Soutenance mémoire
Rappel sur le phénomène de la bioindication
La recherche d’outils de surveillance de la qualité des écosystèmes et la mise au point de méthodes d’évaluation du risque environnemental mobilisent d’intenses efforts de la part d’une large communauté scientifique depuis les dernières décennies (Guerlet, 2010). Les méthodes d’analyses physico-chimiques, bien que toujours plus performantes, atteignent leurs limites en tant qu’outils d’aide à la gestion environnementale, car elles ne prennent généralement pas en compte la notion de spéciation ou de biodisponibilité des polluants. Il est donc apparu nécessaire de compléter ces mesures par des données biologiques permettant d’évaluer l’effet potentiel global des substances présentes dans le milieu vivant (LadharChaabouni et al., 2009). Certaines espèces sont très sensibles aux variations des conditions environnementales, qu’elles soient d’origine biotique ou abiotique et y répondent proportionnellement par des changements mesurables à différents niveaux d’intégration (spatial, morphologique, physiologique, cellulaire, ou bien encore moléculaire). Tous ces changements peuvent s’ils sont bien utilisés, constituer des bioindicateurs, outils précoces et sensible à une large gamme de polluants, pour détecter une dégradation comme une restauration du milieu (Wu et al., 2005 ; Figueira et al., 2009). Les bioindicateurs sont définis comme espèces ou groupes d’espèces qui, par leur présence et/ou leur abondance, sont significatifs d’une ou de plusieurs propriétés de l’écosystème dont ils font partie (Guelorget et Perthuisot, 1984). D’innombrables travaux ont été publiés sur l’emploi de bioindicateurs tels que les espèces bioaccumulatrices destinées à évaluer la qualité des milieux naturels. En effet, l’accumulation de certains polluants par les organismes bioaccumulateurs facilite leur mise en évidence et leur quantification par des méthodes chimiques et/ou physiques. De plus, les espèces bioaccumulatrices retenues comme bioindicatrices sont en général des espèces abondantes, relativement résistantes aux toxiques et d’une durée de vie suffisante qui leur confère une capacité d’intégration des variations de la qualité du milieu (Amiard et al., 1989). Parmi les organismes de la faune terrestre, les invertébrés sont utilisés comme bioindicateurs de pollution. Il en est ainsi des mollusques bivalves et des gastéropodes terrestres et aquatiques, certains arthropodes (les crustacés), et les annélides (Polychètes, Achètes) et surtout les oligochètes (Beeby, 2001) objet de notre étude.
Rappel sur les pesticides
Au cours du siècle dernier, les activités anthropiques, poussées par les avancées technologiques, ont conduit à des augmentations des niveaux de contaminants organiques dans l’environnement. L’agriculture en est une source importante en raison de l’usage généralisé de pesticides pour protéger les cultures et améliorer leur rendement. En effet, depuis les années 40, l’agriculture s’est intensifiée et les pratiques ont profondément changé. Ainsi, la plupart des pesticides inorganiques (cuivre, arsenic, fer, soufre) ont progressivement été remplacés par des pesticides organiques. Ces derniers regroupent de nombreuses familles chimiques, avec des effets variés aussi bien dans leur action que dans leur devenir dans l’environnement (Lazartigues, 2010). La contamination des différentes matrices environnementales (eau, sol), a été largement rapportée dans la littérature (Tariq et al., 2007 ; Azzouz et al., 2011 ; Benbouzid et al., 2012). Devant le nombre considérable de pesticides (plus de 800 matières actives différentes dans près de 7000 formulation commerciales), les fabricants et utilisateurs les classent suivant la nature de l’espèce nuisible contre laquelle ils sont destinés. Les trois principales classes sont :
• Les fongicides : servant à combattre la prolifération des champignons phytopathogènes. Ils permettent de lutter contre les maladies cryptogamiques qui causent de graves dommages aux végétaux cultivés. Il existe plusieurs familles de fongicides, les plus importantes sont : carbamates (Carbendazine, Mancozèbe,…), triazoles (Bromuconazole, Triticonazole,…), dérivés du benzène (Chlorothalonil, Quintozène), dicarboximides (Folpel, Iprodione,…).
