut réaliser l’EXAFS du Sr2+ dans un milieu contenant du Ca2+.
Par notre étude cinétique sur le PSII contenant du Br-, nous avons pu montrer l’implication du Cl- dans le dégagement d’oxygène (chapitre III). Au cours de ma thèse, en 2008, une structure cristallographique de PSII contenant du Br- a été publiée (chapitre IV).
Deux sites de fixation au Br- ont été identifiés dans l’environnement du cluster de Mn4Ca.
Puis en 2009, est sortie une publication présentant la structure cristallographique de PSII avec I- 85 . Les informations concernant le chlorure et le photosystème II se sont donc considérablement enrichies au cours de ces dernières années. Nous les aborderons dans la suite du document.

Les principaux signaux RPE connus en fonction des états S

Pour faciliter la compréhension des paragraphes suivants, nous allons maintenant aborder l’introduction des principaux signaux RPE connus en fonction des états S. La technique proprement dite est expliquée dans le chapitre suivant.

Etat S2

Le cluster de Mn4Ca donne lieu à plusieurs signaux RPE dans l’état S2 : un signal multilignes et des signaux provenant d’au moins deux différents états haut-spin.
Le signal multilignes (Figure 30) est centré autour de g = 2 environ et s’étend sur environ 1800 G. Il est composé d’environ 18 lignes séparées d’environ 87 G. Il a été proposé qu’il provient d’un spin 1/2, très certainement d’un tétramère de Mn, probablement MnIV 3MnIII (cf. Chapitre I. III) 3) ), pour plusieurs raisons : 1) Le signal disparait lorsque le Mn est extrait ; 2) Le signal multilignes est très proche d’un spectre RPE de composés binucléaires86 MnIIIMnIV de spin 1/2 dans lequel les ions MnIV de spin S = 3/2 et MnIII de spin S = 2 sont couplés antiferromagnétiquement ; 3) Les raies hyperfines sont dues au couplage avec les noyaux de spin I = 5/2. Le nombre de raies implique l’existence d’un tétramère.
Lorsque le Sr2+ est substitué au Ca2+, on observe un signal multilignes modifié87. 2500 3000 3500 4000 4500
Champ magnétique (gauss)
Figure 30 : Exemple de signal multilignes observé dans l’état S2 (Spectre de différence « après moins avant éclairement »). Le spectre d’un échantillon adapté à l’obscurité a été enregistré, puis l’échantillon a été éclairé pour induire l’état S2 (par un éclairement à 200 K) et un nouveau spectre a été enregistré. La partie centrale du spectre correspondant au signal de la TyrD a été éliminée. Ce spectre est enregistré dans les conditions suivantes : température 8,5 K, amplitude de modulation 25 G, puissance micro-ondes 20 mW, fréquence des micro-ondes 9,4 GHz, fréquence de modulation 100 kHz. Les étoiles rouges se rapportent à une expérience décrite ultérieurement. Le signal de haut spin le plus souvent observé en S2 est celui qui donne lieu à un signal autour de g ≈ 4. De tels signaux sont observés dans deux types de conditions expérimentales : Premièrement, le signal g ≈ 4 peut être généré par illumination à température ambiante ou à 200 K. La fraction des centres donnant naissance au signal g ≈ 4 dépend du prétraitement de l’enzyme, particulièrement augmentée par a) la présence de sucrose dans le milieu88,141 , b) certains traitements pour enlever le chlorure du milieu127,124, ou pour le remplacer par F-134, I- 134 , des amines89, ou NO3 -134, et c) le remplacement du Ca2+ par Sr2+87. Deuxièmement, le signal g ≈ 4 peut être aussi généré par une illumination infrarouge du multilignes S2, entre 77 K et 170 K. Ceci correspond à une transition de l’état de spin du cluster de Mn4Ca, du spin 1/2 au spin 5/290,91. Au dessus de 170 K, l’état S2 de spin 5/2 induit par l’infrarouge est reconverti en multilignes S2 de spin 1/2. Les signaux g ≈ 4 observés dans les différentes conditions déjà décrites proviennent d’états de spin 5/2, mais qui ont des stabilités différentes en termes de température91. Un troisième type de signal dans l’état S2 a également été décrit. Des signaux pour des valeurs de g>5 ont été observés quand l’état de spin 1/2 est illuminé par une lumière infrarouge à une température inférieure à 77 K. Entre 77 et 170 K, un processus de relaxation donne lieu à la formation du signal g ≈ 4. Le nouveau signal g > 5 a été attribué à un état de haut spin (probablement 5/2) représentant un état du cluster de Mn4Ca similaire à celui qui donne le signal g ≈ 4 mais dans un environnement légèrement différent (non relaxé)92,93.

