Transcriptome des cellules atteintes

Transcriptome des cellules atteintes

Etiologie

Le débat autour des causes de la maladie de Parkinson dure depuis quasiment aussi longtemps que l’identification de la maladie en 1877. L’opinion qui prévaut actuellement est que la maladie de Parkinson a une origine multifactorielle et résulte de l’interaction entre une prédisposition génétique et des facteurs environnementaux qui demeurent en grande partie inconnus. La contribution relative de chacun varie d’un individu à l’autre (Huang, 2003). Même dans les familles où plus d’un membre est atteint, l’influence prédominante peut être environnementale. Bien qu’elles soient en cause dans seulement une minorité des cas de la maladie, des mutations génétiques identifiées récemment ont fourni des indices précieux sur l’étiologie de la dégénérescence neuronale et ont permis de reconnaître l’importance d’un métabolisme protéique anormal dans la maladie de Parkinson. On peut donc classer la maladie de Parkinson en deux groupes : un groupe de cas sporadiques, les plus répandus dont les causes sont à découvrir, et un groupe de cas familiaux, très rares, dûs à des mutations génétiques. Dans cette partie nous allons faire le point sur les connaissances actuelles de l’etiologie génétique de la maladie de Parkinson et sur les facteurs environnementaux susceptibles d’être responsables de la maladie.

Génétique et facteurs génétiques de la maladie de Parkinson

Une des grandes avancées de ces dernières années a été la localisation et le clonage de gènes impliqués dans de rares cas de la maladie. Neuf gènes ont été mis en évidence pour leur lien avec la maladie de Parkinson et 3 ont été clairement identifiés (Hardy et al. , 2003). Cependant, toutes les mutations et loci identifiés jusqu’ici semblent être incriminés dans seulement un petit nombre de familles atteintes de la maladie de Parkinson. La base génétique de la maladie de Parkinson pour la vaste majorité des cas, qui ne présente pas un mode d’héritabilité mendélienne, reste toujours inconnue. Néanmoins, l’identification des déterminants génétiques de la maladie de Parkinson dans ces rares cas familiaux va fournir des indices importants sur le processus général de développement de la maladie de Parkinson et permettre ainsi une meilleure compréhension des troubles sporadiques plus communs de la maladie (Gasser, 2002). Nous relatons ici les trois principaux gènes identifiés dans des cas familiaux comme étant la cause de la maladie de Parkinson.

SNCA: La maladie de Parkinson est due à une mutation du gène SNCA, anciennement appelé PARK 1, codant pour l’α-synucléine SNCA est le premier gène/locus qui a été identifié comme « gène MP ». Il a été localisé sur le long bras du chromosome 4. Cette région contient le gène α-synucléine pour lequel deux mutations (A30P et A53T) ont été identifiées comme responsables de formes autosomiques dominantes de la maladie de Parkinson (Hardy, 2003). Ces mutations, qui sont une cause très rare de la maladie de Parkinson, ont été mises en évidence dans plusieurs familles grecques. L’α-synucléine est une protéine relativement petite qui est exprimée de manière abondante dans de nombreuses parties du cerveau et localisée principalement dans les terminaisons nerveuses présynaptiques. De nombreux aspects du fonctionnement normal de la protéine sont encore inconnus. Il a été montré que la protéine se lie aux vésicules et autres composants cellulaires et pourrait avoir un rôle dans la plasticité du cerveau (Gasser, 2002). Le tableau clinique chez les sujets atteints de cette forme de la maladie est très similaire à celui observé dans les cas idiopathiques de Parkinson, bien que l’âge moyen de début des symptômes soit moins élevé (environ 45 ans) et que l’évolution de la maladie semble plus rapide que dans les cas sporadiques de MP. L’identification d’ α-synucléine comme « gène MP » a conduit à la découverte que la protéine αsynucléine est l’un des principaux composants des corps de Lewy, inclusions éosinophiliques présentes dans les neurones dopaminergiques survivants, reconnus comme empreintes pathologiques de MP dans les cas familiaux et sporadiques. Nous mentionnerons les corps de Lewy et leurs caractéristiques plus loin dans ce chapitre. Ainsi, l’α-synucléine pourrait jouer un rôle crucial dans le développement de la maladie. L’hypothèse la plus favorisée actuellement suppose que les variations d’acides aminés dans la protéine α-synucléine associée à la maladie de Parkinson favorisent sa conformation en feuillets β, ce qui pourrait conduire à une augmentation de la tendance à l’agrégation de la protéine. Cependant la relation entre la formation des agrégats et la mort cellulaire reste inconnue. On peut supposer qu’une erreur dans la dégradation protéique de l’αsynucléine et d’autres protéines peut conduire à une accumulation de composants toxiques, conduisant irréversiblement à la mort cellulaire. La formation d’agrégats contenant l’α-synucléine serait alors un effet secondaire. L’élucidation de la voie moléculaire conduisant à l’agrégation d’α-synucléines et à la dégénérescence des neurones dopaminergiques va inévitablement générer de nouveaux gènes candidats permettant d’explorer d’autres facteurs génétiques dans les différents cas de maladies de Parkinson.

