TRAVAUX ANTERIEURS sur le genre Plocamium

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Polysaccharides de Phaeophyceae -algues brunes

Les algues brunes sont les principales sources d’al ginates et d’acide alginique (Bodard et al., 1983).
Dans cette classe, on trouve :
. Les polyuronides composés de deux unités d’acides roniques : les acides D-mannuroniques liés enβ-1,4- et les acides L-guluroniques liés enα-1,4-.
. Les fucoïdanes polymères du α-(1→2)-L-fucose-4-sulfate
. Les laminaranes ou β-1,3-glugane.
Leur chaîne présente un poids moléculaire de l’ordre de 800.000.

Polysaccharides de Rhodophyceae –algues rouges

Les algues rouges contiennent un taux considérable en galactanes sulfatés, ayant un poids moléculaire supérieur à 1.000.000 et caractérisés arp une répétition régulière de résidus galactopyranoses. Ces unités monomères sont liéeslternativement par des liaisons β-(1→4) et α-(1→3) (Kloareg et al., 1988).
Ces galactanes sont subdivisés eux-mêmes en deux groupes suivant la configuration des unités :
-les molécules du type carraghénane
-les molécules du type agar (Bruneton,1993).

Polysaccharides de Chlorophyceae –algues ver tes

Les polysaccharides d’algues vertes présentent une structure voisine de celle des polysaccharides des végétaux supérieurs, amylose ou amilopectine.l Is’agit d’hétérosides très sulfatés (22%), de poids moléculaire situé entre 100.000 et 1.000.000(Kloareg. et al., 1988).

Polysaccharides des autres classes d’algues

Ces polysaccharides sont contenus dans les familles Cyanophyceae (bleu-vert), Bacillariophyceae (deatomique) et Lanthophyceae. Ils sont constitués par des unités très variables comme le mannitol, le glucose, le laminitol, l’inositol (Percival et al., 1967).

Polysaccharides des algues rouges

Les algues rouges sont capables de produire soit des carraghénanes, soit des agars (Whyte et al., 1984).

Les carraghénanes

Les carraghénanes sont des polysaccharides qui constituent les parois cellulaires de divers algues rouges (Rhodophycées) appartenant aux familles des Gigartinaceae, Hypneaceae, Furcellariaceae et Polyideaceae (Rees, 1969 ; Santos, 1980 ; Greer et al.,1984 ).
Ils comportent des longues chaînes galactanes, polyélectrolytes anioniques. Leur masse moléculaire peut être supérieure à 10(Kloareg et al., 1988).
Ces polymères linéaires, formés par des motifs disaccharides [AB], sont composés par deux unités D-galactopyranoses liées alternativement pardes liaisons α-(1→3) et β-(1→4) (Yaphe, 1959 ; Bellion et al.,1983).
Ce sont des polysaccharides très sulfatés (20-50%)et les résidusα-D-galactopyranosyles peuvent être sous forme 3’,6’-anhydro (Asare, 1980 ; Greeret al., 1985).

Différents types de carraghénanes

Initialement, on a subdivisé les carraghénanes en euxd familles suivant leur solubilité dans le KCl. Les fractions solubles dans le KCl ont été désignées par le préfixe « Kappa », tandis que le préfixe « Lambda » a été réservé à celles des fractions insolubles.
Plus tard, les classifications ont été basées sure lnombre, la position de groupements sulfates ainsi que la présence de pont 3’,6’-anhydro sur les résidusβ-D-galactopyranosyles. Ceci a abouti aux quatre grandes familles : κ, λ, β, ω (Yaphe, 1972 ; Anderson et al., 1969 ; Rees et al., 1969 ; Greer et al., 1984).
Les différentes familles (figure 1) de carraghénanesont présentées dans le tableau I suivant :
Tableau I. Les différentes familles de carraghénane.