Etat S0

L’état S0 donne également un signal multilignes centré autour de g = 2 94 95. Il est réparti sur environ 2380 G et est constitué d’environ 25 lignes résolues espacées de 65-95 G. Il provient du cluster de Mn4Ca en spin 1/2. Le signal multilignes S0 a été observé chez les plantes en présence de méthanol94,95 et chez T. elongatus96. Bien que la présence d’alcool ne soit pas requise pour observer le signal S0 chez T. elongatus, l’addition de méthanol améliore sa résolution. Les signaux obtenus chez les plantes et chez T. elongatus sont similaires mais non identiques.

Etat S1

L’utilisation de techniques de RPE plus avancées permet la détection de signaux dans l’état S1. Deux signaux ont été reportés : 1) un large signal à g = 4,897,98 et 2) un signal multilignes centré autour de g = 12 avec au moins 18 lignes séparées de 32 G50. Le signal multilignes S1 a été observé sur du PSII purifié de Synechocystis et de plante dans lequel les protéines extrinsèques de 17 et 23 kDa ont été enlevées.

Etat S3

Une publication récente a décrit dans le détail le spectre RPE complet de l’état S3 chez T. elongatus47. Des signaux à g ≈ 8 et g ≈ 4 et un certain nombre d’autres signaux qui ont été reportés (Figure 31). Ces signaux ont été expliqués par un état de spin S = 3.

