Soutenance mémoire
Le contrôle de T.absoluta, dans son aire d’origine, a principalement été effectué par l’utilisation de molécules chimiques permettant une lutte efficace et rapide (Guedes & Picanço, 2012; Guedes & Siqueira, 2012; Tomé et al., 2012). Cependant, leur emploi intensif a conduit rapidement au développement d’une résistance (Silva et al, 2011; Gontijo et al., 2013; Guedes & Siqueira, 2012 ; Haddi et al., 2012); il a été rapporté une tolérance aux organophosphorés, carbamates, pyréthroïdes, benzoylurées, avermectine mais aussi à l’indoxacarbe chez des populations de T. absoluta, en provenance du Brésil, Chili et Argentine (Souza et al., 1992 ; Guedes et al., 1994; Siqueira et al., 2000, 2001 ; Salazar & Araya 2001; Lietti et al., 2005; Silva et al., 2011). Par conséquent, une problématique dans la lutte de ce ravageur est posée. En effet, la dispersion de cette mineuse avec une résistance acquise aux différents pesticides utilisés impose des choix nouveaux dans la gestion de ce fléau; par ailleurs, les effets néfastes de ces molécules sur les ennemis naturels et les pollinisateurs ont été mis en évidence (Desneux et al., 2007; Biondi et al., 2012, 2013).
La littérature cite différentes stratégies de contrôle de T. absoluta, notamment la lutte biologique dans les programmes de gestion intégrée des ravageurs ou IPM (Mollá et al., 2011;.Vacas et al., 2011;. Zappala et al., 2012). Les agents de lutte biologique ou les ennemis naturels (prédateurs, parasitoïdes et agents pathogènes) ont été considérés comme une solution possible pour la gestion de T. absoluta (Desneux et al., 2010; Öztemiz, 2013). Cette stratégie offre une alternative plus durable et moins onéreuse par rapport aux produits chimiques (Vivan et al., 2003; Medeiros et al., 2006; Bale et al., 2008; Urbaneja et al., 2012). A travers le monde, plus de 70 espèces d’ennemis naturels de T. absoluta, ont été recensées; il s’agit majoritairement d’insectes appartenant principalement à l’ordre des Miridae, Anthociridae et Nabidae (Zappala et al., 2013). Dans le bassin méditerranéen, divers prédateurs et parasitoïdes attaquent, spontanément, T. absoluta; tels que Macrolophus pygmaeus Rambur, et Nesidiocoris tenuis Reuter (Desneux et al., 2010; Shaltiel-Harpaz et al., 2016) (Fig. 5), ou encore Necremnus artynes Walker et Necremnus tutae (Gabarra et al., 2010 ; Calvo et al., 2016) Certains prédateurs, comme les Miridae, ont déjà été employés dans les programmes IPM spécifiques de T.absoluta (Castané et al., 2011; Molla et al., 2011; Cabello et al., 2012; Zappala et al., 2012; Chailleux et al., 2013); ainsi, plus de 50 espèces appartenant pour la plupart à la famille des Eulophidae dont Neochrysocharis formosa Westwood (Fig 6) ou Closterocerus formosus Westwood (Noyes, 2013) ont été utilisées.
Traitement des insectes et tests de toxicité
La formulation commerciale du Spinosad a été utilisée, par application topique (1 µl par insecte) sur des larves du dernier stade de T. absoluta. Le Spinosad a été dilué dans l’acétone et après un screening préalable, différentes doses 30, 40, 80, 120, 240, 2400, 6000 ng ont été testées. L’essai pour chaque dose est conduit en utilisant 3 réplications qui comportent chacune 30 insectes; une série témoin est conduite en parallèle et les individus reçoivent uniquement le solvant (1 μl). Cette série d’expérience a été menée afin de caractériser la toxicité du Spinosad à l’égard de T.absoluta en déterminant les doses correspondant à 50 et 90% d’inhibition de la mue nymphale nommées ensuite DI 50 et DI 90 respectivement.
