Transformation des bactéries pour la production d’ADN

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Défense immunitaire

Lors d’une infection, la NOS inductible (iNOS) est exprimée au sein des macrophages[44] et participe à la réponse immunitaire non spécifique au moyen d’une forte production de monoxyde d’azote[35]. En effet, la synthèse du NO• est environ dix fois plus rapide avec iNOS qu’avec les deux autres isoformes[45]. Le NO• ainsi libéré en grande quantité dans le milieu intercellulaire inhibe la réplication des organismes pathogènes[46]. Au sein des bactéries, le monoxyde d’azote cible principalement l’ADN, directement en provoquant des cassures double-brins, mais aussi de manière indirecte en inhibant sa synthèse[47]. De plus, il est capable de bloquer la respiration des bactéries ce qui a notamment pour effet d’augmenter la sensibilité de ces dernières au stress oxydant généré par l’hôte et dont il est l’un des principaux acteurs[38]. Le NO• possède également des propriétés antivirales, vis-à-vis notamment des Herpesviridae, des Coronavirus et des Picornaviridae, via la nitrosylation, et donc l’inhibition de protéases indispensables à leur réplication[45]. Le monoxyde d’azote peut aussi interagir avec des lipides[47], ce qui conduit à leur oxydation, et des protéines microbiennes, via un résidu cystéine, un hème ou un cluster fer-soufre[45]. Enfin, il a été montré que l’effet cytotoxique du NO• pouvait s’exercer sur certaines cellules tumorales[48].

Processus pathologiques

Lorsque la production de monoxyde d’azote par les NOS n’est plus correctement régulée, ce dernier peut avoir des effets néfastes sur l’organisme.
En effet, le NO• peut exercer une activité cytotoxique contre les cellules saines de l’organisme[36], selon des procédés similaires à ceux utilisés pour la défense immunitaire[42], dont la plupart ne mettent pas en jeu le NO• lui-même, mais le peroxynitrite[49]. Cette espèce réactive de l’azote et de l’oxygène (RNOS) est formée par la réaction du NO• avec l’anion superoxyde O2•- ; le peroxynitrite peut à son tour se décomposer en divers oxydes d’azote capables de causer des dommages tissulaires. De plus, ces composés peuvent nitrer des résidus tyrosine et conduire à l’inactivation de certaines protéines, comme la superoxyde dismutase[38].
Le monoxyde d’azote est également responsable des lésions neuronales consécutives à un accident vasculaire cérébral[38]. Cette neurotoxicité s’exerce indirectement via la libération excessive de glutamate[42]. On observe aussi un effet délétère du NO• suite à une ischémie : iNOS est alors exprimée au niveau du cerveau et sa forte production de NO• contribue à la mort neuronale. Cependant, dans le même temps, la production, certes plus faible, de NO• par eNOS est indispensable puisqu’elle permet de maintenir un afflux sanguin suffisant[50]. Bien que son rôle ne soit pas encore bien compris, il a été montré que le NO• était impliqué dans certaines maladies neurodégénératives, comme la chorée de Huntington et la maladie de Parkinson[38, 42, 51].
De nombreux types de cancers impliquent les NOS endothéliale[52] et inductible[53, 54] et le monoxyde d’azote[38]. La surexpression de iNOS a en effet été observée aussi bien dans des cancers du sein et de la prostate que dans certains cancers du tube digestif, de la peau, de la vessie, du larynx ou du système nerveux central[38, 53, 54]. Elle est notamment impliquée dans la carcinogenèse, l’angiogenèse au sein des tumeurs, la formation de métastases et l’agressivité des tumeurs[55, 56]. Par son activité anti-apoptotique, et sa capacité à inhiber la réponse immunitaire secondaire de l’organisme le NO• va, de plus, permettre la survie et la progression des tumeurs[57]. Ce rôle crucial dans le développement d’un grand nombre de cancers a fait de la NOS inductible une cible thérapeutique privilégiée[53].
Enfin, les NO-synthases sont impliquées dans de nombreuses maladies cardio-vasculaires, les trois isoformes étant exprimées au niveau du cœur, dans différents types de tissus[38, 58]. La dérégulation de la production de monoxyde d’azote et des voies de signalisation associées est notamment impliquée dans le développement du diabète et des cardiomyopathies induites par ce dernier[38, 59]. Cette dérégulation est, en partie, due à une modification du niveau d’expression de la NOS endothéliale, à la hausse ou à la baisse, ainsi qu’au découplage de cette dernière, ce qui conduit à la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS)[59]. L’implication de la NOS neuronale dans les cardiomyopathies, associées ou non au diabète, a été nettement moins étudiée et elle reste très incertaine puisqu’on trouve des études qui montrent une surexpression de cette dernière, alors que d’autres font état d’une diminution ou d’une absence de modification de son profil d’expression[59]. Au contraire, le rôle de la NOS inductible dans les troubles cardio-vasculaires est clairement établi : sa surexpression au niveau des tissus cardiaques conduit à une forte production de monoxyde d’azote susceptible d’entraîner un dysfonctionnement contractile[60]. De plus, dans ces conditions, iNOS peut être fortement découplée, ce qui entraîne la production de RNOS qui provoquent également des dysfonctionnements contractiles et peuvent conduire à un arrêt cardiaque[59].

