Travaux chimiques anterieurs sur les espèces du genre Lygodium

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Travaux biologiques antérieurs

Les extraits de L. japonium ont des activités antimicrobienne et antivirale. Ils ont aussi une action dans la protection du foie, un bon effet sur l’infection des voies urinaires et le calcul urinaire [6] [8]. Les racines et les feuilles de L. flexuosum et L. venustum inhibent l’action des bactéries [9] [10]. Le décocté d’environ 1 litre provenant de 2 poignés de frondes fertiles de L. microphyllum est employé pour traiter les rhumatismes [11]. Les tiges sont utilisées pour le tissage en artisanat et sa feuille a une activité antidiarrhéique [3].

L’espèce Lygodium lanceolatum

Description

Lygodium lanceolatum est une plante à rhizome pointu, rachis à croissance indéfinie. Ses branches alternes portent une paire de pennes et un bourgeon avorté. Les pennes sont espacées d’environ de 10 cm, pétiole de 2 cm de large et de longueur 10 cm. Elles sont divisées en 2 et 3 paires de pinnule. Ces derniers ont une longueur de 6 à 7 cm, sur 1 cm de large à base cunéiforme tronquée à pétiole long de 0,3 à 0,5 cm.
Les feuilles ont une texture coriace et brillante, des nervures réticulées, des porophores de longueur 0,5 cm [5].
Comme toutes les espèces du genre Lygodium, L. lanceolatum sont caractérisées par des feuilles volubiles, à croissance indéfinie, grimpant sur la végétation voisine. Ces feuilles se développent précocement et assurent les fonctions aussi bien végétatives que reproductives, avec des spores produites dans des porophores latéraux dans la partie supérieure de la fronde (figure2) [12].

Utilisation traditionnelle

Selon l’enquête réalisée dans la campagne d’Anjozorobe, la décoction des tiges et des feuilles est utilisée pour diminuer la fatigue musculaire. Ce fait est nommé « ody enjana ». La décoction de feuilles broyées se prend pour empêcher la stimulation ou contraction musculaire. Elle inhibe aussi la présence de la crampe.

Les Triterpènes

Définition

Les triterpènes appartiennent à la famille des terpènes. Ce sont des composés qui résultent de la condensation des six unités isoprènes (C5H8). Presque toujours hydroxylés en 3 [13] [14], il peut y avoir des fonctions: alcools, acides, carbonyles, lactones, époxydes. Au moins, 4000 composés triterpéniques avec des squelettes hydrocarbonés différents sont connus. Ils existent souvent chez les plantes sous forme de saponines qui comprennent les aglycones, triterpènes hydrophobes appelés sapogénines, et un ou plusieurs résidu(s) de sucre hydrophiles, sous formes estérifiées ou hétérosidiques. Les triterpènes présentent une très forte unité structurale, les différences majeures étant d’ordre configurationnel et liées à la conformation adoptée par l’époxy-squalène (ou le squalène) avant la cyclisation [14]. Il existe des triterpènes acycliques, monocycliques, bicycliques, tricycliques, tétracycliques (cucurbitacines, dammaranes, lanostanes) ou pentacycliques (oléananes, ursanes, lupanes, friedelanes) [13]. Les triterpènes pentacycliques sont des molécules constituées soit de cinq cycles à six carbones, soit de quatre cycles à six carbones et un cycle à cinq carbones selon les modes de cyclisation du précurseur l’époxydo-2, 3-squalène.

Biosynthèse des triterpènes

Les triterpènes sont des dérivés du squalène. Ils sont issus de la cyclisation du 2,3- époxysqualène catalysée par l’oxydosqualène cyclase. La diversité moléculaire de cet enzyme permet la synthèse de plus de 100 squelettes variés de triterpènes chez les plantes. Les différences majeures entre ces différents squelettes sont d’ordre stéréochimique. L’orientation de la synthèse vers les stéroïdes ou vers les autres triterpènes dépend de la conformation initiale adoptée par l’oxydosqualène sur la surface de l’enzyme.
La cyclisation de l’oxydosqualène est initiée par l’ouverture de l’époxyde suite à une attaque d’un électrophile provenant de l’enzyme sur l’époxyde. Par la suite, les doubles liaisons s’additionnent les unes aux autres pour former l’intermédiaire cationique.
En effet, l’oxydosqualène adopte la conformation chaise-chaise-chaise-bateau, la cyclisation aboutit à un autre cation appelé dammarényl qui le plus souvent se réarrange en formant un cycle supplémentaire donnant naissance aux triterpènes pentacycliques de type oléanane, ursane, lupane, friedelane [15] (figure 3).

