Test de diagnostique rapide(tdr) du paludisme

Historique sur l’agent vecteur et sur l’agent pathogène

En 1880, Charles-Louis-Alphonse Laveran, un médecin de l’armée française, a découvert le parasite responsable du paludisme en examinant des échantillons de sang au microscope, en Algérie. Sa découverte a alors été rejetée par le milieu médical et ce n’est qu’en 1886 qu’elle fut acceptée par les scientifiques italiens, les chefs de file dans le domaine à cette époque [30].
En 1966, on avait démontré que 10 types de Plasmodium, présents chez diverses espèces de singes, pouvaient infecter l’homme. Il arrive souvent que l’infection ne produise aucun symptôme chez une espèce donnée, mais occasionne une forme grave de la maladie, et entraîne même la mort, lorsqu’elle est inoculée chez une autre espèce [30].

Historique des traitements et des vaccins

Il y a plus de 350 ans, on employait déjà la quinine, un alcaloïde végétal toxique extrait de l’écorce d’un arbre d’Amérique du Sud, le quinquina ou Cinchona, pour traiter le paludisme.
Ayant constaté les propriétés antipaludiques de l’écorce de quinquina, les missionnaires jésuites venus en Amérique du Sud les ont fait connaître en Europe dès 1630, et en Inde, dès 1657.
J. Wagner von Jauregg a reçu le prix Nobel de médecine en 1927 après s’être servi du parasite du paludisme pour traiter la syphilis. Il vaccinait le malade à l’aide d’une forme de parasites produisant des fièvres afin de détruire la bactérie responsable de la syphilis, bactérie sensible à la température. Après trois ou quatre accès de fièvre, il lui administrait de la quinine afin d’accélérer le traitement.
On a continué de traiter la syphilis à l’aide de parasites provenant du singe et de l’homme jusqu’à ce que les antibiotiques fassent leur apparition, au milieu des années 1950.
Les Hollandais ont acheté des graines de quinquina d’un négociant britannique, Charles Leger, qui les avait rapportées du Pérou. Ils ont établi des plantations de quinquina à Java, au milieu du XIXe siècle, et ont vite eu le quasi-monopole de la quinine.
La quinine devint introuvable lorsque Java tomba aux mains des Japonais durant la Deuxième Guerre mondiale. Il fallait donc mettre au point de toute urgence un antipaludique synthétique.
Contrairement à la quinine, tirée de l’écorce d’un arbre, la chloroquine est un produit synthétique qui appartient aux composés dits amino-4-quinoléines. La chloroquine a été mise au point par une société pharmaceutique allemande, en 1934.
La première amino-4-quinoléine était la Résochine. Légèrement modifiée quelques années plus tard, elle a pris le nom de Sontochine et a été acquise par les Américains en 1943, après la libération de Tunis, durant la Deuxième Guerre mondiale. Sa composition a été de nouveau légèrement modifiée et elle a été rebaptisée chloroquine.
En 1950, des projets pilotes de pulvérisation de DDT pour lutter contre le paludisme ont pris forme. L’Organisation mondiale de la santé (OMS) a lancé des programmes d’éradication du paludisme à l’échelle mondiale au milieu desannées 1950.
Dans les années 1960, des souches de Plasmodium falciparumrésistantes à la chloroquine sont apparues à cause de son utilisation excessive et, probablement, de doses insuffisantes. À ce moment-là, il n’y avait pas de médicament susceptible de traiter ces formes de paludisme résistantes à la chloroquine sauf l’antipaludique le plus ancien, la quinine.
La quinine est maintenant entièrement synthétisée : il s’agit de la méfloquine dont la structure chimique ressemble à celle de la quinine.
Un « nouvel » antipaludique, leqinghaosu, dérivé d’une plante (Artemisia annua L), est employé depuis plus de deux mille ans en Chine pour traiter les fièvres associées au paludisme. On a démontré l’efficacité de ce médicament contre les formes mortelles de paludisme à Plasmodium falciparumet contre les souches de Plasmodium falciparum résistantes à la chloroquine.
De 1956 à 1969, les États-Unis, par l’entremise de la U.S. Agency for International Aid (USAID), ont consacré 790 millions de dollars au programme mondial d’éradication du paludisme.
De 1955 jusqu’aux années 1970, USAID a versé environ un milliard de dollars à l’OMS et à différents programmes nationaux lutte contre le paludisme.
En 1967, ayant réalisé qu’il était impossible d’éradiquer le paludisme dans le monde pour différentes raisons, l’OMS a mis en œuvre des moyens afin de limiter l’ampleur de la maladie. En 1972, devant son échec, l’OMS a mis fin au programme mondial d’éradication du paludisme.