Structure des NOS de mammifères

Protéine multi-domaines

Les NO-synthases sont composées de deux domaines fonctionnels, oxygénase et réductase, liés par un peptide d’environ 30 acides aminés qui permet la fixation d’une protéine régulatrice, la calmoduline (Figure 4) [13, 15, 16].
Le domaine oxygénase N-terminal contient le site catalytique et les sites de fixation pour l’hème et pour un cofacteur redox (Figure 5), la tétrahydrobioptérine (H4B)[35]. Comme pour les cytochromes P450, l’hème est lié à la protéine via un résidu cystéine ; ces deux familles de protéines ne présentent cependant aucune homologie structurale[61, 62]. Dans le cas de la NOS neuronale, le domaine oxygénase est prolongé, à l’extrémité N-terminale, par un domaine PDZ[16].
Le domaine réductase C-terminal possède des sites de fixation pour les cofacteurs flavines, la flavine mononucléotide (FMN) et la flavine adénine dinucléotide (FAD), ainsi que pour le co-substrat nicotinamide adénine dinucléotide phosphate réduit (NADPH)[14] (Figure 6). Sa séquence et sa structure sont analogues à celles d’autres réductases utilisant le système FMN/FAD/NADPH, et en particulier à la P450 réductase[14].
Le site catalytique, ainsi que les sites de fixation pour les différents cofacteurs sont très conservés entre les isoformes[20, 63, 64], contrairement au site de fixation de la calmoduline[65]. Les NO-synthases sont actives uniquement sous forme d’homodimères[66].

Domaine oxygénase

C’est au sein du domaine oxygénase que se trouve le site actif à hémothiolate (Figure 7) où les NOS catalysent l’oxydation en deux étapes de la L-arginine en Nω-hydroxy-L-arginine (NOHA) puis en L-citrulline et monoxyde d’azote[17]. Il est peu flexible et relativement exposé au solvant[62]. On y trouve, dans l’environnement distal de l’hème, le site de fixation du substrat. Ce dernier est extrêmement conservé entre les trois isoformes[67] : tous les résidus en contact avec l’arginine sont identiques, à l’exception d’un acide aspartique dans iNOS et nNOS, remplacé par une asparagine dans le cas d’eNOS, au niveau du groupement carboxylate de l’arginine. Cette substitution n’a toutefois pas d’effet sur l’affinité de l’arginine pour la protéine, qui est maintenue par un important réseau de liaisons hydrogène[62]. Le canal d’accès du substrat se prolonge du site actif vers l’interface du dimère[68].
Le domaine oxygénase lie également le cofacteur redox H4B, indispensable au fonctionnement de l’enzyme[62]. Les structures tridimensionnelles des domaines oxygénases seuls (ie sans le domaine réductase) ont montré qu’ils pouvaient, comme les NOS entières, former des dimères contenant deux molécules de H4B, localisées à l’interface entre les deux monomères (Figure 8)[20, 63, 64, 69]. Elles sont stabilisées par un réseau de liaisons hydrogène et par interaction π-π avec deux résidus aromatiques : un tryptophane appartenant à l’un des monomères et une phénylalanine appartenant à l’autre[62, 70, 71]. Le cofacteur H4B a donc besoin du dimère pour se fixer et, dans le même temps, il favorise sa formation et le stabilise[66, 68].
Les structures cristallographiques des domaines oxygénases ont également permis de mettre en évidence la présence d’un unique atome de zinc à l’interface entre les deux monomères. Il est lié à quatre résidus cystéine, deux provenant de chaque monomère (Cys96 et Cys101 pour eNOS de Bos taurus, Figure 8)[72]. Il joue un rôle structural majeur puisqu’il favorise la formation du dimère et le stabilise. Bien qu’on puisse avoir un dimère en absence de zinc, ce dernier est nécessaire au repliement correct de la protéine[72]. Au niveau du domaine oxygénase, c’est cette zone, à l’interface entre les deux monomères, qui présente le plus de variations entre les trois isoformes de NOS ; ceci explique, en partie, les différences de stabilité observées entre les dimères de nNOS, iNOS et eNOS[64].