• Les herbicides : les plus utilisés des pesticides en tonnages et en surfaces traitées, ils permettent d’éliminer les mauvaises herbes adventices des cultures. Les plus représentées sont les carbamates (Chlorprophame, Triallate,…), les urées substituées (Diuron, Chlortoluron,…), les triazines (Atrazine, Simazine,…), les chlorophenoxyalcanoïques (2,4-D, MCPA, …), les amides (Alachlore, Propyzamide,…).
• Les insecticides : C’est un grand groupe de pesticides utilisé pour éliminer les insectes porteurs de maladies et lutter contre les parasites qui infectent les plantes cultivées (Hodgson et al., 2004). Ils se répartissent en trois grands groupes selon leur nature chimique : substances minérales, molécules organiques d’origine naturelle ou produits organiques de synthèse qui sont de loin les plus utilisés actuellement. Autres que les organochlorés (DDT, Dialdrin, …) qui sont bannis actuellement dans la plupart des pays du Nord, les insecticides appartiennent à trois grandes familles chimiques : les organophosphorés (Diméthoate, Malation, …), les pyréthrinoides de synthèse (Bifenthrine, Perméthrine, …), et les carbamates représentés par l’Aldicarbe, le Carbofuran et le Méthomyl objet de cette étude. Ainsi, le Méthomyl est un carbamate utilisé dans le monde entier dans l’agriculture en raison de sa haute activité contre un large spectre d’insectes nuisibles. C’est un perturbateur endocrinien, il est considéré comme puissant génotoxique, capable d’induire des aberrations chromosomiques chez les cellules de mammifères (Wei et al., 1997 ; Andersen et al., 2002).
Discussion
Des quantités importantes de pesticides sont rejetées dans l’environnement, induisant ainsi une contamination chronique d’un nombre croissant d’écosystèmes (Sarkaret al., 2006). Cette contamination altère les organismes vivants à tous les niveaux d’organisation. De ce fait, l’utilisation d’organismes bioindicateurs pour la biosurveillance écotoxicologique s’impose grâce à des biomarqueurs qui rendent comptent des niveaux de pollution auxquels sont soumis ces organismes. C’est ainsi que l’on s’est intéressé aux vers de terre ou lombriciens. Ces animaux constituent aujourd’hui une armée de nettoyeurs aux services des autorités locales, des particuliers et des industriels. L’utilisation des vers de terre a été principalement concentrée sur les effets des métaux lourds (Lukkari et al., 2004 ; Burgos et al., 2005 ; Schleifler et al., 2006 ; Bundy et al., 2007). Très peu d’études ont été consacrées à l’impact des polluants organiques tels que les pesticides sur le ver de terre (Gupta et Sundararaman, 1991 ; Venkateswara Rao et al., 2003 ; Gambi et al., 2007). Lors de l’exposition aux polluants, les vers de terre sont capables de diminuer les effets toxiques du produit chimique en réglant leurs réponses biochimiques internes avant que la croissance ne soit affectée (Gao et al., 2007), d’où notre intérêt pour le métabolisme biochimique dans l’évaluation de la toxicité des produits chimiques. Dans notre étude, nous avons tenté d’évaluer l’effet d’un insecticide (le Méthomyl) sur un modèle biologique à savoir, le ver de terre et ce en utilisant une batterie de biomarqueurs biochimiques et enzymatiques utilisés dans le cadre de la biosurveillance. La teneur en protéines solubles est un test souvent utilisé pour mettre en évidence un stress chez un bioindicateur. La structure des protéines ainsi que leur fonction peut être altérée par les ROS produites soit par le métabolisme cellulaire ou par des oxydants exogènes (Djekoun, 2012). Ainsi les travaux de Masaya et al. (2002) et Grara et al. (2009) ont mis en évidence une augmentation du taux de protéines sous l’effet d’un stress chimique chez d’autres modèles biologiques bioindicateurs tels les têtards, les gastéropodes ou encore les protistes ciliés. Nos résultats sont conformes aux travaux suscités, puisque nous avons mis en évidence une augmentation d’une manière dose-dépendante du taux de protéines totales chez les vers de terre traités par le Méthomyl. Ceci pourrait s’expliquer par le fait que, les vers de terre déploient une batterie de réponses à travers l’activation de leurs mécanismes de détoxification afin