Intérêts biologiques des triterpènes

L’utilisation industrielle et l’intérêt thérapeutique des triterpènes représentent un enjeu capital dans le domaine de la recherche des substances naturelles. Ils appartiennent au groupe de métabolites secondaires de grande importance.
En effet, ils possèdent :
– des potentialités thérapeutiques dans les différents domaines : cytostatiques, antiinflammatoires, analgésiques, insecticides. Les molécules bioactives peuvent être sous forme galénique simple ou de préparation phytothérapique.
– un intérêt considérable dans le secteur de l’industrie pharmaceutique particulièrement la production de médicaments stéroïdiques ayant des propriétés contraceptives et antiinflammatoires. Une importance économique du fait de leur utilisation dans les industries [13].

Chromatographie

Plusieurs techniques sont employées pour les fractionnements des mélanges, mais pour notre cas les techniques chromatographiques ont été les plus employées.
La chromatographie est une méthode de séparation des constituants d’un mélange [16] [17]. La chromatographie sur couche mince et la chromatographie sur colonne ont été les plus utilisées dans ce mémoire.

La chromatographie sur couche mince

La chromatographie sur couche mince, ou sur plaque (CCM), est effectuée surtout en vue d’une analyse d’un mélange. Elle est basée sur les différences d’affinité des substances à l’égard de deux phases, l’une stationnaire ou fixe, l’autre mobile [16]. La phase stationnaire solide est fixée sur une plaque (aluminium, plastique), et la phase mobile liquide, nommée éluant, est un solvant ou un mélange de solvants.
On dépose sur la phase fixe une petite quantité du mélange à séparer et on la met au contact avec l’éluant.
L’éluant migre de bas en haut, par capillarité, le long de l’adsorbant en entraînant les constituants du mélange. C’est le phénomène d’élution, qui permet la séparation des constituants du mélange à analyser [18].
Chaque constituant migre d’une certaine hauteur, caractéristique de la substance, que l’on appelle rapport frontal ou rétention frontale ( )
Chaque tache correspond à un constituant et on peut l’identifier par comparaison de la valeur du Rf avec un témoin.

RMN monodimensionnelle (RMN 1D)

 RMN 1H
Le spectre RMN proton est une méthode puissante utilisée dans la détermination structurale des composés organiques inconnus. Chaque proton de la molécule est caractérisé par son déplacement chimique et par sa multiplicité issue des couplages scalaires (spin –spin) [21].
 Le déplacement chimique
La position des différentes raies du spectre RMN 1H est déterminée par rapport à une référence, souvent le tétraméthylsilane (TMS). Le déplacement chimique noté δ est exprimé en partie par million (ppm). Il est compris entre 0 et 15 ppm environ [22]. Si un signal sort à un champ voisin de celui de la référence : il est blindé. Inversement, Si un signal sort à un déplacement chimique élevé : le signal est déblindé. Le déplacement chimique nous donne donc des indications sur l’environnement chimique du groupe auquel appartient le proton considéré [22].
 Nombre de protons
Dans un spectre de RMN 1H, l’intensité d’un signal est mesurée par sa surface. L’intégration des surfaces des signaux se présente sous la forme d’une série de paliers. La hauteur de chaque palier est proportionnelle au nombre de protons correspondants.
 Les couplages
Les protons portés par un même carbone ou des atomes adjacents vont présenter des couplages spinspin. Le couplage ne peut avoir lieu qu’entre protons magnétiquement différents. Le couplage avec un autre proton se traduit par la formation d’un doublet, avec 2 protons par un triplet etc… Lorsqu’un hydrogène possède n hydrogènes voisins équivalents entre eux, son signal apparait sous la forme d’un multiplet à (n+1) pics.
 Spectre RMN 13C
Cette technique permet de mettre en évidence tous les carbones de la molécule s’il n’a pas de symétrie. L’analyse se base sur les déplacements chimiques observés en fonction de l’environnement de chacun des atomes de carbone. Les déplacements chimiques des 13C sont compris entre 0 et 250 ppm.
 Le spectre DEPT 135 (Distortionless Enhanced Polarisation Transfert)
L’expérience DEPT 135 est une analyse des noyaux 13C ayant comme avantage de permettre de distinguer les divers types de carbones en fonction de leurs couplages aux protons qu’ils portent. Ainsi, les carbones primaires et tertiaires apparaissent du côté positif du spectre alors que les carbones secondaires apparaissent du côté négatif du spectre ou inversement. Le carbone quaternaire n’apparait pas sur le DEPT 135 [21].