EPIDEMIOLOGIE

Situation de la maladie

A l’échelle mondiale

C’est l’une des affections les plus meurtrières faisant plus de victimes que toute autre maladie transmissible à l’exception de la tuberculose. Selon le Rapport 2011 sur le paludisme dans le monde, publié par l’Organisation mondiale de la Santé, les taux de mortalité attribuables au paludisme ont baissé, depuis 2000, de plus de 25% au niveau mondial et de 33% dans la Région africaine de l’OMS.
On estime à environ 300 à 500 millions de cas cliniques de paludisme chaque année sur le plan mondial et 665 000 le nombre de décès.

Modalités épidémiologiques

Tous les hommes sont réceptifs aux Plasmodiums humains, mais les mélanoafricains sont réfractaires àP. vivax. Cependant, une étude récente réalisée à Madagascar a montré le contraire. En effet, d’après celle-ci, P. vivaxa été retrouvé chez les sujets Duffy(-).
Le facteur limitant la distribution de la maladie concerne la transmission de la maladie d’homme à homme et par conséquent les vecteurs. L’homme sert d’hôte vertébré intermédiaire voie d’amplificateur et évidement de victime. Le moustique chez qui se fait la reproduction sexuée du parasite, est l’hôte définitif et le pivot de l’épidémiologie du paludisme. En zone intertropicale chaude et humide, abondent les anophèles capables d’assurer en permanence la transmission des hématozoaires. Le paludisme essentiellement à Plasmodium falciparum, y est donc endémique. Les anophèles pendant les saisons endémiques pullulent. C’est la période de transmission intense. En zone subtropicale ou tempérée chaude, la transmission du paludisme n’est possible qu’à la belle saison. Le paludisme, surtout à Plasmodium vivax, sévit sous forme d’épidémies saisonnières.

Immunité dans le paludisme 

Il n’y a pas d’immunité antipaludique, il s’agit plutôt d’une prémunition. La prémunition est un état d’immunité relative, un équilibre hôte-parasite après plusieurs années d’exposition, si la transmission est constante. Il est acquis progressivement en 5 ans et plus, en fonction du niveau de transmission du paludisme (au prix d’une mortalité infantile élevée). Il est labile et disparaît en 12 à 24 mois chez le sujet immun qui quitte la zone d’endémie. Il disparait aussi chez le sujet splénectomisé et chez la femme enceinte au 2 ième et 3 ième trimestre de la grossesse.
L’acquisition lente et progressive de la prémunition est généralement couplée avec l’acquisition d’immunoglobulines G (IgG) spécifique de la plupart des nombreux antigènes parasitaires, dénommés antigènes variants de surface(AVS). La prémunition du paludisme serait supportée par l’immunité humorale et non par l’immunité cellulaire comme on a longtemps pensé.
Cela permet de comprendre la fréquence du paludisme chez les primipares ; ces jeunes femmes vivant dans les zones d’endémie palustre ne possèdent pas d’IgG spécifiques des AVS exprimés par les parasites adhérant au placenta (AVSPAP). A la suite de l’exposition des AVS-PAP, des IgG spécifiques de ces antigènes sont rapidement produits, ce qui est cohérent avec la diminution de la susceptibilité du paludisme de la femme enceinte avec l’augmentation du nombre de grossesse.
Les premiers mois de vie, l’enfant est relativement protégé par les anticorps qu’il a reçus de sa mère à travers le placenta. Ces AC disparaissent vers 6 mois de vie et il perd cette protection .Du fait de ses défenses immunitaires insuffisamment développées, entre 6 mois et 5 ans, l’enfant est plus sensible à la maladie [77].