de lutter, de survivre et de s’acclimater à ce nouveau paramètre (Nzengue, 2008). Les premiers paramètres concernés sont les protéines totales. La présence du xénobiotiques à des concentrations toxiques, va induire l’activation des systèmes de protection cellulaires qui auront pour tâche le piégeage et /ou l’élimination des métabolites toxiques. Les enzymes du stress oxydatif interviennent par des réactions en chaine afin d’empêcher les lésions cellulaires résultantes de l’attaque des radicaux libres et des hydroperoxydes (Benbouzid, 2012). Tous les paramètres enzymatiques et non enzymatiques pris en compte dans notre travail indiquent une toxicité de Méthomyl. Il en est ainsi du taux de GSH qui diminue d’une manière significative chez les vers de terre traités confirmant ainsi le déclenchement du processus de métabolisation / biotoxication. Le GSH est un composé réducteur soufré le plus abondant dans le compartiment intracellulaire. En interceptant un radical hydroxyle, le glutathion génère un radical superoxyde qui doit être pris en charge par une SOD, outre son rôle essentiel d’agent réducteur, le glutathion intervient également à un second niveau dans la défense antiradicalaire par son implication dans les réactions de détoxication catalysées par la glutathion-S-transférase (Barillet, 2007). Certains auteurs comme Viarengo et al. (1990) ; Cossu et al. (1997b) ; Canesi et al. (1999) mettent en évidence une diminution du taux de GSH, chez les mollusques exposés à des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP). Grara et al. (2009) et Belhaouchet et al. (2012) montrent chez des escargots Helix aspersa traités par des pesticides ou des métaux lourds une diminution du taux de glutathion, ceci est en accord avec nos résultats puisque nous avons également mis en évidence une diminution du taux de GSH chez les vers de terre traités par le Méthomyl. D’un autre côté, l’exposition de souris au Méthomyl a eu pour conséquence une diminution du taux de glutathion réduit (GSH) (Dharm Paul Garg et al., 2009). Parallèlement à cela, nous nous sommes intéressés à l’activité GST qui est une enzyme de biotransformation de phase II. Cette enzyme est largement distribuée dans le règne animal (Livingstone, 1991), elle agit spécifiquement sur de nombreux substrats en offrant aux cellules, outre une fonction essentielle dans le transport intracellulaire, une protection contre les effets nocifs de nombreuses substances (Hayes et al., 2004). Contardo et Wiegand (2008) suggèrent également l’utilisation de la variation de l’activité GST chez le ver de terre Lumbriculus variegatus comme un biomarqueur sensible de l’exposition à un polluant organique, l’Atrazine. De la même façon, Ferrari et al. (2007) ont montré que les pesticides Organophosphorés et les Carbamates induisent des variations de l’activité GST chez la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss). Radwan et al. (1992), ont mis en évidence une induction de l’activité GST après exposition du gastéropode terrestre Theba pisana aux Carbamates. Ils associent cette augmentation de l’activité Glutathion-S-Transférase par une forte activité de détoxification de l’organisme par la GST suite à une exposition aux Carbamates. Nos résultats abondent dans le même sens puisque nous avons mis en évidence une augmentation de l’activité GST chez les vers de terre traités par des concentrations croissantes de Méthomyl. Selon Cossu (1997b), lorsque l’induction des enzymes antioxydantes est suffisante, elle permet l’adaptation des individus et le retour à la normale. Par contre, des toxicités trop importantes entraînent leur inhibition. L’inhibition ou l’induction in vivo des biomarqueurs est un bon outil environnemental pour évaluer l’exposition et les effets potentiels des xénobiotiques Sturm et al. (2000) ; Varo et al. (2002). La Catalase, une enzyme de la phase II, est essentielle à la détoxication et joue un rôle primordial dans les mécanismes antioxydants cellulaires. Elle catalyse la conversion de H2O2 en eau moléculaire. Le changement de l’activité de CAT explique les lésions cellulaires provoquées par exposition aux produits chimiques (Chun et al., 2011). Les travaux