Traitement des images microscopiques 

Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études

Levure : modèle de cellule eucaryote

Les levures sont définies comme l’ensemble des champignons monocellulaires appartenant au phylum des ascomycètes. Saccharomyces cerevisiae est un ascomycète.
La levure est un eucaryote (du grec eu, vrai et caryon, noyau). Les eucaryotes constituent un groupe d’organismes unicellulaires ou pluricellulaires définis par leur structure cellulaire. Un eucaryote est composé d’un vrai noyau, entouré d’une enveloppe nucléaire et contenant des jeux semblables de chromosomes. L’unité de structure d’un eucaryote est la cellule et c’est par cet terme que nous décrirons la levure dans toute cette étude.
Pour comprendre l’intérêt porté à la levure depuis le XIXème siècle, il faut savoir que les eucaryotes constituent un des trois domaines du vivant, avec les archéobactéries et les eubactéries. Les eucaryotes sont composés de sous classes :
– Embryophytes
– Champignons (Microsporidies, Basidiomycètes, Ascomycètes dont Saccharomyces ce-revisiae )
– Animaux
+ Protosomiens (Insectes, Nématodes )
+ Deutérostomiens
⋆ Poissons à nageoires rayonnées
⋆ Mammifères dont Homo Sapiens
En considérant cette classification abrégée, il est clair que maîtriser le fonctionnement d’une cellule eucaryote comme Saccharomyces cerevisiae peut contribuer à la compréhension de la nature des être humains.
En effet, tous les eucaryotes possèdent :
– des organites, divisant l’espace cellulaire en zones dont la fonction est définie, tels le noyau (contenant l’ADN), les mitochondries, le réticulum endoplasmique, l’appareil de Golgi, les lysosomes, les peroxysomes, les chloroplastes et vacuoles chez les plantes,
– un cytosquelette ou paroi, composé essentiellement d’actine et de myosine,
– la faculté à réaliser l’endocytose,
– un ADN divisé et compacté en chromosome lors de la division cellulaire,
– une division cellulaire appelée mitose,
– une véritable sexualité, où chaque type sexuel apporte une part égale de matériel génétique.
Actuellement, les levures sont un outil puissant pour le génie génétique et les biotechnologies. Etant donné que les levures sont des microorganismes qui se reproduisent rapidement et qui sont faciles à cultiver, ils constituent un outil favorable pour la génétique. La génétique est l’étude des caractères héréditaires et leurs variations ; les enjeux médicaux sont innombrables pour l’espèce humaine. La levure possède un plasmide, (petit filament d’ADN circulaire) dans lequel il est assez facile d’introduire des gènes étrangers à la levure, l’obligeant à synthétiser le programme du gène introduit. En génie génétique, l’objectif est de mettre en oeuvre in vivo des recombinaisons génétiques avec comme champs d’étude l’agriculture, l’industrie et la santé publique. D’ailleurs la levure est le premier eucaryote dont le génome a été intégralement séquencé en 1996. C’est ainsi, par exemple, que l’on a introduit le gène producteur de la capside du virus de l’hépatite B, et que cette levure peut être utilisée pour la production du vaccin contre cette maladie. La levure est une base expérimentale idéale pour les manipulations génétiques.
Par ailleurs, les levures occupent une place prépondérante dans l’industrie alimentaire : les bière, les vins, les cidres, la panification, le fromage, etc. . De plus elles contribuent à la revalo-risation des déchets agricoles et industriels, ainsi qu’à la production de protéines.
La levure est un formidable modèle d’étude pour les scientifiques car ce champignon uni-cellulaire est un organisme eucaryote (son patrimoine génétique est contenu dans un noyau), semblable donc aux cellules des organismes supérieurs. Pouvant se reproduire rapidement, faciles à cultiver et à manipuler (grâce au séquencage du génome), la levure est un modèle simplifié des cellules qui composent l’être humain.

