Typage et sous-typage du genre Salmonella basé sur le polymorphisme des loci CRISPR

TAXONOMIE

   Les bactéries du genre Salmonella appartiennent à la famille des Enterobacteriaceae. Ce sont des bacilles à coloration de Gram négative, aéro−anaérobies facultatifs, souvent mobiles grâce à une ciliature péritriche, prototrophes, capables de produire de l’H2S à partir du thiosulfate et réduisant les nitrates en nitrites. Ce genre rassemble des bactéries reliées entre elles selon des caractéristiques phénotypiques et génotypiques. Le contenu en G+C de l’ADN de Salmonella est compris entre 50 et 52 % comme Escherichia, Shigella et Citrobacter et le genre est défini comme un groupe d’hybridation ADN−ADN dont les membres ont des ADN hybridant à plus de 80 %. En 1963, Kauffmann divise le genre en quatre sous−genres : I, II, III et IV. La plupart des souches de salmonelles isolées de l’Homme et des vertébrés à sang chaud appartiennent au sous genre I. Les sous genres II et III (appelés aussi Arizona) sont très proches et leur différence mise en doute. Avec le sous genre IV, ils sont le plus souvent associés aux reptiles chez qui ils sont pour la plupart commensaux. En 1972, Edwards et Ewing proposent une autre définition taxonomique dans laquelle le genre Salmonella est limité au sous genre I de Kauffmann, le sous genre III devenant Arizona et les souches des sous genres II et IV étant considérées comme des atypies des deux autres. La nomenclature du genre Salmonella a souvent été sujette à controverses puisqu’elle ne suit pas les règles du système international de nomenclature des bactéries. Au départ, les bactéries identifiées étaient nommées selon la pathologie associée : S. typhi (typhoïde), S. paratyphi (bacille paratyphique), S. abortus−ovis(agent causal de l’avortement chezla brebis), S. typhimurium (pathogène murin), etc. Lorsque le caractère ubiquiste des différents sérotypes fut établi (S. typhimurium, S. bovis−morbificans), le choix du nom des nouveaux sérotypes identifiés fut basé sur le lieu de primo identification de la bactérie (S. london, S.panama, S. stanleyville) et ce pour toutes les souches du sous genre I. En 1970, Le Minor, Rohde et Taylor proposent de diviser le genre en quatre espèces correspondant aux sous genres de Kauffmann : kauffmannii (I), salamae (II), arizonae (III) et houtenae (IV). Depuis l’hybridation ADN−ADN a mis en évidence que le genre était en fait divisé en deux espèces distinctes : enterica et bongori, l’espèce enterica étant elle−même sous divisée en six sous− espèces : enterica (I), salamae (II), arizonae (IIIa), diarizonae (IIIb), houtenae (IV) et indica (VI). La définition actuelle du genre Salmonella est basée sur ses caractères biochimiques (tableau 1). Les noms des nouveaux sérotypes de la sous−espèce enterica correspondent à laville où ils ont été isolés, doivent être écrits avec une majuscule et précédés du genre de l’espèce et de la sous espèce en italique ; S. typhi devient ainsi Salmonella enterica sous espèce enterica sérotype Typhi, qui peut s’abréger en S. enterica sérotype Typhi ou S. Typhi. Pour les autres sous espèces et l’espèce bongori, le sérotype est désigné par la formule antigénique. Cette nomenclature a définitivement été acceptée en 2005 (4).

LYSOTYPIE

  Au sein d’un même sérotype de Salmonella, la sensibilité à certains bactériophages peut varier, ce qui a permis la mise au point de différents schémas de lysotypie (1). En 1938, Craigie utilise une collection de variants du phage Vi II pour typer les souches exprimant l’antigène capsulaire Vi (S. Typhi, S. Paratyphi C et certaines S. Dublin). D’autres schémas ont suivi pour les sérotypes Paratyphi B (22) et Typhimurium (Anderson, 1964). Jusqu’au début des années 2 000, la lysotypie fut considérée comme, un marqueur épidémiologique majeur pour les sérotypes Typhi (96 lysotypes) et Typhimurium (200 lysotypes). Malgré l’abandon de la méthode au profit des méthodes moléculaires, les lysotypes prévalents restent ancrés dans le langage commun, le plus connu étant le DT104 de Typhimurium, clone majoritaire connu pour sa pentarésistance aux antibiotiques.

IS200

  La séquence d’insertion IS200 est un autre marqueur spécifique chez le genre Salmonella (23b). Cette séquence d’insertion de 708 paires de bases (pb) est présente et répétée plusieurs fois le long du génome des salmonelles en fonction du sérotype. Le nombre de copies et leur localisation sur le chromosome sont très peu variables donccaractéristiques d’une souche de Salmonella. Le profil IS200 est obtenu par hybridation à l’aide d’une sonde ciblant la séquence d’insertion après restriction de l’ADN et transfert sur membrane selon Southern. Jusqu’au début des années 2 000, cette méthode est souvent combinée à l’électrophorèse en champ pulsé et la ribotypie pour les caractérisations moléculaires de certaines populations comme les sérotypes Paratyphi B ou Typhi (24, 25).