de Lin et al. (2010), ont montré que l’agent antimicrobien (Triclosan) induit l’activité Catalase chez les des vers de terre (Eisinia fetida). Le traitement des vers de terre par le Méthomyl lors de nos expérimentations semble provoquer le même effet c’est-à-dire une augmentation significative de l’activité Catalase confirmant par la même un stress oxydant induit par le Méthomyl. L’attaque radicalaire des membranes provoque des modifications de la perméabilité membranaire liées à la formation de peroxydes lipidiques (Lawton et Donaldson, 1991). La lipoperoxydation membranaire est une réaction en chaîne qui se déroule en 3 étapes : (1) l’initiation correspond à l’attaque d’un acide gras polyinsaturé par un radical libre. (2) la propagation c’est-à-dire la peroxydation des phospholipides voisins et (3) la réaction cesse lorsqu’une molécule piège les radicaux libres (Coeurdassier, 2001). Cette réaction conduit à la formation de produits cytotoxiques et mutagènes de dégradation des acides gras comme les hydroperoxydes ou le malonedialdéhyde (MDA) (Dixit et al., 2001 ; Alpha Jalloh et al., 2009). Le malondialdehyde (MDA) a une bonne corrélation avec la génération de ROS (Green et al., 2006 ; Luo et al., 2006) et il est considéré comme un indicateur important du niveau d’effort oxydant (Valavanidis et al., 2006 ; Box et al ., 2007). Beaucoup de travaux ont indiqué que le niveau de peroxydation des lipides est un paramètre important évaluant le niveau de l’effort oxydant dans les organismes vivants. Dans plusieurs travaux, MDA a été utilisé comme un bioindicateur de la péroxydation lipidique : chez l’escargot (Grara, 2011 ; Ait hamlat et al., 2012 ; Belhaouchet, 2014), chez la paramécie (Benbouzid, 2007 ; Azouz, 2012), chez les têtards (Bouhafs et al., 2009), et même chez les lichens (Khaldi et al., 2009). Chez le ver de terre Lin et al. (2010) et Liu et al. (2011) ont montré une augmentation du taux de MDA. Des résultats similaires sont observés chez des vers de terre Eisenia foetida exposés à un herbicide le Formesafen (Liu et al., 2008) ; (Zhang et al., 2012) ces derniers confirment que l’un des effets les plus dommageables de ROS et leurs produits dans les cellules est la peroxydation des lipides membranaires. Nos travaux abondent dans le même sens puisque nous avons également mis en évidence une forte augmentation du taux de MDA après traitement des vers de terre par le Méthomyl. L’AChE est une enzyme essentielle dans le système nerveux des vertébrés et des invertébrés, elle est la cible fonctionnelle de plusieurs xénobiotiques. L’activité AChE a été traditionnellement utilisée comme un biomarqueur spécifique des xénobiotiques neurotoxiques tels les Organophosphorés et les Carbamates à la fois in vivo et dans des conditions in vitro (Ribera et al., 2001 ; Silva et al., 2004 ; Kavitha et Venkateswara, 2008). Cette enzyme hydrolyse l’acétylcholine, neurotransmetteur impliqué dans la transmission cholinergique (Trotter et al., 1991 ; Heath et al.,1997). L’inhibition de l’AChE induite par les xénobiotiques conduit à une accumulation d’acétylcholine au niveau des synapses cholinergiques, phénomène susceptible de provoquer des perturbations comportementales affectant plus particulièrement la locomotion et l’équilibre (Zinkl et al., 1991 ; Saglio et al., 1996). Les travaux de Bouhafset al. (2009) ; Bouaricha (2013) ; Belhaouchet (2014) ont mis en évidence une inhibition de l’activité AchE chez respectivement des populations d’escargots, et de têtards traités par des pesticides. En effet, dans notre travail, nous avons montré que l’activité AchE diminue progressivement suite à l’exposition des vers de terre aux différentes concentrations du Méthomyl. Nos résultats sont similaires à ceux obtenus par (Salama et al., 2005) sur des escargot Helix aspersa exposés au Méthomyl. L’activité d’AChE a été réduite aussi chez des poissons Pseudorasbora parva traités par le même pesticide (le Méthomyl) (Li el al., 2008). Ainsi, l’inhibition de l’activité AchE chez notre espèce : le ver de terre Octodrilus complanatus exposé au Méthomyl vient confirmer le rôle primordial de cette espèce comme un organisme bioindicateur de la pollution.
