Soutenance mémoire
Tumeurs de l’ovaire chez la femme
Le facteur GILZ dans le microenvironnement des tumeurs épithéliales de l’ovaire:
Le gène GILZ (Glucocorticoïd-induced leucine zipper) a été isolé à partir d’une banque de soustraction d’ADNc de thymus, comme un gène de réponse à la dexaméthasone. La protéine GILZ appartient à la famille des leucine zipper. Les leucine zipper sont le plus souvent des facteurs de transcription. Ces molécules sont constituées de deux hélices a anti-parallèles qui s’enroulent l’une autour de l’autre (sous forme d’un super enroulement gauche) de telle façon que des résidus leucine se retrouvent en face l’un de l’autre.Le gène GILZ est exprimé dans les tissus lymphoïdes et son expression est augmentée par la dexaméthasone. La surexpression de GILZ dans la lignée lymphoïde murine 3DO inhibe l’apoptose induite par le TCR via une downrégulation de l’expression de Fas/FasL16.GILZ inhibe l’expression du couple IL2/IL2R induite par le TCR ainsi que l’activité de NFkB en bloquant la translocation au noyau et la liaison à l’ADN par une intéraction directe protéine-protéine GILZ/ NFkB17.En l’absence d’inflammation, le gène GILZ est exprimé de façon constitutive dans les tissus non lymphoïdes dans lesquels les macrophages sont la principale source de GILZ. En désactivant les macrophages et les CPA, les glucocorticoïdes (GC) et l’IL-10 abolissent l’inflammation et favorisent la tolérance immune. Ces effets pourraient être médiés par GILZ.En effet l’IL-10 et les GC induisent GILZ dans les macrophages et GILZ inhibe l’expression de CD80 et CD86 dans ces cellules18. L’expression des molécules de co-stimulation CD80 et CD86 dans la phase de présentation de l’antigène aux lymphocytes est nécessaire à l’activation des lymphocytes T : en l’absence de CD80 et CD86, la présentation antigénique aboutit à l’anergie des lymphocytes T ou à leur apoptose. D’autre part GILZ inhibe l’activation des macrophages par CD40 et l’activation des CPA par CD40 est une autre étape importante dans l’équilibre entre l’activation immune et l’induction d’une tolérance. Par conséquent, en inhibant l’expression de CD80 et CD86 dans les macrophages et l’activation de ces cellules par CD40, GILZ pourrait induire une tolérance plutôt que l’activation des lymphocytes T18. Les macrophages infiltrant la tumeur (modèle du lymphome de Burkitt) expriment GILZ et cela pourrait contribuer à l’établissement d’une tolérance vis-à-vis de la tumeur et donc à l’échappement tumoral.Dans les tumeurs épithéliales de l’ovaire GILZ pourrait contribuer à l’induction d’une tolérance vis-à-vis de la tumeur. Nous avons recherché l’expression de GILZ dans les tumeurs ovariennes. Nous avons cherché à savoir si les cellules tumorales dans les tumeurs épithéliales de l’ovaire expriment GILZ et si elles l’expriment, quels sont les facteurs modulés par GILZ.
Pour cela nous avons choisi la lignée d’adénocarcinome humain SKOV-3. Nous avons également disposé d’échantillons de tumeurs épithéliales ovariennes de différents degrés de malignité prélevées à l’hôpital Antoine Béclère et de la Pitié Salpêtrière. Sur la période de novembre 2004 à juin 2005, nous avons obtenu des prélèvements de tumeurs épithéliales de l’ovaire à partir de 12 patientes de l’hôpital Antoine Béclère, et sur la période de février 2004 à décembre 2004, nous avons obtenus des prélèvements de tumeurs épithéliales de l’ovaire à partir de 7 patientes de l’hôpital La Pitié Salpêtrière.
Matériel et méthodes
Mise en culture des cellules
Le modèle cellulaire utilisé dans notre étude est la lignée cellulaire humaine SKOV-3 (ATCC®), cellules épithéliales d’adénocarcinomes de l’ovaire.Toutes les étapes de la mise en culture se déroulent dans une enceinte stérile.Les cellules sont ensemencées en milieu RPMI 1640 + Glutamax I (Gibco, cat. 61870-010).Le milieu est enrichi de 10% de Sérum de Veau Foetal inactivé (SVF, Perbio, cat. CH30160.03). Enfin 1% d’antibiotiques (Penicillin-Streptomycin, Gibco, cat. 15140-122) est ajouté au milieu.
Transfection SiRNA GILZ
Principe : Les cellules SKOV-3 sont traitées par un plasmide SiRNA GILZ afin de détruire les ARNm GILZ ou par un plasmide témoin SiRNA random. Ces plasmides entrent dans les cellules grâce au procédé d’électroporation Amaxa. L’efficacité de transfection est évaluée à l’aide d’un plasmide GFP.