Domaine réductase

Le domaine réductase des NO-synthases permet le transfert d’électrons du NADPH vers le site catalytique, via le FAD puis le FMN. Ce transfert peut également s’effectuer, de manière moins efficace, lorsque les domaines oxygénase et réductase produits séparément sont mis en contact ; la réductase seule peut aussi transférer des électrons à d’autres accepteurs, comme les cytochromes c[69, 70]. Les sites de fixation du FAD et du FMN sont optimisés de façon à stabiliser les formes semi-quinones des flavines[15, 70]. De plus, la position enfouie du cofacteur FMN le rend inaccessible à tout partenaire redox exogène ; il ne peut être réduit que via le FAD.
La résolution de la structure de la réductase de nNOS par cristallographie a également révélé que cette dernière forme un dimère (Figure 9), comme c’est le cas pour le domaine oxygénase. Cependant, la structure obtenue ne permet pas le transfert d’un électron depuis le FMN jusqu’à l’hème[73]. Enfin, l’alignement des séquences des domaines réductase de NOS avec celles d’autres réductases à NADPH/FAD/FMN a mis en évidence la présence d’une extension C-terminale et, pour les NOS constitutives, d’un insert dans le site de fixation du FMN[74]. Ces deux régions sont impliquées dans la régulation de la production de monoxyde d’azote. (Cf. §1.4).

Enzyme entière

Les domaines réductase et oxygénase des NOS sont reliés par un peptide qui comprend un site de fixation pour la calmoduline[13]. Cette petite protéine (17kDa) est sensible au flux de calcium intracellulaire et participe à l’activation de nombreuses protéines[69]. La calmoduline est notamment indispensable aux NO-synthases et permet de déclencher le transfert d’électron de la réductase d’un monomère, vers le site catalytique de l’autre monomère[70]. Différentes régions du domaine réductase interagissent avec la calmoduline ou modifient son affinité pour son site de fixation ; la structure de la réductase est modifiée par la présence de calmoduline[69, 70, 74]. Le domaine oxygénase, au contraire, n’est pas impacté par l’interaction de la NOS avec la calmoduline[70].
Figure 10- Représentation schématique des modèles de NOS entière proposés par Garcin et al. (gauche) et Stuehr et al.(droite).
La structure du complexe formé par un peptide contenant le site de fixation de la calmoduline avec cette dernière est disponible pour iNOS (code PDB 3GOF), eNOS (code PDB 1NIW) et nNOS (code PDB 2O60). Elle permet d’expliquer, en partie, le rôle de la calmoduline dans le transfert électronique inter-domaine[75]. On dispose aussi, dans le cas de la NOS inductible, d’une structure qui contient également le domaine de fixation du FMN[76]. Cependant, l’enzyme entière n’a, pour l’instant, pas pu être cristallisée ; on ne connaît donc pas sa structure tridimensionnelle. Des modèles de dimères basés sur les structures des domaines oxygénase et réductase, ont néanmoins été proposés, qui diffèrent notamment par l’existence, ou non, d’une interaction entre les deux domaines réductases (Figure 10)[73, 77].

