Tests de germination des graines d’orobanche en plaque 96 puits

Tests de germination des graines d’orobanche en plaque 96 puits

Mise en place des cultures de Fabacées et production des exsudats racinaires

Après germination en boite de pétri, les jeunes plantes sont transférées sur billes de verre dès le déploiement des cotylédons ou le verdissement de l’épicotyle selon l’espèce. L’appréciation de l’aptitude à être transféré repose essentiellement sur le développement de la partie aérienne au moment du transfert ; cet aspect variera selon l’espèce. Après transfert, les jeunes plantes sont acclimatées et gardées couvertes par un sac en plastique transparent pour reduire la transpiration avant la formation d’un appareil racinaire fonctionnel. Cette étape intermédiaire permet également aux très jeunes plantes de mieux réagir au rayonnement intense des lampes de la chambre de culture du fait d’un environnement moins sec autour des jeunes feuilles.Le système de culture utilise des doubles pots d’un volume de 75 cL dont celui du dessus est percé (Figure 2) de manière à ce qu’il y ait percolation la plus continue possible du pot contenant les billes de verre vers le réservoir collecteur (pot du dessous). Le substrat inerte est composé de billes en verre sodocalcique d’un diamètre de 2 et 3 mm qui offrent assez de capacité de rétention pour que les racines soient correctement irriguées (environ 950 Grammes de billes sont distribuées dans chaque pot). Les billes de verre sont autoclavées avant la mise en place des cultures.Les premiers jours après transfert, le volume d’irrigation appliqué se situe en dessous de la surface des billes pour inciter un développement plus profond de l’appareil racinaire dans le pot. Cette précaution évite également les nécroses du collet ou des racines que nous avons observées pour des plantules ayant des racines positionnées trop en surface (les billes laissant passer la lumière en surface).Chaque modalité représentée par une variété se compose de trois répétitions. Une unité expérimentale se compose d’un pot dans lequel sont implantés cinq plants (Figure 3) (± 2 du fait des difficultés de maintien des végétaux en parallèle dans les billes de verre et dans des conditions normalisées). Les jeunes plantes sont transférées au départ au nombre de 7 par pot lorsque cela est possible afin de prévenir les pertes. Si les jeunes plantes survivent au delà de 5 par pot, des spécimens seront retirés. Après chaque collecte, les exsudats sont placés à 4°C.Pour certaines espèces à biomasse plus (Trèfles, Lotier), nous avons choisi de multiplier les nombre de plantes implantées dans chaque pot pour que la production d’exsudats racinaires soit suffisamment abondante pour ne pas être trop diluée dans la solution nutritive. Les densités de semis en couvert, en champ impliquent également un nombre de graines plus important pour ce type d’espèce. Dans ce type de cas, 5 g de graines sont pesés (par pot) et sont distribués sur les billes de verre directement. Un ajout d’une fine couche de bille de verre est versé au dessus des graines pour que les plantes se situent ultérieurement « à un bon niveau ». La germination sur billes de verre optimise la survie des jeunes plantes de petite taille en évitant l’étape de transfert. Le niveau de la solution d’irrigation est vérifié régulièrement pour éviter l’assèchement (niveau trop bas), mais également l’anoxie radiculaire (niveau trop haut). Les pots sont ainsi laissés « à l’étouffée » c’est-à-dire enveloppé dans un voile plastique transparent quasi hermétiquement (maintient d’une atmosphère humide).La solution nutritive utilisée est le milieu de TT ou « TT medium » (Tadano et Tanaka, 1980). La composition de cette solution nutritive (Annexe 1) est relativement pauvre en macroéléments et accentue ainsi l’exsudation racinaire. (Li et al., 1997).
Les premiers jours d’acclimatation, l’éclairage est assuré par des tubes néons en chambre de culture à 21°C. Les plantes acclimatées sont transférées en phytotron sous lampes HPS (OSRAM E40/ES 200-300 µmol photons PAR m-2 s-1), à 21°C constant et dans une atmosphère de 70% d’humidité relative. La photopériode est de 16h lumière et 8h d’obscurité.
Chaque double pot est alimenté avec 100 mL de milieu TT après chaque collecte d’exsudats, le pot collecteur ayant été préalablement vidé (purge) avant chaque irrigation. La collecte des exsudats est effectuée une fois par semaine en prélevant 2 mL de solution directement dans le pot collecteur.

