Soutenance mémoire
Tests comportementaux
Test du champ ouvert (Open field; OF)
Le test de l’OF, initialement décrit par Hall (1934), a été développé dans le but de mesurer des différences de réactivités émotionnelles chez les rongeurs. L’OF permet donc d’évaluer les comportements ambulatoires ainsi que la néophobie environnementale des rats. Brièvement, l’OF est une unité en plexiglas (70 cm × 70 cm × 40 cm) dont le plancher est divisé en zones centrale et périphérique (Figure 04). Chaque rat est placé individuellement au centre du compartiment et laissé pendant 5 min d’exploration (Sáenz et al., 2006). Un animal anxieux aura tendance à préférer la zone périphérique tout en évitant l’entrée dans la zone centrale. Chaque session est filmée, La distance parcourue, Le nombre de redressements, Le temps passé dans la zone centrale et périphérique sont mesurés. Le dispositif est essuyé après chaque session avec une solution alcoolique pour palier aux effets polarisants dus aux odeurs laissées par le rat précédent .
Test de labyrinthe en croix surélevé (Elevated plus-maze; EPM)
L’EPM est un test largement étudié pour mettre en évidence les propriétés anxiolytiques ou anxiogènes des composés pharmacologiques. Le dispositif consiste en un labyrinthe surélevé ayant la forme d’une croix avec deux bras ouverts (50 × 10cm) et deux bras fermés (50 × 10 × 45 cm). L’appareil se situe à une hauteur de 50 cm au dessus du sol (Patin et al., 2005). Chaque rat est placé individuellement au centre de l’EPM dirigé vers un des bras ouverts et son comportement en exploration libre est enregistré et examiné pendant 5 min. Une visite était comptabilisée lorsque le rat avait les quatre pattes dans un bras (Figure 05). Le temps passé et le nombre d’entrée dans les bras ouverts et fermés sont mesurés. L’expérience exploite le conflit, chez les rongeurs, entre la peur des espaces ouverts et le désir d’explorer un nouvel environnement. Les bras fermés représentent une sécurité, alors que les bras ouverts offrent une valeur exploratoire. Un animal anxieux aura naturellement tendance à préférer les espaces clos et sombres par rapport aux espaces ouverts et éclairés. Ainsi, l’anxiété comportementale est mesurée par le degré d’évitement des espaces ouverts du labyrinthe. A la fin de chaque session, l’animal est retourné à sa cage et le dispositif est essuyé avec une solution alcoolique.
Test de la nage forcée (Forced swim test; FST)
La nage forcée est un test largement répandu permettant d’une part d’induire un état de désespoir chez les rongeurs et d’autre part d’étudier la capacité antidépressive des agents pharmacologiques (Porsolt et al., 1978). Le dispositif de ce test consiste en un aquarium (54 × 34 × 60 cm) rempli d’eau à une hauteur de 40 cm et maintenue à 24±1°C (MolinaHernández et al., 2004) (Figure 06). A cette hauteur, le rat ne pourra pas se servir de ses membres inférieurs pour se maintenir à la surface et sera donc soumis à une nage forcée. Les rats de chaque groupe ont été placés individuellement dans l’aquarium pendant 15 min (prétest) et 24h après ils sont replacés dans ce dispositif pendant 5 min (test). A la fin de chaque session, les animaux sont retirés, séchés et réchauffés avant de regagner leur cage habituelle et l’eau de l’aquarium est renouvelée. Les temps d’immobilité, de nage et d’escalade sont mesurés. Les animaux sont considérés immobiles lorsqu’ils flottent dans une position horizontale et ne réalisent que de petits mouvements visant à garder leur tête au dessus du niveau de l’eau afin d’éviter la noyade.