TRAVAUX ANTERIEURS sur le genre Plocamium

Comme d’autres produits de la mer, les algues ont jouées un rôle thérapeutique vis à vis de certaines affections (Whyte et al., 1984). Elles montrent une gamme d’activité biologique : anticoagulante, antibactérienne, antitumorale, antivirale, hypocholéstérolémiante (Dominique, 1998), antimicrobienne (Kônig et al., 1999), insecticide (San-Martin et al., 1991 ; Argandona et al., 2002), antituberculeuse (Kônig et al., 2000), et anticancéreuse (Fuller et al., 1992-1994). Le tableau III suivant montre quelques exemples de leurs activités.
Plus récemment, Knott et al. (en 2005) et Mann et al. (en 2007), ont entrepris des études préliminaires sur les constituants chimiques de Plocamium corallorhiza, récoltés en Afrique du Sud, en Mars 2002, et en Janvier 2006. Les composés obtenus sont présentés dans le tableau IV suivant.

MATERIEL VEGETAL

Collecte

Les collectes ont été réalisées durant la marée se,baspériode à laquelle les algues émergent à la surface de l’eau de mer, et peuvent être facilement arrachées des rochers, leur support. Une partie représentative de chaque échantillon d’algues fraîches a été immédiatement fixée pour la constitution d’un herbier.
Notre échantillon d’algue rouge Plocamium corallorhizaa a été collecté par les équipes du Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement (LME) du Centre National de Recherche sur l’Environnement (CNRE) en 2004. L’échantillon d’algue (figure 2) a été collecté au Sud-Est de Madagascar, dans un petit village au Nord de Fort-Dauphin (figure 3), à Evatraha. Un alguier est disponible au Laboratoire du CNRE.

Description botanique

Les données systématiques de l’échantillon d’alguesrouges étudiées sont résumées dans le tableau V suivant :
Tableau V. Données systématiques .

MATERIELS ET APPAREILS UTILISES

Pesée

Les différentes pesées ont été effectuées à l’aides deux types de balances : High Presion balance excell 9VDC/1300 mA BH-1500, Cap : 1500 g/ Div. 0,05 g. -4

Séchage

Tout séchage a été réalisé à l’aide d’une étuve verselleuni BINDER.

Broyage

L’échantillon d’algue a été broyé à l’aide d’un broyeur électrique.

Centrifugation

Les centrifugations ont été réalisées à l’aide d’une centrifugeuse SIGMA, réglée à la vitesse de 1000 rpm.

Agitation

Les agitations ont été effectuées soit à l’aide d’un agitateur magnétique Fisherbrand HOTPLATE STIRRER Model L-81, Heidoph MR 3000.

Evaporation

Un évaporateur rotatif BUCHI type R200 a été utilisé pour concentrer ou sécher les extraits.

Filtration

Les différents filtrations ont été effectuées parl’aideà d’une filtre Buchner et papier filtre WhatmanR Cat no 1001 110, 110mm de diamètre.

Dialyse

Pour la dialyse, des morceaux de boudin de dialyse d’une longueur approximative de 25cm ont été utilisés.

Dosage colorimétrique

Les mesures de densité optique lors des différentsdosages colorimétriques ont été effectuées à l’aide d’un spectrophotomètre UV.BIOMATE.

Chromatographie sur couche mince

Plaque C.C.M utilisé : 25 DC – Alufolié Kieselgel 60 F254 MERCK, art 5568 d’épaisseur 0,2mm.
• Observation sous UV
Les dépôts et les taches ont été observés sous UV l’aideà d’une lampe de WOOD VL – 4 LC aux longueurs d’onde λ=254 nm et 365 nm.
• Révélation
Les taches ont été révélées par pulvérisation deactifré à la vanilline sulfurique suivi de chauffage.

Chromatographie Liquide à Basse Pression

Colonne utilisée :
Diamètre intérieur de 2,3cm
Diamètre extérieur de 2,5cm
Hauteur de 50cm
Hauteur effective de 17cm
Adsorbant (ou phase stationnaire): ACROS ORGANICS 27,5080g de silicagel, for column chromatography 0,035-0,070mm, pore diameter Ca 6nm.

Infrarouge

Les spectres d’absorption infrarouge ont été enregistrés sur un spectrophotomètre FTIR-8400S SHIMADZU.