PARK 2 : Parkinsonisme juvénile autosomique récessif (AR-JP) dû à des mutations dans le gène parkine Des cas juvéniles de parkinsonisme avec une héritabilité récessive ont d’abord été identifiés au Japon (Gasser, 2002). Il a été montré depuis que cette forme de la maladie de Parkinson a une distribution mondiale et affecte, en particulier, de jeunes patients (apparition des premiers symptômes avant 50 ans ; Huang, 2003). Cliniquement, ces patients souffrent d’un parkinsonisme répondant à la lévopoda (L-DOPA) et certains montrent des fluctuations diurnes, avec des symptômes s’aggravant en fin de journée. D’un point de vue pathologique, on observe une dégénérescence sévère et sélective des neurones dopaminergiques dans la substance noire mais on ne met pas en évidence de corps de Lewy. Le fait que la présence de corps de Lewy ne semble pas nécessaire à la dégénérescence sélective des neurones dopaminergiques de la substance noire soulève une question intéressante : cette marque pathologique (les corps de Lewy) doit-elle être considérée comme un composant essentiel du processus de la maladie (Gasser, 2002) ? Le locus génétique de AR-JP a été localisé sur le chromosome 6 dans des populations japonaises ; et de multiples mutations ont été identifiées dans un grand gène de cette région appelé parkine, un gène à la fonction inconnue au moment de sa découverte. La parkine est une protéine trouvée à la fois dans le cytosol et associée à des membranes. Elle fonctionne comme une ubiquitine-protéine ligase (E3) dans la voie de dégradation cellulaire d’ubiquitination. La ligase est responsable de l’attachement de la protéine ubiquitine à ses substrats. Il est concevable que la perte de la fonction parkine puisse conduire à l’accumulation de substrats non liés à l’ubiquitine, délétères pour la cellule dopaminergique, qui n’étant pas ubiquitinés, ne s’agrègeraient pas en corps de Lewy. L’interaction possible entre l’α-synucléine et la parkine est à explorer. En effet cela pourrait fournir le lien entre le parkinsonisme juvénile associé à la parkine et la forme classique de MP (apparition tardive des premiers symptômes). Cependant, comme la parkine et l’α-synucléine sont toutes les deux des protéines exprimées abondamment dans le cerveau, ceci n’explique pas la sélectivité évidente du processus de dégénérescence des neurones dopaminergiques (Figure 2).

