Soutenance mémoire
Radiothérapie
La radiothérapie était délivrée selon une modalité conformationnelle 3D. La dose prescrite dans l’ensemble du sein ou de la paroi thoracique était de 50 Grays (Gy) en 25 fractions de 2 Gy, avec une surimpression de 16 Gy en 8 fractions de 2 Gy en cas de tumeur infiltrante, ou 10 Gy en 5 fractions au niveau de la cicatrice de mastectomie en fonction du risque de récidive cutanée. L’irradiation des aires ganglionnaires sus-claviculaires et de la chaine mammaire interne (CMI) était réalisée pour les patientes présentant un envahissement ganglionnaire ou une tumeur localisée aux quadrants mammaires internes. L’irradiation axillaire était réalisée en cas de macro-métastase chez les patientes refusant le curage ganglionnaire. Pour la CMI la dose de radiothérapie prescrite était de 50 Gy en 25 fractions de 2 Gy délivrée par une association de photons pour 20 Gy et d’électrons pour 30 Gy afin d’épargner les structures médiastinales. Pour l’aire sus-claviculaire et/ou axillaire la dose de radiothérapie prescrite était de 46 Gy en 23 fractions de 2 Gy. Le traitement était délivré selon une technique de radiothérapie conformationnelle en 3 dimensions, sous un accélérateur de type Synergy Elekta®, avec un débit de dose de 0.4Gy/min.
Le volume osseux inclus dans l’isodose 0,5 Gy a été contouré pour chaque patiente sur le logiciel de planification de radiothérapie Pinnacle afin de prendre en compte les faibles doses correspondant à l’irradiation diffusée. De plus, nous avons retenu l’isodose 0.5 Gy en accord avec nos physiciens médicaux, car la capacité de calcul du logiciel de planification de la radiothérapie à des doses plus faibles aurait pu donner des données peu fiables.
Prélèvements
Chaque patiente incluse avait 4 prélèvements sanguins (Figure 1) :
– Un prélèvement initial réalisé immédiatement avant la radiothérapie (T0)
– Un prélèvement réalisé 3 semaines après le début de la radiothérapie (T1)
– Un prélèvement réalisé à la fin de la radiothérapie (T2)
– Un prélèvement réalisé > 10 semaines après T2, c’est à dire après la fin de la radiothérapie (T3).
Les prélèvements sanguins ont été recueillis dans des tubes à usage unique (BecktonDickinson Vacutainer) anti-coagulés par héparinate de lithium (pour le test du micronoyau) ou acide tétra-acétique éthylène diamine (EDTA) pour le test PIG-A. Tous les prélèvements étaient anonymisés. Après anonymisation, ils étaient adressés immédiatement après leur réalisation au laboratoire de Biogénotoxicologie, Santé Humaine & Environnement, IMBE – Institut Méditerranéen de Biodiversité et d’Ecologie – Faculté de médecine de Marseille. Immédiatement après leur réception, les prélèvements ont été exploités pour déterminer, la fréquence de granulocytes GPI-déficients et le TCMN. La technique d’analyse repose sur une détection indirecte de la mutation du gène Pig-A par analyse en cytométrie de flux. Elle repose sur la détection du GPI à la surface cellulaire. Les protéines du GPI seront ciblées par des anticorps spécifiques :
– un anticorps anti-GPI (FLAER)
– un anticorps anti-CD66B
La mutation était affirmée par une absence de l’expression de ces protéines et non par leur diminution.
Réactifs
La solution tampon utilisée était du PBS 1X sans calcium ni magnésium (Life Technologies®, Carlsbad, CA, USA). La solution de lyse des érythrocytes a été préparée avec du chlorure d’ammonium 154 mM, de l’hydrogénocarbonate de potassium 10 mM, d’EDTA 0,1 mM et de l’eau distillée (q.s.p 1 litre de solution finale). La solution a été conservée à 4 ° C et renouvelée mensuellement. Les anticorps utilisés étaient : CD15-Pacific Blue (clone 80H5), CD33- PhycoérythrineCyanine7 (clone D3HL60.251), CD45-Krome Orange (clone J33) et CD66bAlloPhyoCyanine (clone 80H3) de Beckman-Coulter® (Immunotech SAS, a Beckman-Coulter Company, France) Le marqueur utilisé était l’aérolysine fluorescente (FLAER-Alexa488) (Cedarlane®, Burlington, Caroline du Nord, États-Unis).