Table des matières

Introduction
Chapitre I NO-synthases et NOS-like proteins
1. NO-synthases de mammifères
1.1. Rôles du monoxyde d’azote
1.1.1. Signalisation
1.1.2. Défense immunitaire
1.1.3. Processus pathologiques
1.2. Structure des NOS de mammifères
1.2.1. Protéine multi-domaines
1.2.2. Domaine oxygénase
1.2.3. Domaine réductase
1.2.4. Enzyme entière
1.3. Mécanisme catalytique
1.3.1. 1ère étape : hydroxylation de l’arginine
1.3.2. 2ème étape : oxydation du NOHA
1.3.3. Transfert d’électron inter-domaine
1.3.4. Découplage
1.4. Régulation de la production de NO•
1.4.1. Cas de la NOS inductible
1.4.2. Cas des NOS constitutives
1.4.3. Cofacteur H4B et dimérisation
2. NOS-like proteins bactériennes
2.1. Découverte des NOS-LP
2.1.1. NO-synthases eucaryotes
2.1.2. NOS-LP procaryotes
2.2. Structure des NOS bactériennes
2.2.1. Caractéristiques générales
2.2.2. Site actif et fixation du substrat
2.2.3. Site de fixation et nature du cofacteur
2.2.4. Stabilité du dimère
2.3. Mécanisme catalytique
2.3.1. 1ère étape : identique aux mNOS
2.3.2. 2ème étape : un nouveau mécanisme ?
2.3.3. Réduction de l’hème et partenaire(s ?) redox
2.4. Fonctions in vivo
2.4.1. Production de monoxyde d’azote ?
2.4.2. Réactions de nitration
2.4.3. Virulence et pathogénicité
2.4.4. Résistance au stress
2.4.5. Signalisation intercellulaire
2.4.6. Conclusion
3. Objectifs de cette étude
Chapitre II Partie expérimentale
1. Biologie moléculaire
1.1. Transformation des bactéries pour la production d’ADN
1.2. Production et purification de l’ADN
1.3. Digestion enzymatique et chromatographie sur gel d’agarose
1.4. Vérification de la séquence
1.5. Transformation des bactéries pour la production de protéines
2. Production de protéines
2.1. Production de la NOS de Deinococcus radiodurans
2.1.1. Expression de deiNOS seule
2.1.2. Co-expression avec la tryptophanyl-ARN-synthétase II
2.2. Production de la NOS de Geobacillus stearothermophilus
2.3. Production du mutant I224V de la NOS de Bacillus subtilis
2.4. Production du mutant V346I du domaine oxygénase de la NOS inductible murine
3. Tests d’activité enzymatique
3.1. Test de Griess – Peroxide shunt
3.1.1. Principe du test
3.1.2. Etalonnage
3.1.3. Protocole expérimental
3.1.4. Traitement et analyse des données
3.2. Cycle réel – Single turnover
3.2.1. Principe du test
3.2.2. Mise en place expérimentale
3.2.3. Traitement des données
4. Electrochimie
4.1. Voltampérométrie cyclique
4.1.1. Mesure du potentiel de l’électrode de référence
4.1.2. Mesure des potentiels des médiateurs
4.2. Mesure du potentiel de l’hème
4.2.1. Principe de la méthode
4.2.2. Choix des médiateurs
4.2.3. Mise en place expérimentale
4.2.4. Traitement et analyse des résultats
5. Préparation des complexes hémiques
5.1. Préparation de la NOS à l’état FeIII
5.2. Préparation du complexe FeIICO
5.3. Préparation du complexe FeIINO
6. Spectroscopies
6.1. Spectroscopie d’absorption UV-visible- Test « P450 »
6.1.1. Suivi de la production de protéine
6.1.2. Contrôle des fractions purifiées
6.2. Spectroscopie de résonnance paramagnétique électronique (RPE)
6.2.1. Principe général
6.2.2. Cas du fer
6.2.3. Eclatement à champ nul –Zero field splitting (ZFS)
6.2.4. Couplage hyperfin
6.2.5. RPE impulsionnelle
6.2.6. Conditions expérimentales
6.2.7. Simulation
7. Techniques de cinétiques rapides
7.1. Suivi de la réaction par cinétique en flux arrêté – Stopped-flow
7.1.1. Principe
7.1.2. Préparation de la protéine
7.1.3. Préparation de l’appareil et enregistrement des données
7.1.4. Exploitation des résultats
7.2. Piégeage du radical ptérine – Rapid freeze-quench
7.2.1. Principe