Table des matières

INDEX DES ILLUSTRATIONS
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
I. Connaissances actuelles sur la maladie de Parkinson
I.1. Epidémiologie
I.1.1. Age
I.1.2. Sexe
I.1.3. Origine ethnique
I.2. Symptômes cliniques et diagnostic de la maladie de Parkinson
I.2.1. Signes cliniques et diagnostic
I.2.2. Diagnostic différentiel
I.3. Etiologie
I.3.1. Génétique et facteurs génétiques de la maladie de Parkinson
I.3.2. Facteurs environnementaux
I.4. Anatomie, physiologie et physiopathologie
I.4.1. Anatomie fonctionnelle de la substance noire et physiologie
I.4.2. Physiopathologie
I.5. Neuropathologie et mécanismes pathologiques de la maladie de Parkinson
I.5.1. L’α-synucléine et synucléinopathies
I.5.2. Mécanismes impliqués dans la maladie de Parkinson
I.6. Traitements actuels et perspectives
I.6.1. Traitement pharmacologique
I.6.2. Traitement non pharmacologique (Krauss et Grossman, 2002)
I.6.3. Innovation thérapeutique (Storch et Schwarz, 2002)
II. Etude à grande échelle du transcriptome des cellules atteintes
II.1. Objectifs du projet de recherche
II.2. Mise en œuvre expérimentale et protocole
II.3. Résultats
II.4. Confirmation des résultats et analyses complémentaires
SECONDE PARTIE ETUDE PERSONNELLE
CHAPITRE PREMIER INTRODUCTION
I. Principe de l’Hybridation In Situ (HIS)
II. Le choix de la sonde
II.1. Les différents types de sondes disponibles
II.1.1. Sondes ADN double brin
II.1.2. Oligonucléotides (ADN synthétique)
II.1.3. ARN
II.2. Les différents types de marquages
II.2.1. Marquage radioactif
II.2.2. Marquage antigénique
II.3. Considérations techniques pour la conception de la sonde
II.4. Choix raisonné du type de sonde et du type de marquage optimaux
II.4.1. Type de sonde
II.4.2. Type de marquage
III. Les grandes étapes
III.1. Conditions d’hygiène
III.2. Préparation des tissus
III.2.1. Fixation des tissus
III.2.2. Stockage des tissus
III.3. Hybridation
III.4. Lavages post-hybridation
III.5. Etape de révélation
III.6. Visualisation
III.7. Contrôles
CHAPITRE DEUXIEME MATERIELS ET METHODES
I. Hybridation in situ
I.1. Les sondes : GFAP et ß-actine
I.1.1. GFAP
I.1.2. ß-actine
I.2. La cible : Animaux et tissu
I.2.1. Les animaux
I.2.2. Tissus cibles
I.3. Protocole d’hybridation in situ (annexe B)
I.3.1. Préparation des coupes de tissu
I.3.2. Prétraitement des coupes de tissu
I.3.3. Hybridation
I.3.4. Lavages des lames
I.3.5. Détection et visualisation des hybrides
I.3.6. Contrôles
II. Immunocytochimie
CHAPITRE TROISIEME RESULTATS
I. Hybridation in situ
II. Immunocytochimie
CHAPITRE QUATRIEME DISCUSSION
I. Bilan des expériences
II. Comparaison des résultats avec la littérature
III. Critique de la méthode
III.1. Absence de signal
III.1.1. Hypothèse 1 : Médiocre qualité des solutions et des tissus
III.1.2. Hypothèse 2 : Accès à la cible difficile
III.1.3. Hypothèse 3: Médiocres conditions d’hybridation
III.1.4. Hypothèse 4: Concentration en sonde insuffisante
III.1.5. Hypothèse 5: Sensibilité de la méthode de détection
III.1.6. Hypothèse 6 : Absence de spécificité de la sonde
III.2. Bruit de fond
IV. Perspectives
IV.1. Qualité de la méthode
IV.2. Sensibilité de la méthode
IV.3. Synthèse d’une nouvelle sonde
IV.4. Validation des résultats des microarrays
CONCLUSIO
ANNEXES
ABREVIATIONS
BIBLIOGRAPHIE

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