Les pourcentages d’inhibition observée pour les séries témoins et traitées, ont été obtenus à partir des mues nymphales incomplètes, des larves mortes ou bloquées dans leur exuvie. Ces valeurs sont ensuite corrigées selon Abott (1925) afin d’éliminer la mortalité naturelle et / ou l’inhibition. Les pourcentages d’inhibition corrigées, après transformation angulaire (Fisher et Yates, 1957) subissent une analyse de variance suivie du test HSD de Tukey afin d’établir l’effet du pesticide et le classement des doses. Enfin, la régression non linéaire exprimant le pourcentage d’inhibition corrigée en fonction du logarithme de la dose a permis d’estimer, les doses d’inhibition DI50 et DI90 avec leurs limites de confiance (95% FL) et le Hill Slope. Tous les traitements utilisés ont été réalisées à la DI50 de la mue nymphale. L’échantillonnage a été menée pendant deux générations successives: la génération parent (G0) et sa descendance (G1) à différents stades de développement.
Extraction et dosage des métabolites
Extraction des métabolites
L’extraction des différents métabolites (protéines, glucides et lipides) a été réalisée selon le procédé de Shibko et al. (1966). Les corps entiers des larves, nymphes et adultes des séries témoins et traitées de la G0 et la G1 de T.absoluta sont conservés dans 1 ml d’acide trichloracétique (TCA) à 20% jusqu’au dosage. Tous les dosages ont été effectués sur des fractions aliquotes (100 µl), les teneurs dans les différents métabolites ont été quantifiés par des droites de régression déterminées à partir des courbes de références.
Dosage des métabolites
Dosage des protéines
Les protéines ont été quantifiées selon la méthode de Bradford (1976) qui utilise le bleu brillant de coomassie¹ (G 250) comme réactif et l’albumine de sérum de bœuf (BSA) comme standard (1mg/ml) La lecture des absorbances est réalisée à une longueur d’onde de 595 nm .
Dosage de la catalase (CAT)
Le dosage de la catalase (CAT), réalisé selon la méthode de Claiborne (1985), a permis l’évaluation de l’activité spécifique de la catalase. Cette méthode est basée sur la mesure spectrophotométrique de la réduction de l’eau oxygénée (H2O2) en une molécule d’oxygène (O2) et deux molécules d’eau (H2O2) en présence de la CAT à une longueur d’onde UV de 240 nm. Les séries témoins et traitées de T.absoluta, échantillonnées à différents âges et stades de développement, sont homogénéisés dans 1ml de tampon phosphate (0,1 M, pH7, 4) à l’aide d’un broyeur à ultrasons. L’homogénat, ainsi obtenu, est centrifugé (15,000 tours /min, pendant 10 min) puis le surnageant récupéré servira au dosage de la catalase. Le dosage s’effectue, à température ambiante, sur une fraction aliquote de 50 μl de surnageant à la quelle on ajoute 750 μl de tampon phosphate (100 mM, pH 7,4) et 200 μl H2O2 (500 mM) préparé extemporanément [1,42 ml eau oxygénée à 30 volumes, 25 ml tampon phosphate (100 mM pH 7,4)]. Après agitation, la lecture est effectuée au spectrophotomètre (dans une cuve en quartz).
L’activité décroit rapidement, il est donc important de mettre toujours le même temps entre le pipetage du surnageant et le moment où la cuve est placée dans le spectrophotomètre. La lecture des absorbances est effectuée après 15 secondes toutes les 5 secondes pendant 30 secondes à une longueur d’onde UV de 240 nm contre un blanc réalisé avec 800 μl de tampon phosphate (100 mM, pH 7,4) et 200 μl de H2O2.