Prélèvements
Les rats ont été décapités 24h après le test de la nage forcée. Le sang a été recueilli dans des tubes contenant l’acide éthylène diamine tétra-acétique (EDTA) pour la quantification des cellules immunitaires et des tubes héparinés. Le sang des tubes héparinés est centrifugé à 5000 tours/minute pendant 15 minutes. Le plasma obtenu est aliquoté dans des tubes eppendorf puis conservé au congélateur à une température de – 20°C pour le dosage des paramètres biochimiques (métabolites, transaminases et phosphatase alcaline). Des gouttes sanguines servent à mesurer la glycémie par le glucomètre (Accu-Check, Germany). Le cerveau a été rapidement disséqué, pesé puis une fraction (500mg) homogénéisé dans 4ml du tampon phosphate (0,1 mol/l; pH=6,4) pour le dosage de l’activité de l’AChE, la GST et le taux de GSH. Une autre fraction de cerveau (500mg) est homogénéisé dans 4 ml du tampon (Tris/HCL 50mM ; pH=7.5) pour le dosage du MDA. Les homogénats obtenus ont été centrifugés à 10000 ×g (4°C) pendant 15 min et les surnageants serviront aux dosages des protéines totales et les paramètres du stress oxydatif.
Profil immunitaire
Les paramètres immunitaires (GB- globules blancs, LYM- Lymphocytes, MONOMonocytes, EOS- Eosinophiles, NEUT-Neutrophiles) ont été mesurés à l’aide d’un automate d’hématologie (PCE-210 model 2009 ; Japan).
Dosages
Dosage des paramètres du stress oxydant cérébral
Glutathion réduit (GSH)
Le dosage du glutathion réduit (GSH) a été effectué selon la méthode d’Ellman (1959). 1 ml de surnageant a été précipité avec 1,0 ml d’acide sulfosalicylique (4%) puis incubé à 4°C pendant 1 heure. La solution est ensuite centrifugée à 1200 ×g pendant 15 min à 4°C. 1,0 ml de surnageant a été ajouté à 2,7 ml de tampon phosphate (0,1M ; pH 8,0) et 0,2 ml de DTNB (5-5’dithio-bis-(2-acide nitrobenzoïque). L’absorption optique a été obtenue à l’aide d’un spectrophotomètre UV à 412nm.
Glutathion-S-Transférase (GST)
L’activité de la glutathion-S-transférase (GST) a été estimée selon la méthode d’Habig et al. (1974). Brièvement, la mesure de l’activité GST consiste à fournir à l’enzyme un substrat; 20 μl du surnageant ajouté au 50 μl de CDNB (1-chloro-2-4-di-nitrobenzène ;0.02 M) et 830 μl de Tampon phosphate (PBS) (0.1 M, pH 7.4) en présence de 100 μl glutathion (0.1 M). La réaction de conjugaison entre le glutathion et le CDNB entraine la formation d’une molécule nouvelle qui absorbe la lumière à 340 nm de longueur d’onde.
Malondialdéhyde (MDA)
La peroxydation lipidique a été évaluée par la mesure des substances réagissant avec l’acide thiobarbiturique (TBARS) dont le malondialdéhyde (MDA) (Draper et Hadley, 1990). 2,5 ml d’acide trichloroacétique (TCA, 10%) ont été ajoutés à 0,5 ml de surnageant et mis dans un bain marie à 100°C pendant 15 min. Après refroidissement dans un bain froid, le mélange a été centrifugé à 1000 ×g pendant 10 min, et 2,0 ml de surnageant ont été ajoutés à 1,0 ml d’acide thiobarbiturique (TBA, 0,67%) et mis dans un bain marie à 100°C pendant 15 min. Un refroidissement dans un bain froid a été effectué puis l’absorbance a été mesurée à 532 nm.