METHODES

Traitement préalable des échantillons d’algues

Lavage

Avant toute opération, il est nécessaire d’éliminertoutes les impuretés possibles, telles que les sels, sable, coquilles, les algues parasites, etc. qui souillent les échantillons d’algues. A cet effet, on procède à leur lavage à l’eau, lequel est suivi d’un séchage à l’étuve (Greer et al., 1984 ; Andriamanantoanina et al., 1996).
Les échantillons d’algues ont été lavés abondammentàl’eau, rincés à l’eau distillée puis séchés à l’étuve 50°C avant d’être finement broyés. (Alexeev, 1980 ; Greer et al., 1984 ; Mollion, 1988).

Broyage

Les échantillons ont été broyés afin d’optimiser lecontact entre les prises d’essai et les solvants lors des diverses opérations ultérieures.Un fin broyage est requis pour améliorer le rendement de ces derniers (Alexeev, 1980).
Le prétraitement effectué aux échantillons d’alguesest présenté dans la figure 4 suivante.

Méthodes d’analyse des polysaccharides

Extraction du carraghénane

On effectue trois extractions différentes : chaqueextraction s’effectue en deux étapes :
Première voie d’extraction
Elle porte sur la poudre de Plocamium corallorhiza.
Première étape : Extraction à froid ou « Cold Extract » :CE 10,083g de poudre de Plocamium corallorhiza sont macérées dans 150 à 400ml d’eau distillée, sous agitation pendant une nuit. On filtre à l’aide d’une voile propre pour séparer la solution ou cold-extract de la plus grosse partie des débris. Le filtrat est ensuite passé sous pression sur papier filtre WHATMAN 589/1 de 110mm de diamètre.
On le concentre sur évaporateur rotatif, puis précipité par 4 volumes d’éthanol 90° pendant 24h à 4°C. On centrifuge et le précipité est laisséà sécher à l’étuve à 60°C.
Deuxième étape : Extraction à chaud ou « Hot Extrac » :HE
Le résidu récupéré après filtration du cold-extractest dépigmenté trois fois avec 60 à 200ml d’acétone et une fois avec de l’éthanol bouillante.Après chaque traitement, on centrifuge à l’aide d’une centrifugeuse SIGMA pendant 15 à 20min utes.
Le dépôt, rincé à l’eau distillée est placé dans 150 à 500ml d’eau distillée à 100°C pendant trois heures avec reflux. La décoction encore chaude subit les mêmes traitements (filtrations) que précédemment. Cette extraction à 100°C est réalisée trois fois pour le même résidu. Les filtrats très bien mélangés sont ensuite congelés neu nuit à -20°C puis décongelés pour éliminer la majeur partie des impuretés solubles.
Ils sont précipités par quatre volumes d’éthanol 90° pendant 24 heures et séché à l’étuve à 60°C.
Deuxième voie d’extraction
Elle porte sur le résidu de Plocamium corallorhiza obtenu après extractions successives à l’hexane, dichlorométhane, acétate d’éthyle et méthanol de la poudre.
Première étape : Extraction à froid ou « Cold Extract » : CE 10,083g de résidu dePlocamium corallorhiza sont macérés dans 150 à 500ml d’eau distillée, sous agitation pendant 24 heures. On procède au même protocole que lors de la 1ère étape de la 1ère voie d’extraction.
Deuxième étape : Extraction à chaud ou « Hot Extrac » : HE
Après dépigmentation et extraction à chaud, les filtrats bien mélangés sont divisés en deux lots : L’un est précipité par 4V d’EtOH pendant 24h à 4°C. On centrifuge et le précipité est laissé à sécher à l’étuve à 60°C.