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Table des matières
INTRODUCTION
MATERIEL ET METHODES
1. Matériel biologique
1.1. Présentation de T. absoluta
1.2. Élevage en laboratoire
2. Présentation de l’insecticide
3. Traitement des insectes et tests de toxicité
4. Extraction et dosage des métabolites
4.1. Extraction des métabolites
4.2. Dosage des métabolites
1. Dosage des protéines
2. Dosage des glucides
3. Dosage des lipides
5. Dosage de la catalase (CAT)
6. Dosage de l’acétylcholinestérase (AChE)
7. Dosage des glutathion S-transférases (GSTs)
8. Extraction et dosage des vitellines et vitellogénines
8.1. Echantillonnage
8.2. Extraction des vitellines et vitellogénines
8.3. Dosage des vitellines et des vitellogénines
9. Analyse statistique
RESULTATS
1. Evaluation de la toxicité du Spinosad chez T.absoluta
2. Effets du Spinosad sur les biomarqueurs enzymatiques
2.1. Effets sur l’activité spécifique des GSTs chez la G0 et la G1
2.1.1. Effets chez les nymphes de la G0
2.1.2. Effets chez les adultes de la G0
2.1.3. Effets chez les larves de la G1
2.1.4. Effets chez les nymphes de la G1
2.1.5. Effet chez les adultes de la G1
2.1.6. Effet sur les GSTs : Comparaison entre les deux générations
2.2. Effets sur l’activité spécifique de la CAT pour la G0 et la G1
2.2.1. Effets chez les nymphes de la G0
2.2.2. Effets chez les adultes de la G0
2.2.3. Effets chez les larves de la G1
2.2.4. Effets chez les nymphes de la G1
2.2.5. Effets chez les adultes de la G1
2.2.6. Effets sur la CAT : comparaison entre les deux générations
2.3. Effet du Spinosad sur l’activité spécifique de l’AChE chez la G0 et la G1
2.3.1. Effets chez les nymphes de la G0
2.3.2. Effets chez les adultes de la G0
2.3.3. Effets chez les larves de la G1
2.3.4. Effets chez les nymphes de la G1
2.3.5. Effets chez les adultes de la G1
2.3.6. Effets sur l’AChE : comparaison entre les deux générations
3. Effets du Spinosad sur les métabolites dans le corps entier
3.1 Effets sur les protéines chez la G0 et la G1
3.1.1. Effets chez les nymphes de la G0
3.1.2. Effets chez les adultes de la G0
3.1.3. Effets chez les larves de la G1
3.1.4. Effets chez les nymphes de la G1
3.1.5. Effets chez les adultes de la G1
3.1.6. Effets sur les protéines : comparaison entre les deux générations
3.2. Effets sur les glucides chez la G0 et la G1
3.2.1. Effets chez les nymphes de la G0
3.2.2. Effets chez les adultes de la G0
3.2.3. Effets chez les larves de la G1
3.2.4. Effets chez les nymphes de la G1
3.2.5. Effets chez les adultes de la G1
3.2.6. Effets sur les glucides : comparaison entre les deux générations
3.3. Effets sur les lipides chez la G0 et la G1
3.3.1. Effets chez les nymphes de la G0
3.3.2. Effets chez les adultes de la G0
3.3.3. Effets chez les larves de la G1
3.3.4. Effets chez les nymphes de la G1
3.3.5. Effets chez les adultes de la G1
3.3.6. Effets sur les lipides : Comparaison entre les deux générations
4. Effets du Spinosad sur les vitéllogénines chez les nymphes femelles de T. absoluta
4.1. Effets chez les nymphes de la G0
4.2. Effets chez les nymphes de la G1
4.3. Effets sur les vitéllogénines : comparaison entre les deux générations
5. Effets du Spinosad sur les vitellines ovariennes chez les adultes femelles
5.1. Effets chez les adultes de la G0
5.2. Effets chez les adultes de la G1
5.3. Effets sur les vitellines ovariennes: comparaison entre les deux générations
DISCUSSION
1. Activité insecticide
2. Effet du Spinosad sur les Biomarqueurs enzymatiques
2.1. Effets sur les GSTs et la Catalase
2.2. Effets sur l’AChE
3. Effets sur les métabolites
4. Effets sur les vitellogénines et vitellines
CONCLUSION