Description

Saccharomyces cerevisiae est une cellule oblongue, de forme elliptique.
Une cellule est entourée d’une enveloppe rigide, la paroi, qui entoure une seconde enveloppe plus mince et délicate, la membrane cytoplasmique. Le cytoplasme, très homogène, contient des granulations d’acide ribonucléiques, les ribosomes. Dans le cytoplasme, le noyau ou l’appareil nucléaire se distingue par son aspect fibrillaire, finement réticulé.
Paroi, membrane, cytoplasme et noyau sont les structures de la cellule et sont toujours présents pour décrire une cellule.
La paroi est aussi appelée exosquelette ; elle est est l’enveloppe caractéristique de la cellule eucaryote. La paroi est rigide et représente 20 % du poids sec de la cellule ; elle fournit à la cellule sa forme caractéristique.
Notons que c’est cet exosquelette que nous serons amenés à utiliser afin de caractériser les cellules. Les contours que nous aborderons, devront correspondre à la paroi de la cellule. En effet, la paroi est formée de trois couches dont l’épaisseur totale varie entre 150 et 230 nm. Par contre, la membrane, d’une épaisseur d’environ 7.5 nm est trop fine pour être perçue par un microscope optique qui n’est plus efficace pour des objets inférieurs à 100nm. Extraire l’exosquelette permet de décrire la cellule.

Reproduction – croissance – division cellulaire

Bourgeonnement

Afin de mesurer le nombre de cellules, deux termes sont souvent utilisés : croissance et di-vision cellulaire. Une première définition de croissance [Thu04], est l’augmentation globale de la biomasse de la population, indépendamment du fait que les cellules se divisent ou non. La division cellulaire est mesurée en suivant le nombre individuel de cellules. La biomasse est la mesure de la masse cellulaire et comprend aussi bien les cellules mortes que les cellules vivantes. La croissance ainsi définie n’exprime pas la reproduction des cellules.
Par contre, une autre définition de croissance [Mey04], traduit un accroissement ordonné de tous les composants d’un organisme chez les microorganismes unicellulaire, elle n’aboutit pas à une augmentation de la taille de la cellule, mais à une augmentation du nombre de cellules. Nous nous intéresserons à la reproduction et donc à la multiplication des levures.
La reproduction des levures se réalise, soit par voie asexuée, c’est le bourgeonnement, soit par voie sexuée, c’est la sporulation. Les levures utilisent principalement le bourgeonnement en conditions favorables de croissance. La sporulation n’apparaît que quand les conditions de-viennent défavorables : la reproduction est un acte de défense pour survivre.
Bourgeonnement : une petite hernie apparaît en un point de la surface d’une cellule mère, grossit et s’étrangle ; le bourgeon ou cellule fille peut alors se détacher, grossir encore, puis bourgeonner à son tour. Les anglophones caractérisent cette séparation spécifique à Saccharo-myces cerevisiae, par “budding”, qui se traduit par bourgeonnement.
Objectif : détecter un bourgeonnement de cellule.
La cellule bourgeonnante, par opposition à la cellule seule, est constituée en réalité de deux cellules. Isoler une des deux cellules revient à trouver le lieu de la formation du bourgeon. Il est appelé anneau de septines, ou anneau de cytocinèse, ou col. Dans la suite, ces points de formation du bourgeon, seront appelés points anguleux, qui se traduisent par un changement de courbure de la paroi à cet endroit, ou points d’inflexion.

Fermentation alcoolique

La croissance en continu de levures est la fermentation. Par fermentation, on définit aujour-d’hui tout processus biotechnologique faisant appel à des microorganismes. La croissance de ces microorganismes se déroule dans des cuves ou fermenteurs, où les conditions de culture diffèrent du produit formé que l’on souhaite produire, par exemple, de l’éthanol.
En effet, la croissance en continu doit aboutir à des produits formés après un certain temps.
Le but de ces cultures peut être
– de produire en quantité tels micro-organismes ou telle souche cellulaire, parce qu’ils pré-sentent en eux-mêmes un intérêt, par exemple production de levures pour l’industrie viti-cole.
– de produire et récupérer en quantité un métabolite que ces microorganismes ou ces cellules contiennent ou libèrent dans le milieu, par exemple production d’hormones à partir de microorganismes modifiés génétiquement.
– d’utiliser les microorganismes pour modifier un milieu (bio-transformation), par exemple dans le cas de valorisation de déchets agricoles.
Les fermenteurs font partie des bioréacteurs et permettent la culture de tous types de cellules. Les bioréacteurs sont des milieux de culture qui peuvent être alimentés. Par ailleurs, il est possible d’influencer les cultures, ainsi que de contrôler et de piloter les paramètres à l’aide de capteurs physico-chimiques pour mesurer, par exemple, la température (du milieu de culture), la vitesse d’agitation, le pH, le taux d’oxygène dissous, les gaz en entrée et sortie, etc. .
Il existe trois systèmes de culture en phase liquide :
– la culture en discontinu (en anglais batch) : volume du fermenteur constant sans renou-vellement de milieu,
– la culture en discontinu alimentée (en anglais fed-batch) : addition contrôlée de certains composants en cours de fermentation,
– la culture en continu (turbidostat et chémostat).
Les systèmes les plus en vogue sont les culture discontinues qui sont plus flexibles, plus sûres et plus simples de conception. Cependant, même s’ils présentent moins de flexibilité, les systèmes en continu sont plus rentables.
Un fermenteur est représenté figure 1.4.
Concrètement, nous nous situerons au niveau de l’analyse des prélèvements par la microscopie optique afin de caractériser les levures cultivées par le fermenteur.