Immunomarquage
Deux millilitres de sang frais anti-coagulé ont été mélangés avec 20 ml de solution de lyse érythrocytaire pendant 10 minutes. Après centrifugation, l’immunomarquage a été réalisé directement sur le culot en ajoutant 10 µl de CD15-PB, 10 µl de CD33 PC7, 10 µl de CD45- Krome Orange, 10 µl de CD66b-APC et 20 µl de FLAER-Alexa488 pour une incubation d’une période de 30 minutes dans le noir. Le culot a été lavé, remis en suspension dans du PBS1X, avant une analyse immédiate en cytométrie.
Test de cytométrie de flux PIG-A
Les paires anticorps-fluorochrome ont été choisies en fonction des recommandations des bonnes pratiques de laboratoire pour le diagnostic et le suivi des patients atteints d’HPN. Pour la sélection, les paires marqueur-fluorochrome ont été sélectionnées en fonction de leur capacité à isoler les granulocytes dans le sang total : CD15-PB, CD33-PC7, CD45-KO. Les marqueurs d’intérêt pour l’identification des cellules déficientes en GPI dans la population de granulocytes étaient CD66b-APC, un anticorps spécifique des granulocytes dépendant de GPI, et FLAER-A488, un marqueur spécifique de GPI.
L’analyse a été réalisée sur un cytomètre de flux Gallios, fabriqué par Beckman Coulter (Villepinte, France), comprenant 3 lasers d’excitation (violet / bleu / rouge) et capable de détecter 10 couleurs d’émission. Les résultats ont été exprimés en cytogrammes. Le protocole de phénotypage était le suivant : premièrement, les doublets de cellules ont été éliminés en utilisant les paramètres de surface de diffusion directe par rapport aux paramètres de hauteur de diffusion directe. La positivité de l’expression de CD45 a permis de focaliser l’analyse sur les populations immunes. Dans ce cadre, deux graphes CD45 versus structure cellulaire puis CD45 versus CD33 ont permis de limiter l’analyse à des populations immunes non lymphoïdes. Deux marqueurs myéloïdes GPI indépendants, CD15 et CD33, ont été utilisés pour limiter l’analyse aux granulocytes. Les granulocytes sélectionnés étaient définis comme CD15+/CD33 faibles et la sélection des granulocytes concernait les 95% des granulocytes les plus marqués en CD15, afin d’augmenter la spécificité. Enfin, parmi ces granulocytes, les cellules FLAER négatives et CD66b négatives correspondent aux mutants. L’analyse a été réalisée sur au moins 1.10⁶ granulocytes et le taux d’acquisition a été limité à 4 000 événements par seconde pour améliorer la précision de l’analyse.
La première étape du processus d’optimisation a consisté à définir le temps d’incubation, les concentrations d’anticorps et les paramètres cytométriques en flux (données non présentées). L’optimisation et la validation de la détection des granulocytes GPI-déficients ont été effectuées à l’aide d’échantillons de sang d’un donneur sain et d’un patient atteint d’HPN. Pour confirmer que notre protocole est en mesure de noter avec précision les cellules GPIdéficientes dans un échantillon contenant moins de 50 cellules mutantes, nous avons effectué des dilutions en série de granulocytes colorés provenant du patient atteint d’HPN et les avons soumises à une analyse.
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Table des matières
INTRODUCTION
MATERIELS ET METHODES
Patientes
Radiothérapie
Prélèvements
Réactifs
Immunomarquage
Test de cytométrie de flux PIG-A
Test du micronoyau
Analyse statistique des résultats
RESULTATS
Validation de la méthode de quantification des granulocytes GPI-déficients
Distribution de la dose de radiothérapie dans le volume osseux selon les groupes
Caractéristiques de la population
Evaluation clinique du test PIG A
Répétabilité du test
Stabilité des prélèvements dans le temps
Effet de la radiothérapie sur la fréquence de granulocytes GPI-déficients
Effet de la chimiothérapie avant le premier prélèvement sur la fréquence de granulocytes
GPI-déficients
Effet du tabac (comparaison des fumeurs et non-fumeurs et relation avec la consommation
en paquet-année) et effet de l’âge, sur la fréquence de granulocytes GPI-déficients
Test du micronoyau
Effet de la radiothérapie sur le TCMN
Effet de la chimiothérapie avant le premier prélèvement sur le TCMN
Effet du tabac (comparaison des fumeurs et non-fumeurs et relation avec la consommation
en paquet-année) et effet de l’âge, sur le TCMN
DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ABREVIATIONS
