Traitement des prélèvements capillaires au laboratoire

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Phase sexuée chez le moustique

Depuis plus d’un siècle chez l’anophèle, la biologie de Plasmodiums a fait l’objet de très nombreuses études (Grassi et al., 1899 ; Beier, 1998 ; Sinden, 1999 ; Milon et David, 1999 ; Collins et al., 1999 ; Dimopoulos et al., 1999 ; Brey, 1999 ; Zheng, 1999 ; Tahar et al., 2002 ; Sinden et al., 2007 ; Gokhale et al., 2007).
La phase sexuée chez le moustique recouvre plusieurs étapes distinctes : la gamétogenèse, la fécondation, le stade oocinète, le stade oocyste dans lequel s’effectue la sporogenèse et la libération des sporozoïtes qui colonisent les glandes salivaires. De façon schématique, quatre éléments caractérisent le développement du Plasmodium chez le moustique :
Ŕ la gamétogénèse et la fécondation du Plasmodium se réalisent dans l’abdomen du moustique qui est donc l’hôte définitif du Plasmodium et par conséquent, l’homme est un hôte intermédiaire .
Ŕ la fécondation achevée, le zygote de Plasmodium se différencie en un oocinète mobile qui traverse la paroi stomacale pour se transformer en un oocyste où se développent de nombreux sporozoïtes qui, à maturité, vont envahir les glandes salivaires et être présents dans la salive de l’anophèle .
Ŕ le Plasmodium passe par plusieurs phases de réduction de densité et de multiplication (Beier, 1998) durant son développement chez le moustique, du gamétocyte au sporozoïte.
La fécondation des macrogamètes par un microgamète, conduit à le formation des 5 à 6 oocinètes, 2 de ces oocinètes deviendront des oocystes dans les 2 à 7 jours suivant le repas infectant. Chaque oocyste produit des milliers de sporozoïtes dont une partie d’entre eux, seulement estimés à 10 à 20 %, vont gagner les glandes salivaires où ils vont subir une maturation qui les rend infectants (Sultan et al., 1997; Rosenberg et Rungsiwongse ,1991 ; Hillyer et al., 2007).
Ŕ la durée de l’ensemble du développement sporogonique est fonction, notamment, de l’espèce plasmodiale et des conditions de température (Detinova, 1962).

Cycle Exo-érythrocytaire (multiplication dans le foie)

L’infestation naturelle de l’homme se fait par inoculation des sporozoïtes pendant la piqûre d’un moustique du genre Anopheles précédemment infecté. Les parasites ne restent pas plus d’une demi-heure dans le sang, puis vont se réfugier dans les hépatocytes (dans le foie) où ils se multiplient dans le cytoplasme en formant de volumineuses cellules plurinucléées appelées schizontes hépatocytaires. Quand ces schizontes sont mûrs, la cellule-hôte est lysée et libère autant de mérozoïtes qu’il y avait de noyaux dans le schizonte. Cette période dure une à trois semaines.

Cycle Erythrocytaire (multiplication dans le globule rouge)

Ces mérozoïtes gagnent la circulation sanguine et colonisent les globules rouges. Ils deviennent alors des trophozoïtes intra-érythrocytaires qui, à leur tour, subissent une schizogonie (division multiple). A maturité, les schizontes intra-érythrocytaires sont appelés corps en rosace. En lysant leur cellule-hôte, ils se scindent libérant dans le sang des mérozoïtes qui vont entamer un nouveau cycle érythrocytaire.
Après plusieurs cycles érythrocytaires, la reproduction sexuée ou gamogonie débute et aboutit à la formation des gamétocytes.

Cadre de l’étude

La méthodologie adoptée a été une étude transversale unique et comparative ; c’est-à-dire la comparaison des effets des deux stratégies de lutte antivectorielle dans les deux sites dans un temps déterminé et sans répétition. Pour cela des collectes de données parasitologiques et entomologiques ont eu lieu à Ankilivalo (traité par la CAID) et Antsaribao (traité par la MID).