Techniques d’étude de la croissance

Mesure du nombre de cellules

Dénombrer les cellules d’un fermenteur revient à évaluer les différentes populations de levures présentes. Plusieurs techniques peuvent être utilisées :
– l’utilisation d’un hématimètre comme une cellule de Thoma ou de Malassez avec un mi-croscope [Uss99] ; correspond au comptage des levures en fonction d’une surface ou d’un volume connu. En utilisant un colorant, par exemple le bleu de méthylène, il est possible aussi de différencier les cellules vivantes des cellules mortes ; les cellules mortes “absorbant” le colorant.
– le compteur de particules permet le dénombrement automatique des cellules et ne fait pas la distinction entre cellules vivantes et mortes.
– la cytométrie de flux permet de détecter le nombre de cellules en utilisant un fluoro-chrome et un détecteur UV, mais prend en compte toutes les cellules (viables et mortes).
– l’épifluorescence : les levures sont coloriées par un fluorochrome ; les cellules vivantes sont fluorescentes dans une couleur alors que les cellules mortes le sont dans une autre couleur.
– la boîte de Pétri qui dénombre les cellules après leur culture.
A part l’oeil humain et l’utilisation d’un microscope, il n’y a pas de méthode particulière pour dénombrer les bourgeons. Il y a une cellule mère et une cellule fille, à partir du moment où l’oeil détecte que l’axe principal de la cellule fille est inférieur ou égal au tiers de l’axe principal de la cellule mère [Laf88].

Mesure de la biomasse

La biomasse est la notion la plus courante quand il s’agit d’évaluer la quantité de cellules présentes dans un fermenteur ; elle peut être mesurée par le poids sec ou la turbidimétrie.
Détermination du poids sec
Le poids sec est la mesure de référence qui mesure les paramètres spécifiques tels que la vitesse de croissance ou le taux de production de métabolite. La mesure du poids sec (en grammes de matières sèche par litre) totalise la masse cellulaire (vivante et morte), après des opérations de lavage et de refroidissement.
Turbidimétrie
La mesure du trouble ou la turbidimétrie est une méthode optique. Elle mesure le pourcentage de lumière transmise (I0), par rapport à l’intensité de la lumière incidente (I). Cette mesure se base sur la propriété que présente toute suspension de diffracter une partie de l’intensité d’un faisceau de lumière qui la traverse.
L’absorbance est log(I0/I) et peut s’écrire log(I0/I) = kCl, où k est le coefficient d’absorp-tion, C est la concentration de cellules (la biomasse) et l est l’épaisseur de la cuve traversée par le faisceau lumineux. L’absorbance est proportionnelle à la concentration cellulaire.

Acquisition d’images par la microscopie optique

Un des outils qui permet d’évaluer la croissance des cellules est la microscopie optique. Située en aval des prélèvements, un microscope optique couplé à un capteur d’acquisition sera notre matériel qui permettra la caractérisation des levures. Notons que le microscope fournit une image (une représentation) de quelque chose d’invisible à l’oeil nu.
Dans cette section, nous ne présenterons pas les processus mis en oeuvre afin d’obtenir une image par un microscope optique. La technique d’acquisition qui a été imposée est la microscopie fond noir qui permet de faire ressortir les détails de la cellule et particulièrement la paroi. Pour la détection du bourgeonnement, l’extraction de la paroi est une étape capitale pour caractéri-ser chaque contour. Bien que cette technique soit lourde à utiliser, l’objectif est de proposer un protocole d’acquisition qui fournit des images acquises dans des conditions identiques.