L’autre lot est précipité à l’aide d’une solution aqueuse de Bromure de cetyl-triméthylammonium, communément appelé CTAB ou cétavlon, à une concentration de 2%, puis laissé au réfrigérateur à 4°C pendant 24 heures. Le précipité est séparé du liquide surnageant après centrifugation (2. 000 tours par minute, pendant 30 minutes).
Le précipité est par la suite lavé deux fois avec edd’eau distillée. Le CTAB est déplacé à l’aide d’une quantité suffisante d’éthanol 90°C saturé de l’acétate de sodium NaHCO (3 fois).
L’acétate de sodium est éliminé en rinçant le précité avec de l’éthanol bouillant (2 fois), suivis de centrifugation. L’extrait est séché à l’étuve BINDER 50°C.
Troisième voie d’extraction
10,083g de résidu d’algues rouges de Plocamium corallorhiza, récupérées après extraction fractionnée à l’hexane, dichlorométhane, acétate d’éthyle et méthanol, ont été traitées successivement par (3 x 20 ml) d’acétone, (1 x 20ml) d’éthanol bouillant et (1 x 20ml) d’acétate d’éthyle.
Première étape : Extraction à froid ou « Cold Extract » : C.E.
Les poudres d’algues dépigmentées ont été soumisesà une première extraction par simple macération à l’eau distillée de 100 à 500 ml, sous agitation magnétique pendant 24 h et à température ambiante. Le résidu insoluble a été récupéré par filtration sur voile de tergal. Une deuxième filtration sur papier filtre WHATMAN a éténécessaire pour une meilleure extraction (Santos, 1980 ; Greer et al., 1984; Greer 1984).
Les carraghénanes ont été obtenus par précipitationdu filtrat ci-dessus avec quatre volumes d’éthanol 90°, pendant 24h, à 4°C. Le précipité a té récupéré après une centrifugation, puis un séchage à l’étuve 40°C. Les polysaccharides de faible poids moléculaire ont été ainsi extraits. Le rapport entre la masse de l’extrait et celle de la prise d’essai donne le rendement en CE (Mollion, 1988).
Deuxième étape : Extraction à chaud ou « Hot Extract »: H.E.
Les résidus d’algues de l’opération C.E. précédente(7,7833 g) sont traités par 300 ml de solution aqueuse de NaHCO3, 0,5 N, au bain-marie 90°C, pendant 2 heures, en ag itant de temps en temps. Les constituants non solubles sont éliminés en filtrant la solution obtenue, à chaud et sous vide, deux fois sur de la célite 545 PROLABO. Le filtrat est laissé refroidir (Santos, 1980 ; Greer et al., 1984; Greer 1984).
Les carraghénanes sont précipités à l’aide de 50 mlde CTAB 2%, puis laissés au réfrigérateur à 4°C, pendant 24 heures.
Le précipité est séparé du liquide surnageant aprèscentrifugation (2. 000 tours par minute), pendant 30 minutes.
Il est ensuite lavé deux fois avec 30 ml d’eau distillée. Le CTAB est déplacé à l’aide l’une quantité suffisante d’éthanol 90°C saturé de l’acéte de sodium NaHCO3 (3 fois). L’acétate de sodium est éliminé en rinçant le précipité avec del’éthanol bouillant (2 fois), suivis de centrifugation.
L’extrait est par la suite dissous à chaud dans de l’eau distillée chaude, dialysé puis séché à l’étuve 50°C, pendant 24 heures. Après refroidissement dans un dessicateur, le résidu est pesé pour le calcul du rendement (Mollion, 1988).

