Soutenance mémoire
Traitement de la tuberculose
Description et épidémiologie
La tuberculose est une infection bactérienne contagieuse et perilleuse provoquee par le complexe mycobacterium tuberculosis incluant principalement mycobacterium tuberculosis, mycobacterium bovis, mycobacterium africanum, mycobacterium microti et mycobacterium canetti [Heym, et al, 2007, Oscar et al. 2008] Peu de temps après la mise en évidence du caractère infectieux et contagieux de la tuberculose par J. A. Villemin, R. Koch identifia le bacille responsable de la maladie (1882) : M. tuberculosis. Les travaux initiaux de A. Calmette et C. Guérin (1908) aboutirent en 1921 à la mise au point du vaccin BCG, seul vaccin utilisé à nos jours [George Coumba Yoya. 2010] en 1944, S. Waksman découvrit le premier antibiotique actif contre la tuberculose : la streptomycine. Durant les 20 années suivantes (1944-1965) de nombreux antituberculeux virent le jour. Cinq de ces antibiotiques, l’isoniazide, l’éthambutol, la rifampicine, le pyrazinamide, et la streptomycine sont dits majeurs ou de première ligne [George Coumba Yoya. 2010]
A ce jour, malgré l’existence d’un vaccin (le BCG) et d’une polychimiothérapie efficace mise en place dès les années 70, la tuberculose reste la première cause de mortalité due à un agent infectieux unique [George Coumba Yoya. 2010] La tuberculose pulmonaire (phtisie) est la plus frequente et la seule contagieuse [Enarson et al, 2000]. Cependant il existe d’autres formes de tuberculose extra-pulmonaire, qui peuvent toucher d’autres parties du corps humain. Ces dernieres peuvent entrainer des atteintes osseuses (mal de pott, tumeur blanche du genou…etc), renales, intestinales, genitales, meningees et cutanees. Lorsque la maladie atteint plusieurs organes, on parle de tuberculose disséminee ou demiliaire [Enarson et al, 2000] La source essentielle de dispersion de Mycobacterium tuberculosis provient des patients atteints de tuberculose pulmonaire et dont les crachats contiennent des bacilles acido-alcoolorésistants (BAAR). [T. May, et al, 2005] La plupart des cas ont été constatés dans les régions africaines, de l’Asie du Sud-Est et du Pacifique occidental, avec des taux de 35 %, 30% et 20% respectivement. On estime que les VIH-positifs représentent entre 11 et 13% de l’ensemble des nouveaux cas de TB, la Région africaine comptant pour environ 80% de ces cas. [Rapport 2010 sur la lutte contre la tubeculose dans le monde]
Nouveaux médicaments antituberculeux
Malgré l’urgence et l’augmentation du nombre des cas de tuberculose dans le monde, les principaux médicaments antituberculeux disponibles sont encore ceux qui ont été introduits entre 1950 et 1970. Depuis lors, aucun médicament majeur n’a été mis sur le marché. La raison en est, entre autres, la difficulté de la recherche sur un germe à croissance très lente et le peu d’intérêt de l’industrie pharmaceutique pour un marché peu rentable en termes économiques. En outre, un certain nombre de médicaments dits de seconde ligne, utiles pour le traitement des cas devenus résistants aux médicaments de base (isoniazide et rifampicine) ont un coût si élevé qu’ils ne peuvent pas être utilisés dans les pays où ils seraient indispensables, ou ne sont simplement plus disponibles sur le marché. [P. Leuenberger. et al, 2004]
Depuis plus de vingt ans, le schéma thérapeutique antituberculeux fait appel à une combinaison de médicaments administrés pendant six à huit mois. Même qualifié de «court» par l’OMS, ce schéma est très long pour le malade, associé à des effets indésirables parfois importants, et très coûteux si les médicaments doivent être achetés au prix du marché libre. Depuis quelques années cependant, sous la pression des autorités sanitaires internationales, OMS et Union internationale contre la tuberculose en tête, l’industrie et la recherche se sont mises à nouveau au travail. Si aucun médicament vraiment nouveau n’a vu encore le jour, on enregistre cependant quelques progrès encourageants. [P. Leuenberger, et al, 2004]