Microscopie optique

La microscopie est la technique d’observation la plus ancienne utilisée et il existe plusieurs variantes. Certes, le premier microscope date du XVIIème siècle, mais il a subi de grandes évolutions qui permettent de mieux explorer les microorganismes.
Modification de la lumière
Le principe de la microscopie optique est d’éclairer une préparation avec une source lumineuse.
Mais, en traversant un milieu, la lumière subit différentes modifications.
La lumiere est constituée par des trains d’ondes électromagnétiques émis par les atomes de la source lumineuse et qui se propagent dans l’espace jusqu’à un contact avec de la matière. Les trains d’ondes sont caractérisés par leur fréquence f , leur phase, et leur polarisation (orientation). La lumière est généralement référencée par sa longueur d’onde qui est inversement proportionnelle à la fréquence.
En contact avec la matière, les trains d’ondes sont considérées comme des particules discrètes que l’on nomme photons. Dans le microscope optique, la lumière fournie par la source subit différentes modifications en traversant le milieu.
L’absorbance d’un matériau est le rapport de l’intensité mesurée avant le matériau et l’in-tensité mesurée après le matériau. Les signaux lumineux qui traversent la préparation subissent donc un filtrage qui est fonction de l’absorbance de la préparation.
Par ailleurs, la propagation de la lumière diffère suivant les milieux traversés. Tout milieu a un indice de réfraction : une vitesse de propagation de la lumière. Des mêmes trains d’onde (fréquence et phase) qui traversent des milieux d’indices de réfraction différents seront accélérés ou freinés. Il y a déphasage entre les trains d’onde après franchissement des milieux.
La lumière est aussi soumise au phénomène de diffraction. Ainsi, la lumière est diffusée lorsqu’elle franchit un obstacle de petite taille, sur le bord d’un objet, ou lorsqu’elle traverse un milieu qui n’est pas homogène à l’échelle de sa longueur d’onde. Ce phénomène est donc visible lorsque la lumière rencontre un objet très fin ou le bord d’un objet opaque. Le microscope fournit une image d’un objet et c’est la diffraction qui modifie l’image de l’objet. La visibilité de l’objet est améliorée en réalisant un montage optique dans lequel seule la lumière diffractée par l’objet est conservée. Ceci permet de ne retenir que certains détails ou alors de voir apparaître des détails qui demeuraient invisibles.
Le microscope doté d’outils puissants, fournit une représentation des levures, sujette à différentes modifications. L’objectif de notre étude ne porte pas sur ces altérations mais sur la caractérisation des contours des levures en fonction d’une représentation qui soit la plus proche possible de la vérité.