Agents pathogènes et spécificités

Définition

Le Plasmodiumest un protozoaire polymorphe intra érythrocytaire mesurant 2 à 3 micromètres de diamètre. Sa multiplication est asexuée (ou schizogonique) chez l’homme et sexuée (ou sporogonique) chez le moustique vecteur, l’anophèle femelle.

Plasmodium knowlesi

Plasmodium knowlesi était seulement un parasite sinien (macaque) de l’Asie du Sud-est.
Actuellement, plusieurs centaines de cas ont été rapportés chez l’homme dont entre autre 5 cas aux Philippines, dont 4 mortels.
Au microscope, Plasmodium knowlesiressemble à Plasmodium malariae,mais le confondre pourrait être gravissime car, contrairement à ce dernier, il peut être létal pour l’homme. Le seul point positif est qu’il est à ce jour, sensible à la simple chloroquine (qui constitue le traitement habituel de l’accès à Plasmodium malariae).

La phase aquatique

Les moustiques femelles pondent leurs œufs à la surface de l’eau au dessus de laquelle, ils flottent grâce à différents dispositifs. Dans le cas des anophèles, il s’agit de flotteurs dont la morphologie a une grande importance taxonomique.
Les œufs, sortent des larves de premier stade qui subissent trois mues successives. La larve de stade 4 subit une mue particulièrement importante (nymphose), et se transforme en nymphe, à la morphologie particulière. Ce stade toujours aquatique, est libre mais ne se nourrit pas. Tous les stades aquatiques (larves et nymphes) ont une respiration aérienne.

La phase aérienne

La nymphe va subir une éclosion imaginale et donner l’insecte parfait ou imago, mâle ou femelle qui après durcissement de sa cuticule s’envole. C’est pendant cette phase aérienne que se feral’alimentation sanguine de la femelle ainsi que la reproduction sexuée.

Biologie des Anophèles

Alimentation et reproduction

L’accouplement se fait peu après l’éclosion imaginale. La femelle n’est fécondée qu’une seule fois pour toute sa vie et les spermatozoïdes sont stockés dans la spermathèque. La fécondation peut avoir lieu avant ou après le premier repas qui est généralement de faible quantité et stimule l’oogenèse. Il existe eneffet une relation entre l’alimentation sanguine et la maturation ovarienne dans le cadre du cycle gonotrophique qui se compose normalement de trois phases :
– La femelle à jeun recherche un hôte pour son premier repas sanguin,
– La digestion du sang est accompagnée de la maturation ovarienne,
– La recherche du lieu de ponte par la femelle gravide.

Longévité

Elle varie selon les espèces, les conditions climatiques et écologiques. En Afrique subsaharienne, la durée de vie moyenne des principaux vecteurs du paludisme est de 3 à 4 semaines.

Vol et dispersion

La vitesse de vol des moustiques d’environ 8 à 9 m/mn et leur rayon d’action est variable selon les espèces et les conditions climatiques. Les moustiques utilisent également divers moyens de transport (bateaux, avions) et sont à l’origine de cas de paludisme sporadique. Ils peuvent provoquer de grandes flambées épidémiques.

Accès simple

Le facteur déclenchant de la fièvre est la libération au moment de l’éclatement des hématies parasitées, de pigment malarique (hémozoïne) qui agit sur les centres bulbaires de la thermorégulation.
L’anémie résulte, avant tout, de la lyse des hématies parasitées, mais également des hématies saines par phagocytose.
La thrombopénie est due à une séquestration des plaquettes ; des antigènes solubles induiraient la fixation d’IgG antiplaquettaires.
L’hépatomégalie et surtout la splénomégalie sont la conséquence de l’hyperactivité du système monocyte-macrophage chargé de débarrasser l’organisme du pigment malarique et des débris d’hématies.
La transformation de l’hémoglobine libérée en bilirubine libre par le foie est à l’origine d’un subictère.

Tests immunochromatographiques ou tests rapides

Ces tests faisant l’objet de notre étude, nous vous proposons dans le chapitre suivant (chapitre VII), une revue de la littérature sur les tests rapides de diagnostic du paludisme.