– RNA Silencing : Les molécules de SiRNA (short interfering RNA) induisent l’extinction spécifique de gènes par le processus d’interférence avec l’ARN (RNAi) chez de nombreux organismes, dont l’homme. Le RNAi est un processus biologique. L’injection de séquences d’ARN double brin (dsARN) induit la dégradation des ARNm qui contiennent la même séquence que le dsARN injecté. La machinerie cellulaire découpe le dsARN en fragments de 21 à 28 nucléotides de longueur qui guident un complexe protéique aux ARNm cibles (cf. fig.4). L’introduction de dsARN dans les cellules somatiques de mammifères induit une réponse interféron de type I, qui aboutit souvent à la mort cellulaire. Des versions synthétiques des SiRNAs sont, elles, efficaces pour éteindre un gène19. Une fois que les SiRNAs sont introduits dans les cellules de mammifères , les ARNm correspondants diminuent classiquement en 24-48h. Il existe néanmoins une grande variabilité dans les temps d’extinction de la protéine, dépendant du type cellulaire, de la demi-vie de la protéine, de l’efficacité de transfection.
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Table des matières
Table des matières
Introduction
I Microenvironnement des tumeurs épithéliales de l’ovaire chez la femme et rôle potentiel de GILZ dans ces tumeurs
1 Tumeurs de l’ovaire chez la femme
1.1 Epidémiologie
1.2 Histologie
1.3 Evolution anatomique et stadification
1.4 Traitement
2 Tolérance immunitaire vis-à-vis de la tumeur et microenvironnement des tumeurs épithéliales de l’ovaire
2.1 Expression de B7H1 dans les tumeurs épithéliales de l’ovaire
2.2 Infiltration de lymphocytes T régulateurs dans les tumeurs épithéliales de l’ovaire
2.3 Chimiokines du microenvironnement des tumeurs épithéliales de l’ovaire et tolérance immunitaire
3 Le facteur GILZ dans le microenvironnement des tumeurs épithéliales de l’ovaire
II Matériel et méthodes
1 Mise en culture des cellules
2 Transfection SiRNA GILZ
3 Microdissection
4 Extractions des ARN totaux et obtention de l’ADNc
4.1 Extraction des ARN totaux
4.2 Obtention de l’ADNc
5 Mise en évidence des ADNc
5.1 PCR
5.2 PCR quantitative
6 Cytométrie en flux
7 Immunohistochimie
III Résultats
1 Mise en évidence de GILZ dans la lignée SKOV-3 de cellules épithéliales d’adénocarcinome de l’ovaire
1.1 Expression des transcrits de GILZ par RT-PCR
1.2 Expression de GILZ cellulaire
2 Transfection de la lignée SKOV-3 avec un SiRNA GILZ
2.1 Vérification de l’extinction du signal GILZ en RT-PCR après transfection avec un SiRNA GILZ
2.2 Effet de l’extinction du signal GILZ sur l’expression des transcrits du VEGF
2.3 Effet de l’extinction du signal GILZ sur l’expression des transcrits de CXCL12
2.4 Effet de l’extinction du signal GILZ sur l’expression des transcrits de B7H1
3 Expression de GILZ dans des échantillons de tumeurs épithéliales de l’ovaire
3.1 Expression des transcrits de GILZ par RT-PCR
3.2 Expression de GILZ par immunohistochimie
4 Expression parallèles de GILZ et CXCL12 dans des échantillons de tumeurs épithéliales de l’ovaire
4.1 Expression de CXCL12 par RT-PCR
4.2 Expression de CXCL12 par immunohistochimie
5 Expression des transcrits de GILZ dans des échantillons de tumeurs après microdissection
6 Résumé des résultats
IV Conclusions et perspectives, place des modèles animaux dans cette étude
1 GILZ dans le microenvironnement tumoral
2 GILZ dans les cellules tumorales
2.1 Facteurs à l’origine de l’expression de GILZ dans les cellules tumorales
2.1.1 GILZ et estrogènes
2.1.2 GILZ et déméthylation
2.2 GILZ et production de CXCL12
2.2.1 Mécanismes moléculaires du contrôle de CXCL12 par GILZ
2.3 Conséquences d’une diminution de CXCL12 dans les tumeurs ovariennes
2.4 GILZ et survie
3 Développement d’un modèle in vivo pour l’étude de GILZ
3.1 Modèle existant pour l’étude de GILZ : souris transgéniques pour GILZ
3.1.1 Génération des souris transgéniques
3.1.2 Résultats de l’étude de DELFINO
3.2 Critères pour le choix des modèles in vivo pour l’étude de GILZ dans les cellules tumorales et les cellules présentatrices d’antigène
3.2.1 Souris immunodéficientes utilisables pour la xénotransplantation
3.2.1.1 La souris Nude
3.2.1.4 La souris scid
3.2.1.5 La souris Rag1
3.2.2 Modèles in vivo utilisés dans des études de tumeurs épithéliales de l’ovaire
3.3 Description des modèles in vivo pour l’étude de GILZ dans les cellules tumorales et les cellules
présentatrices d’antigène
Conclusion
Bibliographie
Annexes
Table des figures et des tableaux
Liste des principales abréviations
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