RMN bidimensionnelle (RMN 2D)

La RMN bidimensionnelle est une technique qui permet de montrer les corrélations existant entre proton-proton (corrélation homonucléaire) ou proton-carbone (corrélation hétéronucléaire). Il permet aussi de déterminer l’enchainement de la structure [23].
 Corrélation homonucléaire
 1H-1H COSY (Correlated SpectroscopY)
L’expérience 2D COSY montre les couplages scalaires entre les protons géminés ou les protons vicinaux. Cette expérience permet de déterminer l’environnement de chaque proton de proche en proche tout au long de la molécule. Le spectre RMN 1H apparait sur la diagonale. Les contours en dehors de la diagonale sont les pics de corrélation. Ils sont symétriques de part et d’autre de la diagonale.
 Corrélation hétéronucléaire
 1H-13C HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation)
Dans l’analyse 2D HSQC, la première dimension montre les déplacements chimiques des protons et la deuxième dimension ceux des carbones auxquels ils sont directement liés. Une tache de corrélation se situe à l’intersection de la fréquence du proton et celle du carbone qui le porte. Cette analyse donne donc les corrélations 1J 1H-13C.
 1H-13C HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation)
C’est une expérience qui permet de détecter les couplages scalaires entre un proton et les carbones en 2J, 3J et 4J [20].

Généralités sur les tests d’activités

Test antioxydant

 Définition
L’oxydation fait partie d’une réaction d’oxydoréduction qui transfère des électrons d’une substance vers un agent oxydant. Elle peut produire des radicaux qui entraînent des réactions en chaîne destructrices. Les antioxydants sont capables d’arrêter ces réactions en chaîne en se réduisant avec les radicaux et annihilant ainsi leur action [24].
Les antioxydants sont des composés chimiques capables de minimiser efficacement les rancissements, retarder la peroxydation lipidique, sans effet sur les propriétés nutritionnelles du produit alimentaire. Ils permettent le maintien de la qualité et l’augmentation de la durée de conservation du produit.
L’antioxydant alimentaire idéal, doit être soluble dans les graisses, efficace à faible dose, et non toxique, n’entraine ni coloration, ni d’odeur, ni saveur indésirable, résistant aux processus technologiques, il est stable dans le produit fini [25] [26].
Les antioxydants sont utilisés dans plusieurs domaines pour éviter:
 le durcissement du caoutchouc ou en métallurgie pour protéger les métaux de l’oxydation dans l’industrie chimique.
 le rancissement des corps gras dans l’industrie agro-alimentaire.
 l’oxydation des colorants au soufre ou des colorants de cuve lors de la teinture dans l’industrie de teinturerie [27].
 Test de l’activité antioxydante
Des nombreuses méthodes sont employées pour l’évaluation de l’activité antioxydante des composés purs ou des extraits. La plupart de ces méthodes sont basées sur la coloration ou la décoloration d’un réactif dans le milieu réactionnel. Dans notre étude nous avons utilisé l’effet sur le radical 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle (DPPH) (figure 4).
Il possède un électron non apparié sur un atome du pont d’azote. Du fait de cette délocalisation, les molécules du radical ne forment pas des dimères (DPPH•) et conservent la forme monomère relativement stable à température ordinaire. La délocalisation provoque aussi la couleur bleu violet bien caractéristique de la solution de DPPH•. Le DPPH est réduit en 2,2-diphenyl-1-pycrylhydrazine par un donneur d’hydrogène (substance antioxydante), sa coloration violette devient jaune pâle à la plaque CCM. L’intensité de la coloration étant proportionnelle au nombre de radicaux libres réduits [25] (figure 5).
 Définition
La notion de fatigue est une expression très largement utilisée dans le langage courant. Elle peut tout aussi bien renvoyer à un état de somnolence au repos, une altération des performances cognitives autour d’une tâche intellectuelle, un manque de motivation ou une sensation de douleur musculaire durant des activités physiques de la vie quotidienne [28]. La fatigue se traduit par une baisse d’énergie et une incapacité à soutenir durablement un effort tant physique que mental [29]. Il existe plusieurs types de fatigue : nerveuse, chronique, réactionnelle et musculaire.
Tout au long du travail, nous avons principalement abordé la fatigue au travers de la diminution de la production de force induite par un exercice musculaire, que cette diminution soit liée ou non à une altération des capacités contractiles du muscle.
On parle de fatigue musculaire pour désigner une faiblesse au niveau des muscles que peut ressentir un individu. Elle peut provenir de plusieurs causes. La raison principale de la fatigue musculaire est un effort physique de forte intensité sur une longue ou une courte durée. Cette activité musculaire a pour résultat une perte de fluides organiques, des courbatures et un état hypoglycémique [W5].
Il existe des moyens pour lutter contre la fatigue. Dans ce travail, le test antifatigue sur la souris sera realisée.
 Test antifatigue
Le but est d’évaluer l’effet des extraits sur la souris après une activité physique.
Ce test consiste à suspendre les souris par leurs pattes antérieures à la barre fixe tandis que les pattes postérieures ont été attachées ensemble pour qu’elles ne participent pas à l’agrippement. La durée qu’elle a mise pour lâcher la barre a été chronométrée.