Différentes techniques

Les structures (levures) à observer vont interagir avec la lumière de plusieurs façons :
– en absorbant certaines longueurs d’onde de la lumière, c’est la microscopie en lumière directe.
– en provoquant un déphasage des différents rayons lumineux, c’est la microscopie en contraste de phase.
– en émettant de la lumière à une autre longueur d’onde que celle d’origine, c’est la micro-scopie à fluorescence.
– en utilisant un filtre qui ne laisse passer que la lumière diffractée : technique du fond noir.
La microscopie en lumière directe
Les structures à observer sont colorées, naturellement ou par marquage. La lumière blanche émise par une lampe est concentrée sur la préparation et la traverse. Selon l’intensité de la coloration, la lumière sera plus ou moins absorbée, et selon la localisation des structures, la représentation sera plus ou moins sombre, les zones peu marquées restant relativement claires.
La microscopie à fluorescence
Certains corps ont la priorité, lorsqu’on les éclaire avec une lumière de longueur d’onde supérieure, par exemple les ultraviolets, de restituer l’énergie absorbée en émettant une lumière fluorescente, aussi longtemps qu’elle reste exposée à la lumière excitatrice.
La microscopie en contraste de phase
Le microscope à contraste de phase permet d’observer les cellules dans leur milieu d’origine, sans préparation ni coloration. C’est un des rares dispositifs adapté à l’observation des cellules vivantes.
L’oeil humain n’est sensible qu’aux différences d’amplitude (la luminosité) et de longueur d’onde (la couleur). Les différences de phase ne peuvent être perçues par l’oeil. De nombreux objets microscopiques ne produisent pas de changements appréciables d’intensité ou de couleur à la lumière qui les traverse, mais ils induisent seulement des changements de phase. De tels objets sont appelés des “objets-phase”, par exemple toutes les cellules vivantes.
Le contraste de phase peut être expliqué avec la théorie de la diffraction. Soient deux ondes de lumières de même amplitude, B est l’onde de l’éclairage du fond (passe en dehors de l’objet) et O est l’onde passant à travers l’objet. O est retardée par rapport B : il y a différence de phase. La différence D, entre les ondes B et O, est une nouvelle onde représentant la différence entre le fond et l’objet. D représente la lumière diffractée générée par l’objet qui est perçue par l’oeil humain. Ainsi, le principe repose sur la formation d’un contraste d’intensité créé par l’interférence de rayons lumineux, auquel on fait subir un déphasage différentiel. Pour cela, on place un anneau de phase dans le condenseur et une plaque de phase dans l’objectif du microscope. La figure 1.5 est une illustration de ce montage.
L’anneau de phase crée une illumination de forme particulière qui sera totalement stoppée par l’anneau opaque de la plaque de phase. Cet anneau opaque arrête la transmission directe de la lumière et évite l’éblouissement de l’observateur. Les rayons lumineux diffractés par les structures fines (membranes cellulaires, organites, etc. ) traversent la plaque de phase dans la zone périphérique, ou dans la zone centrale. La zone centrale est constituée d’une lame (lentille) dont le rôle est de retarder légèrement les rayons diffractés qui la traversent. Ces rayons retardés vont interférer avec ceux transmis sans retard sur la périphérie. Le déphasage différentiel entre ces rayons, crée le contraste et permet de mettre en évidence les structures cellulaires. La différence entre ces deux ondes va produire l’image.
L’image obtenue est une image en niveaux de gris qui visualise tous les changements de milieu à l’intérieur de l’objet observé. Le système de contraste de phase augmente le contraste, le “relief” et fait apparaître des détails de structure qui étaient invisibles.
Les rayons sont directs et non diffractés par l’objet : ils traversent ses parties vides ou sans structure et pénètrent dans l’objectif. Ils produisent dans le champ image un fond clair uniforme auquel se superposent, souvent avec un faible contraste, les images avec des détails fins.
La microscopie fond noir ou strioscopie
La lumière non déviée est exclue, la lumière diffractée (déviée) produit l’image. Afin d’obtenir un éclairage en fond noir, il faut changer le type de condenseur utilisé pour le contraste de phase ou placer un cache central dans le support à filtre du condenseur. Dans notre cas, c’est le condenseur qui a été changé. Une des opérations primordiales, est le centrage du fond noir et l’ajustement de la hauteur du condenseur pour un maximum de luminosité au centre du champ.
Les rayons lumineux sont déviés par le condenseur fond noir et réfléchis par des miroirs courbes. Seule la lumière diffractée par les bords de l’objet passe autour du filtre et arrive sur l’écran : on observe uniquement les contours de l’objet qui apparaissent lumineux sur fond noir. Ainsi, la lumière directe est supprimée et on ne recueille que la lumière diffractée par l’objet. L’utilisation du fond noir est un filtrage passe-haut : il laisse passer les détails à haute fréquence (à variation rapide dans l’espace).
L’intérêt d’utiliser cette méthode est que les contours des cellules seront mis en évidence par rapport à l’intérieur de la cellule et au fond de l’image. Cette technique d’acquisition consti-tue réellement un filtre passe-haut qui sera déterminant pour la localisation et l’extraction des contours des cellules.

Protocole d’acquisition

L’acquisition d’images n’est pas un processus automatique et l’intervention d’un opérateur est nécessaire pour la prise d’images par le microscope. De la même façon qu’il n’y a pas deux horloges indiquant exactement la même heure, les opérateurs ont chacun un système visuel qu’ils jugent performant par rapport à ce qu’ils perçoivent. La nécessité d’un protocole d’acquisition résulte du fait que d’un opérateur à l’autre, les images peuvent être sensiblement différentes si des conditions d’acquisition ne sont pas respectées. Dans notre souci pérpétuel de précision, et afin d’avoir des représentations “homogènes” des levures, un protocole d’acquisition s’est avéré indispensable. Il fixe ainsi les règles selon lesquelles les images pourront être interprétées dans tout le processus d’analyse d’image qui découle. L’appréciation d’une qualité d’image n’est pas une notion universelle, mais à travers ce protocole, les images font partie d’une certaine gamme.