Lots de graines de P. ramosa utilisés pour les tests d’activité

Deux lots de graines de Phelipanche ramosa ont été utilisés pour cette étude, l’un appartenant au type 1 et le deuxième au type 2, ce dernier ayant été aimablement fourni par l’UMR Agroécologie de Dijon (partenaire du projet). Le lot de type 1 utilisé (désigné Pram11) provient d’une parcelle de Colza (Brassica napus L.) sur la commune de Saint Jean d’Angely dans la région Poitou-Charentes (2012). Son appartenance au type I a été initialement validé, de part sa forte sensibilité à un stimulant de synthèse (GR24, EC50 ~4,45.10-11 M) et son insensibilité vis-à-vis des exudats racinaires bruts de chanvre.
Le lot de type 2 utilisé (désigné Pram118) provient d’une parcelle de chanvre (Cannabis sativa L.) sur la commune de Neuvelle-Lès-Champlitte dans la région Franche Comté (2012). Son appartenance au type 2 a été initialement validé, de part son EC50 (~8,38.10-10 M) vis-àvis du GR24, et sa sensibilité. vis-à-vis d’exsudats bruts de chanvre.
Ces deux lots ont été stockés à 25°C constant à l’obscurité depuis l’échantillonnage.

Préparation des suspensions de graines stériles et mise en conditionnement

La stérilisation de surface se fait par séries de 150 mg de graines sèches auquel est appliqué le protocole suivant pour un volume de suspension de 15 mL (10 mg de graines mL-1) :
Les manipulations sont effectuées en conditions stériles, la première étape étant l’immersion des graines sèches dans une solution d’hypochlorite à 2,6% pendant 5 min sur agitation rotative (vortex, 800 rpm), suivie de 4 rinçages successifs à l’eau distillée stérile de 3 min. La suspension de graines est ensuite reprise dans 15 mL d’eau stérile avec 1 mM de tampon Hépès et 0,2% de solution PPM™ (Plant Cell Technology) afin d’éviter les contaminations.Le tube de 50 mL contenant la suspension de graines stériles est ensuite enveloppé de papier aluminium et placé à 21°C pendant une période de 4 à 5 jours représentant la période de conditionnement nécessaire aux graines d’orobanche pour être sensible aux stimulants de germination (Lechat et al., 2012). Ce tube est par ailleurs incliné pour laisser une surface d’échange suffisante entre le liquide et l’oxygène présent dans le tube de manière à ce que les graines ne soient pas en situation d’anoxie.

Table des matières

Introduction
Structure d’accueil du stage
Cadre de l’étude et objectifs
Généralités concernant le colza
Généralités concernant l’orobanche
Apports des Fabacées en agronomie et implications dans l’allélopathie
Matériels et méthodes
Matériel végétal
Choix des espèces et variétés de Fabacées cultivées
Mise en place des cultures de Fabacées et production des exsudats racinaires
Lots de graines de P. ramosa utilisés pour les tests d’activité
Préparation des suspensions de graines stériles et mise en conditionnement
Tests de germination des graines d’orobanche en plaque 96 puits
Collecte de la biomasse et extraction à froid des composés hydrophiles et hydrophobes
Analyse de composés purs
Analyse statistique des données
Résultats
Résultats des tests d’activités stimulantes de la germination des graines d’orobanche
Résultats des tests d’inhibition de la germination des graines d’orobanche
Résultats des tests pour les extraits racinaires et foliaires
Résultats des tests d’activité des composés purs
Discussion
Conclusion
Références bibliographiques

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