Test antimicrobien

 Définition
Les bactéries sont des êtres vivants qui appartiennent à un groupe Procaryote. Ce sont des organismes unicellulaires simples de petite taille appelés Procaryote qui ne contiennent pas de noyaux et qui sont d’habitude trouvés en très grand nombre parce qu’ils peuvent se multiplier rapidement. Les bactéries causant des maladies sont pathogènes. L’homme peut être infecté par les aliments ou les boissons qu’il consomme. La taille d’une bactérie varie entre 1 à 10 μm. Son poids est d’environ 10-12 g. Elle contient70% d’eau. Rapporté au poids sec, une bactérie est constituée de protéines (55%), de lipides (10%), de lipopolysaccharides (3%), de peptidoglycane (3%), de ribosomes (40%), d’acide ribonucléique (20%) et d’acide désoxyribonucléique (3%) [W6] [W7]. Il existe deux types de bactéries selon la coloration Gram: bactérie à coloration à Gram positif et bactérie à coloration à Gram négatif. La coloration Gram est fondée sur l’action successive d’un colorant, le cristal violet, de l’iode puis d’un mélange d’alcool et d’acétone (Christian Gram 1884). Son intérêt est de donner une information rapide et médicamenteuse importante, car le pouvoir pathogène et la sensibilité aux antibiotiques sont radicalement différents.
 Test antimicrobien
Les tests antimicrobiens ont été évalués sur des souches par la méthode de disque d’agar. Cette méthode permet de mettre les extraits en contact avec les bactéries ensemencées en nappe. L’extrait diffuse sur le milieu d’une façon radiale, sa concentration diminue à mesure qu’il s’éloigne de sa source, il se forme ainsi un gradient de concentration. Dans le cas où la souche testée est sensible au produit une zone circulaire d’inhibition de croissance appelée « halo d’inhibition » apparait autour des disques.

Criblage phytochimique

Le criblage phytochimique est la première étape de l’étude chimique qui consiste à mettre en évidence de façon qualitative les différentes familles chimiques susceptibles d’être contenues dans la plante grâce à des réactions conduisant :
-soit à la formation de précipitation -soit à la formation de coloration

Criblage des alcaloïdes

Environ 5 g de poudre des feuilles sèches sont macérés dans 30 ml d’HCl à 12% pendant 15 minutes. Le mélange est filtré sur coton et le filtrat obtenu est divisé dans 4 tubes à essais. Le premier tube sert de témoin. On ajoute 5 gouttes de réactif de Wagner dans le deuxième ;
R (%) = × 100
5 gouttes de réactif de Mayer dans le troisième tube et 5 gouttes de réactif de Dragendorff dans le quatrième tube. Pour chaque tube, si un précipité apparaît, le test serait positif.