Segmentation par contours actifs

Les contours actifs, et plus généralement les snakes ont été largement étudiés dans le trai-tement d’images. En effet, ils constituent une méthode simple et rapide d’extraction d’objets. Contrairement aux opérateurs locaux, les snakes ne nécessitent pas de phase post-traitement et peuvent converger rapidement vers une partie de la cellule.
Les contours actifs sont une technique efficace de segmentation d’images, notamment pour leur capacité à intégrer la détection des contours et leur chaînage, tout ceci en un seul processus fondé sur une recherche de minimisation d’énergie. Les contours actifs font partie des méthodes énergétiques où l’énergie est liée à des forces qui attirent le contour actif vers un objet. Cette énergie peut être décrite comme une somme de fonctions liées au contour de l’objet lui même ou au fond de la scène.
Le principe est donc de faire évoluer une courbe représentée par un ensemble de points, vers les contours d’un objet. L’évolution de cette courbe, appelée contour actif, part d’abord d’un contour grossier de l’objet pour atteindre un contour optimal. La position finale du contour est une position d’équilibre stable, représentant le meilleur ajustement en terme de position, d’orientation et de déformation, qui traduit une valeur minimale de la fonction d’énergie. Utiliser les contours actifs implique différentes étapes critiques : il faut en général initialiser les points de façon à qu’ils puissent être attirés le contour de l’objet, mais il faut aussi fournir une bonne définition de l’énergie (fonction de l’image). Par minimisation, cette énergie permet-tra à la courbe d’atteindre le contour, tout en veillant à minimiser le nombre d’opérations. Le choix de cette énergie s’avère d’autant plus compliqué qu’elle doit exprimer les caractéristiques discriminantes des objets à segmenter. L’évolution de la courbe est sujette à de fortes contraintes et les difficultés reposent tant sur l’initialisation que sur le choix de l’énergie à minimiser. En effet, la sélection des contours actifs comme méthode de segmentation, pour l’extraction des contours, dépend du critère de convergence qu’ils proposent. Celui-ci est fortement lié à l’énergie image qui doit attirer la courbe ; plusieurs fonctions d’énergie seront testées afin de détecter la plus efficace.

Etat de l’art

Il faut distinguer deux classes de contours actifs : les contours actifs basés contours et les contours actifs basés régions, mais seules les méthodes basées sur les contours seront décrites. Ce choix s’implique car l’objectif est de faire converger un contour initial vers la paroi et il n’y a pas de différence de niveaux de gris entre les cellules.
Les contours actifs sont apparus avec les travaux de Kass et al. [Kas88] qui cherchaient à caractériser des contours d’objets en utilisant des énergies uniquement liées aux contours et non à la région où se localisait l’objet.
De même, Caselles et al. [Cas97] ont proposé des contours actifs en s’intéressant aux contraintes de parcours telles la minimisation de chemin. Ainsi les contours actifs géodésiques sont la pre-mière amélioration des contours actifs intégrant dans la minimisation de la fonction énergie la longueur du chemin comme une métrique (périmètre décrit par la courbe).
Le modèle ballon de Cohen [Coh91] résout le problème d’initialisation qui voulait que la position initiale du contour actif soit autour de l’objet à segmenter (donc à l’extérieur) et re-lativement proche du contour réel. Ainsi, utiliser une force d’expansion orientée vers l’extérieur permet plus de souplesse en prenant un contour initial interne à l’objet.
Une des principales motivations de l’utilisation des contours actifs est la détection, la locali-sation et le suivi d’objets. Rochery et al. [Roc03] les utilisent pour l’extraction automatique de routes dans les images de télédétection. De même Yagi et al. [Yag00] se basent sur les contours actifs pour la reconnaissance de tracés d’une voiture intelligente.
Dans les séquences vidéo, le suivi d’objets est un axe bien développé comme dans les travaux de Paragios et al. [Par99] [Par97] , Precioso et al. [Pre01], Ranchin et al. [Ranc04]. L’une des dif-ficultés est de suivre des objets en mouvement, dont la projection sur la caméra peut se déformer, dans une séquence d’image. Ces phénomènes apparaissent pour, par exemple, une voiture dans un virage ([Ranc04]), des personnes qui se déplacent (Gastaud et al. [Gas02b], Wilhelms et al. [Wil00], Rehg et al. [Reh91] ). Cette technique est aussi utilisée dans la mise en correspondance d’images pour la stéréovision par Deriche et al. [Der98]. Jehan-Besson et al. [Jeh01] et Gastaud et al. [Gas02a] [Gas02b] montrent que ce sont les applications en temps réel qui apparaissent les plus complexes pour les mouvements d’objets. Les contours actifs sont aussi utilisés en biométrie pour l’extraction de paramètres faciaux par Pardas et al. [Par01] et Yokoyama et al. [Yok98]. De même, l’interprétation du langage en temps réel par le suivi des lèvres ([Del05], [Del99], [Eve01]) peut contribuer à la reconnaissance de la parole.
Un des domaines qui a fortement contribué au développement des contours actifs est l’image-rie médicale : McInerney et Terzopoulos [Mci96] en font l’inventaire. Pour résoudre les problèmes de convergence liés au bruit, Cohen [Coh91] introduit la force de ballon qui permet aux contours actifs de ne pas se diriger uniquement vers l’intérieur. En effet, traditionnellement, la courbe ini-tiale est à l’extérieur (autour de l’objet), et doit converger vers l’intérieur. Lever ces contraintes permet en partie de résoudre le problème d’initialisation. Ces travaux portent sur la segmenta-tion du système cardiaque dans les images IRM qui ont fait l’objet de nombreuses applications ( [Cho03], [Rang95], [Coh96a], [Coh96b], [You94], [Malp03], [Mik98], [Ham00] [Dec98]). La seg-mentation de ces images par les contours actifs peut aider à la détection de tumeurs ([Bam98]). Caselles et al. [Cas93] [Cas97] ont appliqué les contours actifs gédésiques pour la segmentation d’images médicales en cherchant à minimiser les surfaces. Dans cette lignée, Cohen et al. [Coh93] introduisent les éléments finis pour résoudre les problèmes de minimisation de surface.
Au niveau cellulaire, l’approche de la segmentation des cellules vivantes est très peu représen-tée, à part quelques études sur des cellules humaines qui ont la particularité d’être étudiées avec des images de grossissement élevé ([Fok96]). Par ailleurs, une des contraintes d’utilisation des contours actifs pour les cellules est d’avoir un contour final aussi proche que possible de l’objetà étudier. Pour les cellules, il faut impérativement un contour précis qui correspond exactement à la paroi de la cellule.
L’initialisation des paramètres du modèle, le choix de la fonction d’énergie à minimiser sont cruciaux pour l’évolution de la courbe vers le contour souhaité. L’une des étapes prépondérantes est l’initialisation du contour pour la précision de convergence, la rapidité (en terme de temps de calcul) et la stabilité de la méthode. L’initialisation est réalisée grâce à la méthode d’extrac-tion de contours d’épaisseur 1 pixel, qui a été présentée dans le chapitre précédent.
Il existe deux approches pour les contours actifs :
– l’approche implicite : les ensembles de niveau ou “level-set”
– l’approche explicite : les modèles paramétriques ou snake
Nous ne traiterons que des modèles paramétriques qui se basent sur des courbes élastiques.

