Test des sondes sur mélanges de cellules mâles et femelles

Test des sondes sur mélanges de cellules mâles et femelles

Réalisation des sondes

Marquage ADN

(kit BioPrime®) Le marquage ADN est réalisé à l’aide du kit BioPrime® DNA Labelling System de Invitrogen™ by life technologies™ (Référence 18094-011). Normalement la concentration d’ADN à marquer doit être d’environ 50ng/µL (1µg si non purifié) selon le protocole décrit dans le kit. Comme l’ADN présent dans les tubes n’est pas dosé, la quantité de solution d’ADN utilisée est plus grande que celle recommandée : 8µL à la place des 1µL recommandés. Un tube contenant 8µL d’ADN issu de l’amplification, 20µL de Primers 2,5X et 12,5µL d’eau stérile est préparé. Le tube est placé 5 min au bain marie à 100°C (mettre un bouchon anti-pression) afin de dénaturer l’ADN. Puis il est mis dans la glace au minimum 3 minutes afin de stopper la réaction. Il est brièvement mis à centrifuger. Puis 5µL de dNTP 10X (contenant les bases AGC et un peu de T – hors kit) sont ajoutés, ainsi que 3,5µL d’UTP marqué (hors kit) qui est soit de la biotine pour le chromosome X, soit de la digoxigénine pour le chromosome Y et enfin 1µL d’enzyme Klenow qui va permettre d’introduire les bases marquées au sein de l’ADN. Le contenu du tube est mélangé par retournement puis placé 7h (minimum 1h30) au bain-marie à 37°C avant d’ajouter 5µL de « Stop buffer » par tube. Le volume total est alors de 55µL/tube.

Précipitation des sondes

L’ADN Compétiteur est de l’ADN contenant des séquences répétées (non spécifiques des chromosomes X et Y) qui s’hybride sur les séquences répétées de la sonde la rendant plus spécifique. Le tube est mélangé par retournement (pas de vortex) et placé à -20°C une nuit (ou 3h à -80°C).

Préparation des sondes

Le tube est centrifugé à 13000 t/min pendant 30 min à 4°C. Le surnageant est éliminé par retournement du tube puis 1mL d’éthanol à 70% froid (-20°C) est ajouté. Le culot est décollé à l’aide du vortex. Ensuite le tube est mis à centrifugé à 13000 t/min pendant 10min à 4°C. Ces étapes sont répétées encore une fois. Le surnageant est retiré par retournement. Pour enlever le maximum de gouttes d’éthanol, une pipette micrométrique p100 est utilisée. Les tubes sont placés sous cloche à vide pendant 8min pour les sécher. La solution d’hybridation (solution 50% formaldéhyde à 37°C) est ajoutée (15µL). Les tubes sont mis au bain-marie à 37°C. Au bout de quelques minutes, la sonde est remise en suspension. Le tube est laissé au bain marie minimum 4h en mélangeant toutes les heures au vortex. Le tube est conservé à -20°C si la sonde n’est pas utilisée directement

Guide du mémoire de fin d’études avec la catégorie Marquage en temps réel – non invasif

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Table des matières

INTRODUCTION
1. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
1.1. Les cellules souches mésenchymateuses – intérêt en médecine régénérative
1.1.1. Définition d’une cellule souche mésenchymateuse
1.1.2. Etendue de la recherche actuelle sur les CSM
1.1.3. Les cellules souches mésenchymateuses d’origine adipeuse
1.2. Mécanisme d’action des ASC : données actuelles
1.2.1. Propriété de régénération des ASC
1.2.2. Propriétés paracrines et immuno-modulatrices des ASC
1.2.3. Administration et biodistribution des ASC
1.2.3.1. Les différentes voies d’administration
1.2.3.2. Le « homing » ou guidage des ASC vers le tissu lésé
1.2.3.3. Notion de niche cellulaire
1.3. Le « tracking » des cellules souches – méthodes actuelles
1.3.1. Marquage en temps réel – non invasif
1.3.1.1. Marquage direct
1.3.1.2. Marquage indirect
1.3.2. Marquage post-mortem
1.3.2.1. Immunohistochimie
1.3.2.2. Hybridation in-situ
1.3.2.3. PCR quantitative
1.3.3. Bilan sur les techniques de marquage
1.4. Sondes dirigées vers les chromosomes sexuels
1.5. Choix du modèle animal
2. PARTIE EXPERIMENTALE
2.1. MATERIELS ET METHODES
2.1.1. Objectif de notre étude
2.1.2. La culture cellulaire
2.1.2.1. Culture à partir de tissu cutané
2.1.2.1.1. Mise en
culture des morceaux de peau
2.1.2.1.2. Division
2.1.2.1.3. Récupération des cellules en division
2.1.2.1.4. Fixation
2.1.2.1.5. Etalement des cellules sur lamelles
2.1.2.2. Culture à partir de sang
2.1.2.2.1. Prélèvement et mise en culture
2.1.2.2.2. Arrêt des cultures et fixation
2.1.2.2.3. Etalement des cellules sur lamelles
2.1.3. Microdissection
2.1.3.1. Préparation des lamelles
2.1.3.2. Matériel pour microdissection
2.1.3.3. Procédure de microdissection
2.1.4. Première amplification par PCR
2.1.4.1. Pré-amplification
2.1.4.2. Amplification
2.1.5. Réalisation des sondes
2.1.5.1. Marquage ADN (kit BioPrime®)
2.1.5.2. Précipitation des sondes
2.1.5.3. Préparation des sondes
2.1.6. Protocole d’hybridation in-situ adapté aux lames cytologiques
2.1.6.1. Préparation des lames cytologiques
2.1.6.2. Hybridation
2.1.6.2.1. Hybridation avec l’Hybridizer ® DAKO
2.1.6.2.2. Hybridation avec pré-étapes de dénaturation
2.1.6.3. Lavages stringents
2.1.6.4. Préparation des anticorps et révélation
2.1.7. Protocole d’hybridation in-situ adapté aux coupes histologiques
2.1.7.1. Préparation des lames
2.1.7.1.1. Réalisation des lames
2.1.7.1.2. Déparaffinage et réhydratation
2.1.7.1.3. Etapes de prétraitement
2.1.7.2. Hybridation
2.1.7.2.1. Avec pré-étapes de dénaturation
2.1.7.2.2. Avec l’Hybridizer DAKO
2.1.7.3. Lavage
2.1.7.4. Préparation des anticorps et révélation
2.2. RESULTATS
2.2.1. Réalisation des sondes
2.2.2. Test des sondes sur mélanges de cellules mâles et femelles
2.2.3. Test des sondes sur coupes histologiques
2.3. DISCUSSION
3. CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE (logiciel ZOTERO) ANNEXES