Durée de l’étude

Le PNLP a effectué une campagne de distribution de Moustiquaire Imprégnée d’Insecticide à efficacité Durable au mois de novembre 2010 à Antsaribao et une Campagne d’Aspersion Intradomiciliaire au mois d’avril 2013 à Ankilivalo. Puis une étude parasitologique et entomologique a été effectuée du 14 juin 2013 au 23 juin 2013 dans ces deux fokontany. Enfin, les lames collectées pendant l’étude parasitologique ont été observées au laboratoire du PNLP au mois de juillet et au mois d’août 2013.

Populations d’études

Au cours de ce travail dans le site traité par la MID et par la CAID, les anophèles ont été utilisés pour l’accomplissement de l’étude entomologique tandis que pour effectuer l’étude parasitologique de Plasmodiums après des prises de sang chez les enfants d’âge divers qui se sont portés volontaires au sein des établissements scolaires publics.

Insecticides utilisés lors de l’imprégnation de la MID et pendant CAID

L’insecticide utilisé lors de la CAID a été une substance active obtenue par une préparation susceptible de tuer plusieurs insectes voire même d’autres Arthropodes, tels que les acariens, leurs larves et /ou leurs oeufs. Il appartient au groupe des pesticides. Les principaux insecticides rémanents appartiennent à 5 familles chimiques : les organochlorés, les organophosphorés, les carbamates, les pyrethrinoïdes et les benzoylures. Parmi ces différentes familles, les carbamates étaient les insecticides utilisés lors de la Campagne d’Aspersion Intradomiciliaire dans le fokontany d’Ankilivalo. L’aspersion au carbamate au niveau des murs a été procédée suivant la dose de 400 mg de poudre mouillable par mètre carré pour une durée de rémanence de six mois. Le choix de ce produit est basé sur les raisons suivantes : ils ont généralement une action rapide, ils ne sont pas toxiques pour l’homme, aucun risque d’intoxication autant pour les habitants que pour les aliments trouvés généralement dans les maisons.

La MID (figure 6 et 7)

Les moustiquaires imprégnées d’insecticides à efficacité durable ou MID sont considérées comme un outil de prévention et de lutte efficace contre les moustiques vecteurs. Les seuls insecticides actuellement recommandés par l’OMS sont des pyrethrinoïdes dont l’action rapide entraîne un effet  » knockdown « (effet de paralysie des muscles et du système nerveux des insectes) par contact et une mortalité élevée chez les moustiques.
La dernière campagne de distribution universelle de la MID pour le PNLP a été en novembre 2010 dans les différents districts de Madagascar. Cette campagne de distribution de la MID peut être divisée en deux systèmes, soit une distribution universelle, soit une distribution de routine. La distribution universelle consiste à donner une moustiquaire pour deux personnes par maison. En ce qui concerne la distribution de routine, il s’agit de donner une moustiquaire pour trois personnes.

Traitement des prélèvements capillaires au laboratoire Traitement des gouttes épaisses

L’observation de ces gouttes épaisses se fait au microscope optique, à l’objectif x100 en utilisant de l’huile à immersion après fixation à l’alcool (méthanol à 90°) et coloration au Giemsa à 10% c’est-à-dire 10ml de Giemsa pure pour 90 ml d’eau de dilution, pendant 10 minutes puis rincer à l’eau distillée. Ce produit colore le cytoplasme des Plasmodium en bleu alors que la chromatine composante du noyau est colorée en rouge intense. Quand l‘hémoglobine est dissoute, ils ne restent que les parasites, les plaquettes et les globules blancs qui ont été visibles au microscope. Le dénombrement des parasites a été réalisé par rapport au nombre de leucocytes au niveau de la goutte épaisse.