Modèles paramétriques : les “snakes”

Présentation
Il est de coutume de confondre contour actif et snake ; par abus de langage, un terme désigne l’autre. En fait, un snake est un modèle paramétrique de contour actif.
Le snake, traduction anglophone du mot serpent, traduit déjà une forme qui peut prendre plusieurs positions et aussi qui peut se déplacer plus ou moins dans l’espace. Cette vision du serpent qui se tortille (tension/torsion) laisse donc apparaître des forces internes et externes qui lui permettront de se déplacer.
Les snakes ont été introduits par Kass, Witkin et Terzopoulos [Kas88] [Ter88] et sont comme des courbes élastiques ; élasticité impliquant une force de ressort. Les snakes sont décrits par un ensemble de points et sont positionnés au voisinage de l’objet (par un contour fermé) qu’ils doivent segmenter en minimisant une énergie potentielle, par la dissipation de l’énergie du contour actif. Ainsi, les snakes peuvent être considérés comme des courbes polygonales caractérisées par diverses énergies :
– Einterne : l’énergie interne du contour qui lui permet certains degrés de déplacement : elle contrôle les propriétés intrinsèques du contour, telles que la rigidité, l’élasticité et la courbure. Elle permet donc de régulariser le contour.
– Eimage : l’énergie image. Elle définit l’interaction avec l’image objet de la segmentation, elle peut être une force de répulsion ou une force d’attraction, les deux forces se compensant mutuellement.
– Eexterne : l’énergie externe correspond aux contraintes liées à l’objet dont les contours doivent être extraits :
* contraintes sur le type de forme recherché ,
* dans le cadre de suivi elle peut permettre la recherche d’un contour déjà extrait.
Dans certaines notations, l’énergie image est contenue dans l’énergie externe ou elle peut être contenue dans une force externe (l’énergie interne étant contenue dans une force interne).
Ici, l’objectif est donc d’entourer un objet par des points, en déplaçant ceux-ci vers l’objet, sous contraintes de forces externes et internes, en minimisant une fonctionnelle.
Mais, la principale difficulté, dans l’utilisation des snakes, réside dans les conditions d’ini-tialisation des points mais aussi le choix des énergies. Ce problème se résout en traitant chaque cas de segmentation comme un problème unique admettant une solution unique. Les travaux sur l’estimation des paramètres d’élasticité ont été réalisés par Larsen [Lar05], Arbelaez [Arb04] ou Neuenschwander [Neu05] pour ne citer que ceux-ci. Ce choix des paramètres se pose pour toute utilisation des snakes.
Il faut surtout que le snake soit initialisé dans une zone où l’énergie potentielle variera, car dans le cas contraire, la seule force qui agira sur le contour sera son énergie interne.