Criblage des flavonoïdes et leucoanthocyanes

Pour le criblage des flavonoïdes et leucoanthocyanes, une masse de 0,05 g d’extrait brut est placée dans un cristallisoir. Cet extrait est dépigmenté à l’hexane, puis le résidu est dissous dans de l’éthanol. La solution alcoolique est répartie dans 5 tubes à essais. Le premier tube sert de témoin. Dans le deuxième tube est ajouté 0,5 ml de HCl concentré et quelques graines de tournure de magnésium. Ce test est appelé : test de Wilstater. Après 10 minutes, la variation de la couleur dans le tube est observée : une couleur rouge indique la présence de flavones ; la variation de rouge à pourpre signifie la présence de flavonols ; si elle est rouge violacée, cela signifie la présence de flavanones et flavonols.
Dans le troisième tube, 0,5 ml de HCl concentré et quelques graines de tournure de magnésium sont également ajoutés. Après dissolution du magnésium, 1 ml d’eau et 1 ml d’alcool isoamylique sont additionnés au mélange. Une séparation de phases est observée et après 10 minutes, si la coloration de la phase supérieure est rouge, des flavones sont présents dans l’extrait; si elle est pourpre, il y a présence de flavonols. C’est le test de Wilstater modifié.
Dans le tube n° 4, il est ajouté 0,5 ml de HCl concentré. Le mélange est chauffé au bain marie pendant 30 minutes, puis laissé refroidi. Un virage de la coloration au rouge violacé indique la présence de leucoanthocyanes. Il s’agit du test de Bath Smith.
Au dernier tube, 0,5 ml de HCl concentré est versé puis laissé à la température ambiante. L’apparition d’une coloration rouge signifie la présence d’anthocyanes.

Criblage des tanins et polyphenols

Pour procéder au criblage des tanins et polyphénols, une petite quantité d’extrait hydroalcoolique sec est placée dans un cristallisoir. Un volume de 15 ml d’eau distillée y est versé, puis le mélange est chauffé tout en agitant. Ce mélange est additionné 4 gouttes de NaCl à 10%, puis filtré sur papier. Le filtrat est divisé dans 4 tubes à essais. Le premier tube sert de témoin. Dans le second tube est versé 5 gouttes de gélatine à 1%. L’apparition d’un précipité indique la présence de polyphénols. Pour détecter la présence de tanins, dans le troisième tube est ajouté 5 gouttes de gélatine salée. La formation de précipité indique que le test est positif. Dans le dernier tube est ajouté 5 gouttes de FeCl3 à 10 % dans du méthanol. Une coloration en bleu-vert indique la présence de tanins condensés (catéchiques ou flavanols-3 condensés et leucoanthocyanes ou flavanediols-3,4) ; une coloration noir bleuâtre indique la présence de tanins hydrolysables (galliques) ; s’il n’y a aucun changement de couleur, cela signifie une absence de tanins dans l’extrait.
Il est à noter qu’une réaction négative à la gélatine salée accompagnée d’une coloration vert ou bleu-noir avec FeCl3 signifie la présence d’autres types de composés phénoliques.