La recherche a permis de trouver de nouveaux antituberculeux (soit parmi les antibiotiques connus, soit de nouvelles molécules), actuellement en phases cliniques chez l’homme, avec des résultats inattendus. Parmi les molécules déjà commercialisées, on retrouve la moxifloxacine, la gatifloxacine, le linézolide, la rifapentine et la rifabutine. D’autres études sont nécessaires pour mieux positionner l’utilisation de ces fluoroquinolones. L’efficacité du linézolide est contrebalancée par ses effets secondaires. Quant aux rifamycines, leur activité est confirmée et elles sont déjà utilisées dans plusieurs pays. Parmi les nouvelles molécules, ont été sélectionnées le PA-824, l’OPC-67683, la diarylquinolone TMC207, la diamine SQ109 et les dérivés pyrroles. Pour la plupart, leur mécanisme d’action n’est connu que partiellement. Autant le PA-824 nécessite d’autres études cliniques pour confirmer son efficacité, autant les autres nouveaux composés sont en attente de phases II (OPC-67683, TMC207, SQ109) et de phase I (les dérivés pyrroles). Plusieurs molécules sont en phase d’évaluation préclinique. [Marigot-Outtandy D, et al, 2009]
Rifapentine La rifapentine, dérivée de la rifampicine, possède une demi-vie beaucoup plus longue et se prête de ce fait à une utilisation intermittente, par exemple une fois par semaine, ce qui permettrait de réduire le risque d’erreur ou d’interruption liée au traitement quotidien. Diverses études ont été entreprises pour évaluer l’utilité de la rifapentine, en général accompagnée de l’isoniazide, dans la phase d’entretien de la chimiothérapie antituberculeuse. La comparaison est faite avec le régime habituel associant la rifampicine et l’isoniazide. Dans un modèle animal de tuberculose chez la souris, la monothérapie de rifapentine en administration hebdomadaire pendant six mois permettait de stériliser les lésions après une phase initiale de traitement quotidien associant au moins trois médicaments pendant deux mois ou en association hebdomadaire avec l’isoniazide après une phase de trithérapie quotidienne pendant deux semaines.
L’association avec la moxifloxacine a permis d’obtenir un taux de guérison similaire à celui de l’association avec l’isoniazide. [Lounis N, et al, 2001] Dans un essai clinique chez l’homme, l’association d’isoniazide et de rifapentine en une seule dose hebdomadaire pendant la phase d’entretien était associée à un taux plus élevé d’échecs (9,2%) que l’association de rifampicine et d’isoniazide administrés deux fois par semaine (5,6%) [Benator D, et al, 2002] Le taux sérique d’isoniazide influençait le résultat thérapeutique [Weiner M, et al, 2003] Dans une autre étude, où le régime initial comprenait la streptomycine, le taux d’échecs était également plus élevé dans le groupe traité une fois par semaine par l’association de rifapentine et d’isoniazide que chez les malades recevant trois fois par semaine une association de rifampicine et d’isoniazide, indépendamment du taux sérique d’isoniazide.[ Tam CM, et al, 2002]. La place exacte de la rifapentine dans le traitement de la tuberculose n’est donc pas encore établie. [Rieder HL, et al, 2001]
Nouvelles quinolones
Les quinolones possèdent une activité bactéricide contre M. tuberculosis et un profil de sécurité intéressant, mais leur emploi était jusqu’ici réservé aux cas de résistance ou d’intolérance aux antituberculeux majeurs ou aux traitements d’attente chez les patients suspects d’être atteints de germes multi résistants. Jusqu’à présent, les deux dérivés les plus utilisés étaient la ciprofloxacine et l’ofloxacine, qui diffèrent peu en termes d’efficacité et de tolérance. Parmi les autres quinolones, la lévofloxacine, la gatifloxacine et la moxifloxacine ont également une activité antimycobactérienne. La moxifloxacine possède le profil le plus intéressant, du fait que le rapport de la concentration sérique maximale à la concentration minimale inhibitrice (Cmax/CMI) est le plus élevé (5 à 10 fois celui de la ciprofloxacine) et que le temps pendant lequel la concentration sérique se situe au-dessus de la concentration minimale inhibitrice est trois à quatre fois plus long que pour les autres quinolones.