Capture nocturne des moustiques sur des appâts humains

Pour chaque site, les captures sur sujet humain ont été réalisées par douze hommes adultes volontaires qui ont servi à la fois d’appâts et de captureurs, préalablement formés aux techniques de capture nocturne des moustiques. Les captures de moustiques se sont déroulées simultanément à l’intérieur et à l’extérieur des maisons (dans la cour) de 19 heures du soir à 6 heures du matin pendant 10 nuits consécutives. Dans chaque maison, chaque captureur a été équipé d’une torche, de tubes à hémolyse, de coton et de sachets portant le nom du lieu et les tranches d’heure de la capture. Les moustiques qui se sont posés sur les jambes dénudées des captureurs ont été prélevés à l’aide d’un tube à hémolyse avant la piqûre. Puis, les tubes ont été bouchés par du coton pour empêcher l’envol des moustiques.

Détermination des moustiques capturés (Annexe V)

Tous les Culicidae collecté ont été identifié à partir de la clé de détermination des espèces anophèliennes. Cette clé est basée sur les caractères morphologiques. Puis les vecteurs ont été comptabilisés afin d’évaluer le nombre de piqûres par homme et par nuit.
An. gambiae sl a été déterminé par les différents critères suivants :
– des segments abdominaux sans touffes latérales d’écailles saillantes.
– des pattes tachetées de pâle.
– les segments 4 et 5 du tarse postérieur partiellement ou entièrement sombres
– les ailes avec une tâche claire sur la troisième aire principale de la première nervure.
An. funestus a été déterminé par les caractères cités ci-après :
– des segments 4 et 5 des tarses postérieurs partiellement sombres.
– les fémurs antérieurs sans tâche ou anneau pâle préapical.
– les nervures 6 des ailes presque entièrement sombre
– palpes avec les 2 anneaux pâles apicaux étroits, articles 1 à 4 des tarses postérieurs sombres.
An. mascarensis a été déterminé par les caractères distinctifs suivants :
– des segments 4 et 5 des tarses postérieurs au moins partiellement sombres
– la troisième zone principale de la première nervure est interrompue par une tâche pâle.

Table des matières

INTRODUCTION
I. GENERALITES
I-1-Espèces vectrices
I-2-Agents pathogènes
a) Phase sexuée chez les moustiques
b) Phase asexuée chez l’homme
II. MATERIELS ET METHODES
II-1-Sites d’étude
a) Fokontany d’Ankilivalo
b) Fokontany d’Antsaribao
II-2- Cadre de l’étude
II-3- Durée de l’étude
II-4-Populations d’étude
II-5-Déroulement de l’étude
i-Insecticides utilisés pendant la MID et la CAID
ii-Etude parasitologique
a-Prélèvements capillaires
b-Traitement des prélèvements capillaires au laboratoire
iii-Etude entomologique
a-Capture nocturne des moustiques sur des appâts humains
b-Capture diurne de la faune résiduelle
c-Traitement des espèces collectées
c.1 Détermination des moustiques capturés
c.2 Dissection des ovaires
c.3 Dissection des glandes salivaires
c.4 Détermination de l’indice parasitologique
c.5 Détermination des indices entomologiques
c.6 Analyse statistique
III .RESULTATS ET INTERPRETATIONS
III-1-Etude parasitologique
a-Répartition des enfants selon leur âge et leur sexe
b-Résultat d’observation des lames au microscope
III-2- Etude entomologique
a-Vecteurs du paludisme déterminés dans les deux sites
b- Abondance des moustiques par espèces dans les deux sites
c-Densité agressive des trois espèces vectrices
d-Taux d’endophilie des espèces vectrices
e-Infectivité
f-Taux de parturité, taux quotidien de survie, espérance de vie des trois espèces vectrices
g-Taux d’inoculation entomologique
h-Variations du nombre des espèces vectrices collectées
IV-DISCUSSION
CONCLUSION ET RECOMMANDATIONS
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES et Webographie

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