Technique de PCR ou amplification génique

C’est méthode très sensible qui détecte des séquences d’acides nucléiques spécifiques duPlasmodium. C’est une technique de biologie moléculaire très pointue.
En aucun cas, elle ne peut être utilisée pour un diagnostic d’urgence. Elle est très couteuse, et est réservée aux laboratoires de recherche, en particulier, pour la recherche fondamentale sur la mutation des gènes du parasite impliqués dans l’apparition des résistances aux antipaludiques de synthèse.

Diagnostic indirect

Il est basé sur la formation et la mise en évidence in vitro de complexes antigènes-anticorps.

Tests sérologiques

Ce sont des tests de mise en évidence indirecte de la présence du Plasmodium dans un organisme. Ils permettent de faire le diagnostic du paludisme, non pas la recherche directe du parasite, mais par la mise en évidence des anticorps antiplasmodiaux fabriqués par l’organisme infesté par le parasite.
Les anticorps fabriqués par le corps humain contre les antigènes d’un Plasmodium, apparaissent à partir du 20eme jour après l’infestation. Ils augmentent vers le 3 e éme mois, puis diminuent progressivement jusqu’à disparaitre en 1an, lorsque l’organisme n’est plus en contact avec le parasite.
Quand les accès palustres sont nombreux, le titre des anticorps est élevé.
Pour ce qui concerne le paludisme, la présence d’anticorps ne signifie pas que la personne concernée est immunisée contre cette maladie.
Les tests sérologiques sont plus utilisés pour la sécurité transfusionnelle dans les pays non endémiques et dans le cadre d’études épidémiologiques, mais pas pour faire un diagnostic de la maladie dans les pays endémiques.

immunofluorescence indirecte( IFI)

Elle utilise les antigènes de Plasmodiumpour faire réagir les anticorps fabriqués par l’organisme.
La liaison entre les antigènes du test et les anticorps du malade est rendu visible par la fluorescéine, cela n’exclut pas un paludisme.
Une sérologie positive veut donc dire que l’organisme a été en contact avec le parasite, et lorsque le test est négatif, cela n’exclut pas un paludisme.

technique ELISA

C’est un test immunoenzymatique qui permet de mettre en contact un antigène plasmodiale spécifique avec le sérum du malade contenant l’anticorps à tester et un conjugué enzymatique anti globuline humain.
La réaction positive se traduit par une réaction colorée dont l’intensité de la coloration est proportionnelle au taux dans le sérum.

TESTS DE DIAGNOSTIC RAPIDE(TDR) DU PALUDISME

Le diagnostic biologique du paludisme est une urgence médicale d’importance vitale. L’examen d’étalements minces du sang fixé et coloré demeure la technique de référence, mais exige une expérience personnelle dont ne disposent pas tous les biologistes praticiens. Pour ces rasons, l’on a recours à d’autres méthodes plus simples qui n’exigent pas de compétences particulières.
C’est en 1992 que l’OMS a déclaré prioritaire, la recherche et la mise au point de technique diagnostique rapide, simples et peu coûteuses permettant un diagnostic et un traitement précoce du paludisme, notamment dans des dispensaires de soin de santé primaire en zones d’endémie. De nouvelles méthodes de diagnostic ont donc été développées [60].
Un test de diagnostic rapide permet un diagnostic biologique de certitude ou de quasi-certitude dans un délai plus court que la technique de référence, généralement de quelques minutes. La plupart des tests rapides sont conçus pour être employés sur le terrain dans l’urgence, avec des moyens réduits.