ELECTROPHORÈSE EN CHAMPS PULSÉ (PULSED FIELD GEL  ELECTROPHORESIS-PFGE)

   Ce type d’électrophorèse a été développé par Schwartz et Cantor en 1984 afin de séparer les grandes molécules d’ADN (> 50 kb) que l’électrophorèse classique en gel d’agarose ne permet pas de résoudre. La macrorestriction est basée sur l’utilisation d’enzymes à sites de coupures rares afin d’obtenir après migration des profils permettant dediscriminer les souches d’un même sérotype entre elles. Pour augmenter le pouvoir discriminant de la méthode, il est possible d’utiliser plusieurs enzymes de restrictions et de comparer les profils combinés pour étudier une population particulièrement homogène. Cette technique est actuellement la méthode de référence en matière de sous typage du genre Salmonella et est devenu un outil de surveillance en temps réel des épidémies de salmonelloses via le réseau PulseNet réunissant les agences de santé publique et les laboratoires de contrôle alimentaire qui soumettent leurs profils dans une base de données internationale grâce à un protocole standardisé (26). Cette méthode connaît quand même certaines limites à commencer par son temps d’exécution et l’impossibilité de l’automatiser, ce qui allonge le délai de mise en place de mesures de contrôle d’une épidémie (retrait/destruction de la source alimentaire en cas de TIAC). L’interprétation des profils peut aussi varier d’un laboratoire à un autre et certains sérotypes ne sont pas typables par cette méthode (lyse de l’ADN).

MULTI-LOCUS SEQUENCE TYPING (MLST)

  Le typage MLST consiste à cibler directement la variation nucléotidique de différents gènes de ménage. En règle générale, les schémas en comptent sept car augmenter le nombre de gènes ne permet pas d’augmenter le nombre de génotypes par le séquençage direct de partie interne de ces gènes (31). Cette méthode est dérivée de l’analyse des isoenzymes ou MLEE (multilocus enzyme electrophoresis) qui se base sur les variations de la mobilité électrophorétique de certaines enzymes bactériennes (isoenzymes) (32). L’avantage majeur du séquençage est que c’est une technologie générant des données non ambigües pouvant être stockées et partagées électroniquement et donc échangeables entre les différents laboratoires du monde entier (http://pubmlst.org; http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/). L’analyse des données MLST n’utilise pas les séquences directement mais un code allélique. En effet, pour un locus donné, chaque séquence unique se voit assigné un numéro d’allèle. L’ensemble des numéros d’allèle de tous les loci sont combinés pour former un profil allélique (séquençotype−ST). Deux souches proches auront le même profil ou des profils ne variant que sur un ou deux loci alors que des souches éloignées n’auront pas d’allèle commun ou très peu. Un schéma MLST basé sur sept gènes de ménage (aroC, dnaN, hisD, hemD, purE, sucA, thrA) a d’abord été développé pour l’étude évolutive du sérotype Typhi (33) puis testé sur 110 isolats représentant 25 sérotypes de la sous espèce enterica (34). S’en sont suivi plusieurs études sur les sérotypes Newport (35), Typhimurium (36) et d’autres sérotypes qui ont mis en évidence une corrélation en le séquençotype et le sérotype. Cette méthode a même été proposée comme substitut possible au sérotypage grâce à une étude d’Achtman et al portant sur 4 257 souches de 554 sérotypes représentant une diversité de 1 092 séquençotypes (37, Figure 2).

Table des matières

RESUME
ABSTRACT
LE GENRE SALMONELLA
I. UN PEU D’HISTOIRE
I.1. Découverte
I.2. Taxonomie
II. DES SALMONELLES ET DES HOMMES
II.1. Habitat
II.2. Pathologie
II.3. Epidémiologie
III. REVUE DES DIFFERENTES METHODES DE SOUS-TYPAGE DU GENRE SALMONELLA 
III.1. Lysotypie
III.2. Ribotypie
III.3. IS200
III.4. Electrophorèse en champs pulsé (Pulsed Field Gel Electrophoresis-PFGE)
III.5. Analyse Multi-locus Variable Number Tandem Repeats (MLVA)
III.6. Multi-Locus Sequence Typing (MLST)
CLUSTERED REGULARLY INTERSPACED SHORT PALINDROMIC REPEATS (CRISPR)
I. ORGANISATION DES LOCI CRISPR
I.1. Répétions-DR
I.2. Spacers
I.3. Transmission par transfert horizontal
I.4. Séquence leader
II. LES GENES cas
II.1. Gènes « core »
II.2. Gènes « non-core »
II.3. Protéines RAMP (Repair-Associated Mysterious Proteins)
III. CLASSIFICATION DES SYSTEMES CRISPR/cas
III.1. Type I
III.2. Type II
III.3. Type III
IV. IMMUNITE ADAPTATIVE
V. APPLICATIONS
V.1. Modification des défenses contre les virus
V.2. Inactivation d’un gène
V.3. Typage
TRAVAUX PERSONNELS
PUBLICATION 1
PUBLICATION 2
PUBLICATION 3
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXES

Télécharger le rapport complet