Dosage de l’acétylcholinestérase (AChE) cérébral
La mesure de l’activité de L’AChE a été évaluée selon la méthode d’Ellman (1961). Ainsi, l’acétylcholinestérase contenue dans la fraction des tissus va réagir avec l’acétylthiocholine (ASCh) en libérant l’acétate et la thiocholine (SCh). Cette dernière réagit à son tour avec le 5-5’-Dithio-bis (2-nitrobenzoate) (DTNB) en donnant du TNB produit de couleur jaune qui est absorbée à 412 nm et dont la concentration est proportionnelle à la quantité d’enzymes présente dans le milieu. Brièvement, 50μl de surnageant sont ajoutés au 50 μl de l’acétylthiocholine (ASCh), 50 μl 5-5’-Dithio-bis (2-nitrobenzoate) (DTNB) et 1000μl Tampon phosphate (PBS) (0.1 M, pH 7.4). La lecture de l’absorbance se fait à 410 nm à un intervalle de temps de 15 min (lecture de la DO chaque 3min) contre la solution blanc.
Protéines
La quantité des protéines dans les surnageants a été déterminée selon la méthode de Bradford (1976) en utilisant l’albumine bovine sérique (BSA) comme standard. Brièvement, 0.1 ml de l’homogénat est ajouté au 5 ml de bleu de Coomassie comme réactif, le mélange est agité puis laissé à température ambiante pendant 5 min pour la stabilisation de la couleur. Finalement, on mesure l’absorbance de l’échantillon à 595nm contre le blanc contenant l’eau distillée à la place de l’homogénat. La densité optique obtenue est rapportée sur la courbe d’étalonnage (0 → 1 mg/ml de BSA) préalablement réalisée dans les mêmes conditions.
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Table des matières
1. INTRODUCTION
2. MATERIEL ET METHODES
2.1. Matériel biologique
2.1.1. Animaux d’élevage
2.1.2. Enceinte biologique
2.2. Méthodes
2.2.1. Traitement
2.2.1.1. Fenthion
2.2.1.2. Quercétine
2.2.1.3. Resvératrol
2.2.2. Protocole expérimental
2.2.3. Tests comportementaux
2.2.3.1. Test du champ ouvert (OF)
2.2.3.2. Test du labyrinthe en croix surélevé (EPM)
2.2.3.3. Test de la nage forcée (FST)
2.2.4. Prélèvements
2.2.5. Profil immunitaire
2.2.6. Dosages
2.2.6.1. Dosage des paramètres du stress oxydant cérébral
2.2.6.1.1. Glutathion réduit (GSH)
2.2.6.1.2. Glutathion-S-Transférase (GST)
2.2.6.1.3. Malondialdéhyde (MDA)
2.2.6.2. Dosage de l’acétylcholinestérase (AChE) cérébral
2.2.6.3. Protéines
2.2.6.4. Dosage des métabolites
2.2.6.4.1. Dosage du cholestérol
2.2.6.4.2. Dosage des triglycérides
2.2.6.4.3. Dosage des protéines totales
2.2.6.4.4. Mesure de la glycémie
2.2.6.5. Dosage des transaminases et de la phosphatase alcaline
2.2.6.5.1. Dosage de l’alanine amino-transférase (ALAT/TGP)
2.2.6.5.2. Dosage de l’aspartate amino-transférase (ASAT/TGO)
2.2.6.5.3. Dosage de la phosphatase alcaline (PAL)
2.2.7. Analyse statistique des données
3. RESULATS
3.1. Variation du poids corporel
3.3. Variation des paramètres comportementaux
3.3.1. Variation des paramètres du labyrinthe en croix surélevé
3.3.2. Variation des paramètres du champ ouvert
3.3.3. Variation des paramètres de la nage forcée
3.4. Variation des paramètres immunitaires
3.5. Variation des paramètres biochimiques
3.6. Variation de l’activité cholinestérasique et du stress oxydatif cérébral
4. DISCUSSION
4.1. Effet du fenthion sur le statut cognitivo-comportemental
et la neurochimie cérébrale
4.2. Effet du fenthion sur les paramètres biochimiques
4.3. Effet du fenthion sur les paramètres immunitaires
4.4. Effet de la quercétine
4.5. Effet du resvératrol
4.6. Effet du mélange
5. CONCLUSION ET PERSPECTIVES
6. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