Dialyse

La dialyse est une technique qui permet de séparer les substances d’une solution en utilisant leur capacité respective à franchir les pores calibrés d’une membrane artificielle appelée membrane de dialyse. Grâce à sa perméabilité sélective, ce boudin de dialyse permet de séparer les petites molécules des grosses en permettant le phénomène de la diffusion. Ainsi, la membrane sépare deux solutions de différentes concentrations. Les solutés diffusent de la solution la plus concentrée vers la solution la plus diluée. La diffusion s’arrête lorsque les concentrations dans ces deux compartiments sont égales. Les facteurs qui peuvent influencer la vitesse de la dialyse sont : la température, le diamètre des pores de la membrane, le pH, le temps de contact, et la différence de concentration entre les deux compartiments (Ibrahim, 2005).
La membrane de dialyse ou boudin contient de la glycérine, des composés sulfureux et des métaux lourds. Ces constituants présents à la surface membranaire doivent être éliminés. La technique usuelle consiste à bouillir la membrane d ans l’eau distillée pendant 15 minutes.
Un volume déterminé de polysaccharide (HE de la 1 extraction) à dialyser est versé dans une portion de boudin à dialyse dont une extrémité estfermée par un nœud. Un deuxième nœud est ensuite confectionné à l’autre extrémité en prenantsoin de laisser suffisamment de place entre ce nœud et la surface supérieure de l’extrait. Cett e précaution est prise pour éviter l’éclatement du boudin par augmentation de volume interne de la solution de polysaccharide. La membrane est ensuite immergée dans l’eau distillée (liquidede contre dialyse), en agitant de temps en temps afin d’éviter la formation d’un gradient de concentration des substances diffusibles au voisinage du boudin. Ce liquide est renouvelé fréquemment pour accélérer la diffusion et maintenir la différence de concentration entre l’intérieur et l’extérieur du boudin (Ibrahim, 2005).

Récupération des carraghénanes

Les polysaccharides ont la propriété de former un récipité, soit en présence d’un excès d’alcool (3 à 10 volumes) soit par action d’un sel d’ammonium quaternaire. La précipitation du carraghénane, soit par l’éthanol, soit par le propanol-2 (Mollion, 1988), soit par le bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB ou cétavlon), permet de le récupérer d’une solution aqueuse contenant divers extraits hydrosolubles.
Lorsque la quantité d’éthanol augmente, on arrive à précipiter même les polysaccharides de faible masse moléculaire.
Un sel d’ammonium quaternaire précipite sélectivement les polysaccharides chargés. La précipitation par le CTAB est généralement plus sélective que celle par l’éthanol (Bellion et al., 1983).

Dosages colorimétriques

Dosage des sucres totaux

En milieu sulfurique et à chaud, les oses neutres d onnent des dérivés furfurals qui se condensent avec l’orcinol pour donner un complexe de couleur brun jaune.
Les termes « sucres totaux » ou « oses neutres » sont utilisés pour désigner les monosaccharides neutres entrant dans la composition des polysaccharides. Trois méthodes sont couramment utilisées pour ce dosage (Tillmans et al., 1929 ; Dubois et al., 1956 ; Montreuil, 1963 ; Yaphe, 1972).
-A l’orcinol TILLMANS et PHILLIPI
-A l’enthrone DREYWOOD
-Au phénol DUBOISet al.
Nous avons utilisé la méthode au Phénol sulfurique(Mollion, 1988).

Préparation des solutions

Réactifs
Solution aqueuse de Phénol 50% (m/v)
H2SO4 concentré.
Gamme étalon
Solution de galactose 200, 100, 50µg/ml.
Solution de référence.
Eau distillée (ED)
Solution à doser.
Solution de carraghénane CE et HE : 200µg/ml.

Mode opératoire

Dans des tubes à essai, on a mis successivement :
– 200µl d’ED de la solution étalon ou de solution à doser (à l’aide d’une micropipette),
– 200µl de la solution phénolique (5%),
– addition brutale de 1ml d’H 2SO4 concentré à l’aide d’une burette ;
– agitation rapide (à laide d’un vortex) ;
– 5mn au bain-marie 100°C ;
– refroidissement 30mn à l’obscurité ;
– Mesure de DO : La lecture des DO a été réalisée laà longueur d’onde λ=492 nm à l’aide d’un spectromètre UV BIOMATE.

Calcul

La teneur en sucres totaux est donnée par la formule suivante :
[galactose]
Teneur en sucres totaux (%) x100
Avec : [Galactose] : concentration en galactose obtenue par projection de la densité optique (DO) sur la courbe d’étalonnage en µg/ml.
[Échantillon] : concentration en polysaccharides de la solution à doser en µg/ml.
Remarque :
Les courbes d’étalonnage ont été tracées en utilisant la méthode de barycentres DO = f (concentration).