Table des matières

Introduction générale
Ch apitre 1Contexte d’étude : la levure de bière 
1.1 La levure : objet de toutes les convoitises
1.1.1 Historique
1.1.2 Levure : modèle de cellule eucaryote
1.1.3 Description
1.2 Reproduction – croissance – division cellulaire
1.2.1 Bourgeonnement
1.2.2 Facteurs de croissance
1.2.3 Evolution de la croissance
1.2.4 Fermentation alcoolique
1.3 Techniques d’étude de la croissance
1.3.1 Mesure du nombre de cellules
1.3.2 Mesure de la biomasse
1.4 Acquisition d’images par la microscopie optique
1.4.1 Microscopie optique
1.4.2 Différentes techniques
1.4.3 Protocole d’acquisition
1.5 Conclusion
Chapitre 2 Traitement des images microscopiques 
2.1 Extraction de contours de cellules
2.1.1 Représentation en niveaux de gris
2.1.2 Extraction de contours : principes
2.1.3 Techniques classiques d’extraction de contours
2.1.4 Autres méthodes
2.1.5 Etapes d’extraction d’un contour
2.1.6 Conclusion
2.2 Segmentation par contours actifs
2.2.1 Etat de l’art
2.2.2 Modèles paramétriques : les “snakes”
2.2.3 Extraction de contours de cellules
2.2.4 Avantages et limites de la méthode traditionnelle
2.2.5 GVF Gradient Vector Flow
2.2.6 Conclusions et perspectives
Chapitre 3 Identification de cellules 
3.1 Classification des cellules par des méthodes floues
3.1.1 Isodata
3.1.2 C-moyennes floues ou FCM
3.1.3 Algorithme de Gustafson-Kessel
3.1.4 Conclusion
3.2 Analyse des coefficients de la transformée en ondelettes
3.2.1 La transformée en ondelettes continue unidimensionnelle
3.2.2 Caractérisation des contours
3.2.3 Limites des maximums du module
3.2.4 Conclusion
3.3 Étude de la courbure
3.3.1 Changement de courbure pour une cellule seule
3.3.2 Cellule bourgeonnante
3.3.3 Limites : non détection de bourgeon
3.3.4 Agrégats de cellules
3.4 Conclusions du chapitre
Chapitre 4 Modélisation de contours de cellules 
4.1 Objectifs de la modélisation
4.2 Contours de cellules et transformée de Hough
4.2.1 Extraction d’ellipse
4.2.2 Détection d’une ellipse pour un contour de cellule seule
4.2.3 Détection d’ellipse pour un contour de cellule bourgeonnante
4.2.4 Conclusion
4.3 Contours de cellules et algorithmes génétiques
4.3.1 Mécanismes de base
4.3.2 Algorithmes Evolutionnaires Différentiels
4.3.3 Description des algorithmes
4.3.4 Détection d’ellipse
4.3.5 Modélisation d’un contour de cellule seule
4.3.6 Modélisation d’un contour de cellule bourgeonnante
4.3.7 Conclusion
4.4 Contours de cellules et moindres carrés sous contraintes
4.4.1 Principe
4.4.2 Détection d’ellipse
4.4.3 Conclusion
4.5 Conclusions de la partie
Chapitre 5 Expérimentation des méthodes 
5.1 AnalYeasts : logiciel d’analyse de levures
5.2 Suivi de la densité optique
5.3 Évolution du bourgeonnement
5.4 Évaluation des résultats
5.5 Conclusions
Conclusions et travaux futurs 
Bibliographie 

Télécharger le rapport complet