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Table des matières
Chapitre I : Introduction générale
1-Généralités
2-Rappel sur le phénomène de la bioindication
3- Rappel sur les annélides
4-Taxonomie général des Oligochètes
4.1-Morphologie
4.2-Régions du corps
4 .2.1- Prostomium
4.2.4- Soma
4.2.3- Pigydium
4.2.4- Soies
4.2.5- Caractères sexuels externes
4-3 Anatomie
5-Rappel sur les pesticides
• Les fongicides
• Les herbicides
• Les insecticides
5.1-Propriétés physico-chimiques de la matière active du Méthomyl
6-Rappel sur le phénomène du stress oxydant
6-1 Systèmes enzymatiques
6-2 Systèmes non-enzymatiques
* Cas de l’AcétylcholinEstérase
Objectif
Chapitre II : Matériel et méthodes
1- Régions d’étude
1.1- Foret de la commune de Seraïdi
1.2- Chorfa
1.3- Pépinière de Sidi Amar
1.4- La réserve intégrale du lac Tonga EL-KALA
2- Matériel biologique
2.1- Méthode d’identification et description des espèces
2.2- Choix de l’espèce
2.3- Systématique du ver de terre
3- Matériel Chimique
4- Conditions expérimentales
5-Mode de traitement
6-Méthodes
6.1-Méthodes de prélèvement des animaux
6.2-Essais toxicologiques
6.2.1-Suivi du pourcentage de Mortalité
6.2.2-Suivi du taux de Croissance
6.3- Dissection et prélèvement du tissu
6.4-Méthodes de dosage
6.4.1-Dosage des Protéines totales
6.4.2-Dosage du Glutathion (GSH)
6.4.3-Dosage de l’activité GST (Glutathion S-Transférase)
6.4.4-Dosage de l’activité Catalase
6.4.5- Dosage du Malondialdéhyde (MDA)
6.4.6- Dosage de l’activité AcétylcholinEstérase (AChE)
7-Etude histologique
8- Analyse statistique des résultats
Chapitre III : Résultats et discussion
Partie I : Identification des vers de terre
1-Taxonomie
2-Description des espèces répertoriées
* Octodrilus complanatus
*Nicodrilus caliginosus caliginosus
*Eisenia foetida
*Allolobophora chlorotica
3-Discussion
Partie II : Effet du Méthomyl sur la survie et la croissance des vers de terre
1- Essais toxicologiques
1.1- Evaluation du pourcentage de Mortalité
1.2- Evaluation du taux de Croissance
2- Discussion
PARTIE III : Etude du Stress oxydant
1- Effet du Méthomyl sur les variations du taux des Protéines totales
2- Effet du Méthomyl sur le taux de Glutathion (GSH)
3- Effet du Méthomyl sur l’activité Glutathion-S-Transférase
4- Effet du Méthomyl sur l’activité Catalase
5- Effet du Méthomyl sur le taux du Manlondialdehyde (MDA)
6- Effet du Méthomyl sur l’activité AcétylcholinEstérase (AchE)
7- Discussion
Partie IV : Etude histologique des vers de terre
1- Aspect de l’épiderme après 3 jours de traitement par des concentrations croissantes du Méthomyl
2- Aspect de l’épiderme après 6 jours de traitement par des concentrations croissantes du Méthomyl
3- Aspect de l’épiderme après 9 jours de traitement par des concentrations croissantes du Méthomyl
4- Aspect de l’épiderme après 12 jours de traitement par des concentrations croissantes du Méthomyl
5- Discussion
Conclusion générale et Perspectives
Références bibliographiques
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