Dosage des 3’, 6’- Anhydrogalactoses

Les 3’, 6’- Anhydrogalactoses, sous l’action du résorcinol en milieu acide, donnent une coloration intense.
Une absorbance maximale à 555 nm est obtenue par aj out de l’acétaldéhyde. Le fructose est pris comme échantillon de référence. La réponse colorimétrique du 3’, 6’- Anhydrogalactose est de 92% par rapport à celle du fructose (Yaphe, 1960 ; Yaphe et al., 1965 ; Arsenault et al., 1965 ; Arsenault et al., 1966).

Table des matières

INTRODUCTION
A- POLYSACCHARIDES
A-1. Définition
A-2. Classification
A-2-1. Polysaccharides de Phaeophyceae -algues brunes
A-2-2. Polysaccharides de Rhodophyceae –algues rouges
A-2-3. Polysaccharides de Chlorophyceae –algues vertes
A-2-4. Polysaccharides des autres classes d’algues
A-3. Polysaccharides des algues rouges
A-3-1. Les carraghénanes
A-3-1.1. Différents types de carraghénanes
A-3-1.2. Utilisations des carraghénanes
B- TRAVAUX ANTERIEURS sur le genre Plocamium
MATERIELS ET METHODES
A. MATERIEL VEGETAL
A. 1. Collecte
A.2. Description botanique
B. MATERIELS ET APPAREILS UTILISES
B.1. Pesée
B.2. Séchage
B.3. Broyage
B.4. Centrifugation
B.5. Agitation
B.6. Evaporation
B.7. Filtration
B.8. Dialyse
B.9. Dosage colorimétrique
B.10. Chromatographie sur couche mince
B.11. Chromatographie Liquide à Basse Pression
B.12. Infrarouge
C. METHODES
C.1. Traitement préalable des échantillons d’algues
C.1.1. Lavage
C.1.2. Broyage
C.2. Méthodes d’analyse des polysaccharides
C.2.1. Extraction du carraghénane
C.2.2. Dialyse
C.2.3. Récupération des carraghénanes
C.2.4. Dosages colorimétriques
C.2.4-1. Dosage des sucres totaux
C.2.4-2. Dosage des 3’, 6’- Anhydrogalactoses
C.2.4-3. Dosage des sulfates
C.2.5. Méthode physique d’analyse
C.2.6. Méthode chimique
C.2.6.1. Modification alcaline
C.3. Méthodes d’analyse des autres constituants de P. corallorhiza
C.3.1. Extraction
C.3.2. Méthodes chromatographiques
C.3.2-1. Chromatographie sur Couche Mince (C.C.M.)
C.3.2-2. Chromatographie Liquide à Basse Pression (C.L.B.P)43
C.3.2-3. Chromatographie sur Couche Epaisse (C.C.E)
C.3.3. Méthodes d’analyses spectrales
C.3.3-1. Couplage chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse (CPG/SM)
C.3.3-2.Couplage CPG/IRFT
C.3.3-3. La Résonance Magnétique Nucléaire
a- Le spectre R.M.N 1H
b- Le spectre 1-D du 13C
c- Spectre RMN 2-D
C.3.4. Etude de l’activité biologique
RESULTATS ET DISCUSSIONS
A. POLYSACCHARIDES
A.1. Aspects des précipites
A.2. Rendements
A.3. Dosages colorimétriques
A.3-1. Dosages des sucres totaux.
A.3.2. Dosage des 3’,6’-anhydrogalactoses.
A.3.3. Dosage des sulfates
A.4. Spectroscopie infra rouge
A.5. Modification alcaline
A.6. Précipitation à l’aide d’ion K+
B- AUTRES CONSTITUANTS CHIMIQUES
B.1. Résultats des extractions
B.2. Isolement du composé XXIIb
B.3. Analyse de XXIIb
B.3.1. Comportement chromatographique de XXIIb
B.3.2. Détermination de structure
B.3.2.1. Spectrométrie de masse
B.3.2.2. IR
B.3.2.3.RMN
B.4. Résultats des tests antibactériens
B.5. Résultats des tests antimalaria
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

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