Criblage des stéroïdes et terpenoides

Pour détecter les stéroïdes et les terpénoïdes, une masse d’extrait sec de 3 g est dépigmentée à l’hexane. Après l’ajout de 10 ml de chloroforme, le mélange est agité. Après un repos de quelques minutes, il est séché avec du Na2SO4 anhydre et enfin il est filtré sur papier. Le filtrat ainsi obtenu est divisé dans 5 tubes à essais dont le premier sert de témoin.
Dans le deuxième tube est réalisé le test de Liebermann Burchard : y sont ajoutées 4 gouttes d’anhydride acétique puis 4 gouttes d’acide sulfurique concentré. Un virage de couleur en pourpre signifie la présence de triterpénoides tandis qu’une coloration en violet ou bleu-vert indique la présence de stéroïdes.
Le tube n°3 est incliné de 45°, puis de 1 ml d’acide sulfurique concentré y est versé goutte à goutte. Si l’anneau de séparation formé est de couleur rouge, cela indique la présence de stérols insaturés. C’est le test de Salkowski.
Un test de Badjet Kedde est réalisé dans le quatrième tube en y ajoutant quelques grains d’acide picrique. Des stéroïdes lactoniques sont présents dans l’extrait s’il y a virage de la coloration en rouge.
Finalement, dans le dernier tube sont versées trois gouttes de FeCl3 à 10% puis quelques gouttes d’acide acétique glacial. Le tube est ensuite incliné à 45° pour l’observation. Si l’anneau de séparation formé est de couleur rouge pourpre, cela signifie la présence de desoxy-2-sucre.

Table des matières

INTRODUCTION
GENERALITES ..
I-1-La Famille Lygodiacées
I -2-Le genre Lygodium
I-2-1-Description
I-2-2-Travaux chimiques anterieurs sur les espèces du genre Lygodium
I-2-3-Travaux biologiques antérieurs
I-3-L’espèce Lygodium lanceolatum
I-3-1-Description
I-3-2-Classification botanique
I-3-3-Utilisation traditionnelle
1-4-Les Triterpènes
1-4-1-Définition
1-4-2-Biosynthèse des triterpènes
1-4-3-Intérêts biologiques des triterpènes
I-5-Chromatographie
I-5-1-La chromatographie sur couche mince
I-5-2-La chromatographie sur colonne
I-6-Résonance Magnétique Nucléaire
I-6-1-RMN monodimensionnelle (1D)
I-6-2-RMN bidimensionnelle (2D)….
I-7-Généralités sur les tests d’activités
I-7-1-Test antioxydant
I-7-2-Test antifatigue
I-7-3-Test antimicrobien
MATERIELS ET METHODES
II-1-Matériels
II-1-1-Matériels techniques
II-1-2-Matériel végétal
II-2-Méthodes
II-2-1-Préparation de la plante
II-2-2-Préparation des extraits bruts
II-2-3-Criblage phytochimique
II-2-3-1-Criblage des alcaloïdes…
II-2-3-2-Criblage des flavonoïdes et leucoanthocyanes
II-2-3-3-Criblage des tanins et polyphénols
II-2-3-4-Criblage des stéroïdes et terpènoïdes..
II-2-3-5-Criblage des anthraquinones
II-2-3-6-Criblage des saponines
II-2-3-7-Criblage des polysaccharides
II-2-4-Extractions
II-2-5-Tests d’activités
II-2-5-1-Test antioxydant
II-2-5-2-Test antifatigue
II-2-5-3-Test antimicrobien.
II-2-6-Fractionnement de l’extrait hexanique
II-2-6-1-Chromatographie sur couche mince (CCM)
II-2-6-2-Chromatographie sur colonne
II-2-7- Détermination de structure des triterpènes
III-Résultats et discussions
III-1-Extractions
III-2-Criblage phytochimique
III-2-1-Résultats des tests des alcaloïdes
III-2-2-Résultat des tests des flavonoïdes et des leucoanthocyanes
III-2-3-Résultat des tests des tanins et des polyphenols
III-2-4-Résultat des tests des stéroïdes et des terpenoides
III-2-5-Résultat du test des anthraquinones
III-2-6-Résultat du test des saponines
III-2-7-Résultat du test des polysaccharides
3-Résultats des tests d’activités
III-3-1-Résultat du test antioxydant
III-3-2-Résultat du test antifatigue
III-3-2-1-Activité antifatigue de l’extrait hydroalcoolique
III-3-2-2-Activité antifatigue de l’extrait hexanique
III-3-2-3-Comparaison de l’activité des deux extraits
III-3-3-Résultats des tests antimicrobiens
III-4-Fractionnement et isolement
III-4-1-Résultat de la CCM
III-4-2-Résultat du fractionnement de l’extrait hexanique
III-5- Détermination de structure du produit 38
CONCLUSION
REFERENCES

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