Table des matières

CHAPITRE I. INTRODUCTION
I) LA PHOTOSYNTHESE
1) Photosynthèse et vie terrestre
2) Organismes photosynthétiques
3) Pigments photosynthétiques
4) La chaîne photosynthétique
5) La photosynthèse artificielle
II) LE PHOTOSYSTEME II
1) Rôle
2) Première étape : l’absorption de la lumière
3) Structure du photosystème II
4) Mécanisme :
a) Chaîne de transfert d’électrons
b) Le cycle de Kok
c) Voie secondaire de transfert d’électrons
d) La tyrosine D
III) LE SITE CATALYTIQUE : LE CLUSTER DE MN4CA
1) Structure du cluster de Mn4Ca
a) La spectroscopie RPE
b) L’EXAFS
c) La cristallographie aux rayons X
d) Conclusion
2) Ligands du cluster de Mn4Ca
3) Etats redox des Manganèse
4) Accès du substrat
5) Mécanisme d’oxydation de l’eau
a) Localisation du substrat
b) Formation de la liaison O-O
6) Transfert de protons
IV) LES COFACTEURS DU PHOTOSYSTEME II
1) Questions
2) Les principaux signaux RPE connus en fonction des états S
a) Etat S2
b) Etat S0
c) Etat S1
d) Etat S3
3) Le calcium
a) Méthodes d’extraction du Ca2+
b) Stoechiométrie du calcium dans le PSII
c) Affinité de liaison
d) Calcium et avancement des états S
e) Cofacteurs alternatifs
4) Le chlorure
a) Méthodes d’extraction du chlorure
b) Chlorure et avancement des états S
c) Stoechiométrie du chlorure
d) Affinité de liaison
e) Cofacteurs alternatifs
i. Généralités
ii. Cas particulier de l’iodure
iii. Cas particulier du fluorure
CHAPITRE II.MATERIEL ET METHODES
I) UN ORGANISME DE CHOIX : THERMOSYNECHOCOCCUS ELONGATUS
II)METHODES
1) Culture des cellules et purification des thylakoides et du PSII
a) Conditions de culture
b) Purification des thylakoides
c) Purification du PSII
d) Déplétion en manganèse
2) Dégagement d’oxygène sous éclairement continu
3) Oxymétrie résolue en temps
a) Méthode
b) Analyse des données : émission d’oxygène sur une séquence de flashs
c) Analyse des données : vitessse d’émission d’oxygène
4) Thermoluminescence
a) Principe
b) Matériel
c) Analyse des données
5) Spectroscopie de changements d’absorption UV-visible
a) Méthode : matériel et intérêt
b) Simulation des oscillations
6) Résonance Paramagnétique Electronique
a) Principe
b) Protocole
CHAPITRE III. ECHANGE BIOSYNTHETIQUE DES COFACTEURS
I) INTRODUCTION
II) RESULTATS
1) Croissance des cellules
2) Purification enzymatique
3) Dégagement d’oxygène sous éclairement continu
a) Sur cellules entières
b) Sur PSII
4) Changements d’absorption
a) Introduction
b) Changements d’absorption à 292 nm
c) Cinétiques à 433 nm
d) Cinétiques à 292 nm
e) Cinétiques à 440 – 424 nm
5) Oxymétrie résolue en temps
a) Séquences de dégagement d’oxygène
b) Cinétiques de dégagement d’oxygène
6) Etudes des propriétés thermodynamiques par thermoluminescence
7) Mesure des énergies d’activation
8) Caractérisation par Résonance Paramagnétique Electronique
a) Introduction : Cas de l’échantillon contrôle Ca/Cl dans l’état S2
i. Spectre à 4 K
ii. Spectre à 8,5 K
iii. Spectre à 15 K
b) Spectres à 4 K
c) Spectres à 8,5 K
d) Spectres à 15 K
III) DISCUSSION
CHAPITRE IV. ECHANGE BIOCHIMIQUE DU CHLORURE
I)MISE AU POINT D’UN PROTOCOLE D’ECHANGE BIOCHIMIQUE
1) Introduction
2) Dans des thylakoides
a) Comparaison des résultats obtenus sur les deux types d’électrode (45 minutes)
b) Résultats de thermoluminescence : 5 heures
c) Electrode résolue en temps : purification de cellules Sr/Br dans milieux Cl-
3) Dans le PSII
4) Conclusion
II) ETUDE DES PROPRIETES DE L’IODURE
1) Dégagement d’oxygène sous éclairement continu
2) Cinétiques de déclin du radical TyrZ
3) Séquences de dégagement d’oxygène
4) Cinétiques de dégagement d’oxygène
5) Courbes d’émission de thermoluminescence
6) Caractérisation par Résonance Paramagnétique Electronique
a) Résultats des échantillons biochimiquement modifiés
i. Eclairement à 200 K
i.i Echantillon Ca/Cl
i.ii Echantillon Ca/F
i.iii Sans halogénure
i.iv Echantillon Ca/I
ii. Eclairement par flashs
ii.i Après un flash
ii.ii Après deux flashs
ii.iii Après 3 flashs
7) Discussion
CHAPITRE V. STRUCTURE
I) ETUDE DU BLOCAGE DES ETATS SN EN FONCTION DE LA TEMPERATURE
1) Introduction
2) Méthodes de mesure
a) Transitions S1→S2 et S0→S1 : Résonance Paramagnétique Electronique
i. Protocole blocage S1 à S2
ii. Protocole blocage S0 à S1
b) Transitions S2→S3 et S3→S0 : Thermoluminescence
3) Résultats
a) Blocage S2→S3
i. Dépendance en température de la transition S2→S3 dans les thylakoides
ii. Dépendance en température de la transition S2→S3 dans le PSII
iii. Effet du pH sur la dépendance en température de la transition S2→S3
b) Blocage S3→S0
c) Blocage S1→S2
d) Blocage S0→S1
e) Mise en évidence d’un « split » signal par RPE dans le PSII Sr/Br
4) Discussion
II) ETUDE DE LA FIXATION DES MOLECULES D’EAU SUBSTRAT
1) Introduction
2) Matériel et méthode
a) Principe
b) Matériel
c) Analyse des résultats
3) Résultats
4) Discussion
III) STRUCTURE PAR CRISTALLOGRAPHIE AUX RAYONS X
1) Introduction
2) Publication
IV) DISCUSSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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