La moxifloxacine possède un pouvoir bactéricide proche de celui de l’isoniazide et pourrait même devenir un des médicaments antituberculeux de base. [Ginsburg AS, et al, 2003] En outre, son profil permet de l’utiliser aux doses usuelles (400 mg/j) et non à la dose double de la dose habituellement recommandée, comme pour les autres quinolones. Si l’effet bactéricide et la longue durée d’action se confirment, l’association de moxifloxacine et de rifapentine en administration hebdomadaire pendant la phase de continuation du traitement permettra peutêtre de simplifier le schéma thérapeutique en réduisant la durée du traitement et le nombre de doses.
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Table des matières
Introduction
I. Les mycobactéries: Caractéristiques generals
1. Classification selon Bergey’s
2. Classification selon l’importance Clinique
3. Les mycobactéries : à l’origine de la tuberculose
II. La tuberculose
1. Description et épidémiologie
2. Evolution de l’incidence
3. VIH et la tuberculose
4. Infection et transmission
III. Traitement de la tuberculose
1. Les médicaments antituberculeux
2. Traitement de la tuberculose chez les patients infectés par le VIH
3. Traitement de la tuberculose résistante
4. Nouveaux médicaments antituberculeux
4.1.Nouveaux dérivés ou nouvelles indications de médicaments existants
4.1.1. Rifapentine
4.1.2. Nouvelles quinolones
4.1.3. Linézolide
4.2.Nouvelles molécules
IV. BCG et mise au point de nouveaux vaccins
V. Problème de la résistance
1. Résistance primaire
2. Résistance secondaire ou acquise
3. La multi résistance
4. Épidémiologie des résistances
5. Mécanisme de résistance
5.1. Isoniazide
5.2.Rifampicine
5.3.Pyrazinamide
5.4.Ethambutol
6. Facteurs favorisant la résistance aux antituberculeux
VI. Recherche de nouvelles molécules à effet anti-mycobactérien
1. Synthèse de molécules chimiques
2. Activités des extraits des plantes
3. Activité des principes actifs produit par les microorganismes Matériel et méthodes
1. Matériel biologique
1.1.Souches bactériennes utilisées
2. Méthodes
2.1.Milieux de cultures
2.1.1. Milieu LB liquide
2.1.2. Milieu LB solide
2.1.3. Milieu TSB
2.1.4. Milieu TSB modifié liquide
2.1.5. Milieu TSB modifié solide
2.2.Cultures bactériennes
2.2.1. Culture de la bactérie indicatrice M. smegmatis
2.2.2. Culture des bactéries à tester
3. Test de conservation de l’activité des souches isolées après repiquage
4. Extraction et concentration des molécules bioactives du surnageant de culture
5. Test de l’activité antimycobactèrienne des extraits
5.1.Technique des disques
5.1.1. Réalisation d’une suspension
5.1.2. Préparation de la gélose
5.2. La technique des puits
6. Etude physico-chimique des principes actifs
6.1.Sensibilité des principes actifs au traitement thermique
6.2.Sensibilité des principes actifs à la protéinase K
7. Analyse des extraits par chromatographie sur couche mince de silice (CCM) 8. Essai de localisation des bandes actives après CCM
9. Essai de purification des bandes actives après CCM
10. Détermination du spectre d’action des principes actifs des souches AF et AV
11. Extraction d’ADN
11.1. Première méthode Protocole classique au phénol- chloroforme
11.2. Deuxième méthode : Extraction d’ADN par microonde
11.3. Troisième méthode
11.4. Quatrième méthode
12. Amplification de l’ADN 16 S par la réaction de polymérisation en chaine (PCR
12.1. Amorces utilisées
12.2. Mélange réactionnel
12.3. Conditions de la réaction PCR
13. Analyse des produits de la PCR par électrophorèse sur gel d’agarose 13.1. Préparation du gel d’agarose
13.2. Dépôt des produits d’amplification
13.3. Électrophorèse Résultats et discussions
1. Test de conservation de l’activité antimycobactèrienne des souches AF et AV après repiquage
2. Test d’activité des extraits
3. Sensibilité des principes actifs au traitement thermique et à la protéinase K
4. Chromatographie sur couche mince (CCM
5. Spectre d’action des principes actifs des extraits des souches AF et AV 6. Extraction d’ADN et amplification par PCR
Conclusion et perspectives
Références
bibliographiques
Annexe
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