7.2.2. Préparation de la protéine
7.2.3. Préparation de l’appareil et récupération des échantillons
8. Bio-informatique
8.1. Construction d’une structure de deiNOS par homologie
8.1.1. Choix des modèles
8.1.2. Construction du monomère
8.1.3. Construction du dimère
8.1.4. Génération de structures multi-modèles
8.1.5. Classement des structures obtenues
8.2. Dynamique moléculaire
8.2.1. Choix du champ de force
8.2.2. Paramétrage des ligands
8.2.3. Procédure de dynamique moléculaire
8.2.4. Analyse des résultats
Chapitre III Substitution Val/Ile – Influence de l’environnement distal
1. Introduction
2. Effets structuraux et électroniques
2.1. Equilibre haut-spin/ bas-spin du FeIII
2.1.1. En absence de substrat et de cofacteur
2.1.2. Influence du H4B seul
2.1.3. Influence du substrat
2.1.4. Conclusion
2.2. Complexe FeIICO
2.3. Potentiel de l’hème
2.4. Complexe FeIINO
2.4.1. En présence de H4B seul
2.4.2. En présence de substrat et de H4B
2.4.3. En présence de citrulline et H4B
2.4.4. Conclusion
2.5. Conclusion
3. Influence sur le cycle catalytique
3.1. Hydroxylation de l’arginine
3.1.1. Intermédiaires réactionnels observés
3.1.2. Fixation de l’oxygène
3.1.3. Stabilité du complexe FeIIO2
3.1.4. Piégeage et caractérisation du radical H4B+•
3.2. Oxydation du NOHA
3.2.1. Intermédiaires réactionnels observés
3.2.2. Fixation de l’oxygène et libération du NO•
3.2.3. Stabilité du complexe FeIIO2
3.2.4. Piégeage et caractérisation du radical H4B+•
3.3. Influence de la nature du cofacteur
3.3.1. Hydroxylation de l’arginine
3.3.2. Oxydation du NOHA
3.4. Conclusion
4. Conclusion
Chapitre IV Etude spectroscopique et cinétique d’une NOS bactérienne originale : deiNOS
1. Introduction
2. Caractérisation
2.1. L’état FeIII
2.1.1. En absence de substrat et cofacteur
2.1.2. Conversion en FeIII haut-spin
2.1.3. Influence des substrats- Cas de la citrulline
2.1.4. Influence de la nature du cofacteur – Cas du tryptophane
2.2. Complexe FeIICO
2.3. Complexe FeIINO
2.3.1. Influence des substrats – Cas de la citrulline
2.3.2. Influence de la nature du cofacteur – Cas du tryptophane
2.3.3. Etude de l’espèce axiale
2.4. Conclusion
3. Activité
3.1. Production de nitrites
3.1.1. Peroxide shunt
3.1.2. Single turnover en présence de dioxygène
3.2. Hydroxylation de l’arginine
3.2.1. Intermédiaires catalytiques observés
3.2.2. Effets de la nature du cofacteur
3.2.3. Rôle et influence du cofacteur
3.3. Oxydation du NOHA
3.3.1. Réaction en présence de H4B
3.3.2. Réaction en présence de H4F
3.3.3. Rôle et influence du cofacteur
3.4. Conclusion
4. Structure tridimensionnelle
4.1. Construction de la structure
4.2. Dynamique moléculaire
4.2.1. Stabilité du dimère en absence de cofacteur
4.2.2. Evolution en présence du cofacteur H4F
4.3. Conclusion
5. Conclusion
Chapitre V Etude complémentaire de deux NOS-like proteins issues de Geobacillus stearothermophilus et Ostreococcus tauri
1. Caractérisation d’une NOS bactérienne thermostable
1.1. Introduction
1.2. Etude spectroscopique
1.2.1. Etat natif FeIII
1.2.2. Complexe FeIICO
1.2.3. Complexe FeIINO
1.2.4. Conclusion
1.3. Etude cinétique
1.3.1. Hydroxylation de l’arginine
1.3.2. Oxydation du NOHA
1.3.3. Réactions en présence d’une ptérine oxydée
1.3.4. Conclusion
1.4. Conclusion
2. Etude partielle d’une NOS de plante
2.1. Introduction
2.2. Caractérisation
2.2.1. Etat natif FeIII
2.2.2. Complexe FeIICO
2.2.3. Complexe FeIINO
2.2.4. Conclusion
2.3. Etude cinétique
2.3.1. Hydroxylation de l’arginine
2.3.2. Oxydation du NOHA
2.3.3. Conclusion
2.4. Conclusion
Conclusion
Bibliographie

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