Antigène HRP II

L’HRPII est un antigène plasmodiale glycoprotéïque. Il apparaît à la surface des hématies parasitées spécifiquement par Plasmodium falciparum, et il est sécrété durant le cycle intra érythrocytaire, avec un pic lors de la rupture des schizontes.
Seules les formes asexuées de P. falciparumexprime cette glycoprotéine. Les tests permettant sa détection reposent sur le principe d’immunochromatographie.
Cette protéine soluble a été la première à être utilisée pour l’utilisation des tests de diagnostic rapide.
Au moins cinq protéines du paludisme (HRP I, HRP II, EMP I, EMP II, EMPIII) ont été identifiées dans la surface ou en association avec le cytosquelette des érythrocytes infectés de Plasmodium falciparum. HRPII est une protéine riche en histidine et en alanine, qui est localisée en plusieurs compartiments cellulaires dont le cytoplasme du parasite. la teneur de l’histidine (H), de l’alanine (A) et de l’acide aspartique (D) dans HRPII est respectivement de 34%, et 10%. Elle est caractérisée par plusieurs répétitions contiguës des ordres AAH et AHHAAD. Les protéines riches en histidine étaient parmi les premières protéines plasmodiales cytoplasmiques aux étapes asexuelles des P. lophurae, un parasite avien de malaria.
La fonction exacte de HRPII, jusqu’ici, n’est pas très bien comprise. La protéine riche en histidine II du P.falciparuma été identifie comme polymérase de l’hème qui détoxifie l’hème libre par sa polymérisation à l’hémozoine inactive.
Il a été montré qu’il s’agit d’une répétition d’un hexa peptide (Ala-His-His-AlaAla-ASP) qui apparait 33 fois dans le Pf HRP II, et qui peut être l’accepteur principal de l’hème.
Actuellement, l’application principale de la connaissance détaillée de l’HPRII est son emploi pour le diagnostic du paludisme par détection d’antigène HRPII de P.falciparum.
Il existe une circulation prolongée d’HRPII détectable une quinzaine de jours après la disparition des parasites du sang circulant. Cette clairance plus longue de l’HRPII permet un diagnostic rétrospectif de la présence de P. falciparum, mais ne permettra pas de juger de l’efficacité d’un traitement antipaludique. Sa détection par immunochromatographie sur le sang total est réalisable en moins de 10 minutes, avec une spécificité voisine de 90%. La sensibilité varie de 83% à 100%, le test pouvant être mis en défaut par les faibles parasitémies, l’association avec P. vivaxou par une forte proportion de gamétocytes.

Enzymes détectées

pLDH

Le stade intra érythrocytaire de Plasmodium falciparumdépend principalement de l’énergie générée par la glycose. Le NAD consomme pendant la glycolyse, est régénéré par la fermentation du pyruvate dans les mitochondries.
Contrairement aux cellules des mammifères et à la plupart des organismes aérobies. La lactate est le produit final de la voie glycolytique chez le plasmodium. Le lactate déshydrogénase (LDH) catalyse la réduction de pyruvate en lattage en présence du NADH. Ceci permet la production rapide d’énergie selon les exigences du parasite. Le pLDH est aujourd’hui identifiée, et une inhibition spécifique de cette enzyme constitue une cible potentielle pour des molécules thérapeutiques anti malariques [55].
L’enzyme pLDH est produite par toutes les plasmodies humaines au cours de leur développement intra érythrocytaire. La détection du lactate déshydrogénase du parasite (pLDH) avait initialement été mise au point comme méthode de mesure de la croissance des parasite in vitro au cours de tests de susceptibilité aux médicaments. Le principe du test est que l’enzyme du parasite (pLDH) à des caractères biochimiques différents de la LDH humaine et peut, par conséquent,être mesurée d’une façon différentielle en utilisant un test colorimétrique simple.

Table des matières
LISTE DES ABREVIATIONS
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES FIGURES
INTRODUCTION
PREMIER PARTIE : REVUE DE LA LITTERATURE
I-HISTORIQUE
II-EPIDEMIOLOGIE
III-PHYSIOPATHOLOGIE DU PALUDISME
IV-SIGNES CLINIQUES DU PALUDISME
V-DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DU PALUDISME
VI-TEST DE DIAGNOSTIQUE RAPIDE(TDR) DU PALUDISME
VII-LE PROTOCOLE DE TRAITEMENT
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL PERSONNEL
I- MATERIEL
II-METHODOLOGIE
RESULTATS
I- DONNEES EPIDEMIOLOGIQUES
II-DONNEES CLINIQUES
III-DONNEES THERAPEUTIQUES
IV-DONNEES BIOLOGIQUES
V- ETUDE ANALYTIQUE
VI-PERFORMANCE DES DIFFERRENTS EXAMENS BIOLOGIQUES
DISCUSSION
I- ASPECTS EPIDEMIOLOGIQUES
II- ASPECTS CLINIQUES
III- ASPECTS THERAPEUTIQUES
IV- ASPECTS BIOLOGIQUES
V-PERFORMANCE DES TESTS DE DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

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