Test d’activité antidrépanocytaire ou antifalcémiante

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Chromatographie sur colonne de gel de silice

Toute chromatographie sur colonne est préalablement inspirée d‟une chromatographie sur couche mince analytique. Cette dernière permet de déterminer le système de solvant pour la migration des composants de l‟extrait à fractionner. Deux types de chromatographie sur colonne, par voie sèche ou humide sont possibles mais dans tous nos travaux de recherche entrepris, la deuxième s‟est avérée plus efficace car d‟une part l‟adsorbant (phase fixe) est d‟abord mélangé au système d‟éluant choisi (phase mobile) jusqu‟à l‟obtention d‟une bouillie bien homogène mais d‟autre part, une fois le tout transvasé dans une colonne, le gel de silice (SiO2) a le temps de se stabiliser par élution du volume mort de la colonne.

Le choix du gel de silice se porte sur sa qualité de fixer les substances polaires, tout en retenant les composés à caractère basique. Quant au gel de séphadex, il est utilisé lors que la séparation est basée sur le poids moléculaire et la structure chimique des composés à faire migrer, jouant ainsi le rôle d‟un tamis moléculaire.
La chromatographie d‟adsorption ou chromatographie liquide-solide met à profit la propriété que possèdent certaines substances en solution d‟être retenues par la surface d‟une phase stationnaire très finement divisée appelée adsorbant.
Cette méthode s‟applique à la plupart des composés organiques de poids moléculaires inférieurs à 1 000 et ceci d‟autant mieux que ces poids sont plus élevés.
Le phénomène ou les procédés utilisés varient selon les types de méthodes choisies, mais, toutes celles-ci ont en commun un certain nombre de principes.
Les composés se répartissent dans deux phases non ou très peu miscibles jusqu‟à l‟établissement d‟un équilibre. Cette partition dépend des propriétés de chaque composé vis-à-vis des phases considérées. Le renouvellement continu de la phase mobile remet en cause cet équilibre et entraîne par une succession d‟autres équilibres, la migration des substances tout au long de la phase stationnaire.
La séparation des différents composés tient au fait que chaque constituant migre avec une vitesse qui lui est propre.
La solution dans laquelle la substance se trouve est déposée au sommet de la colonne. Toute adjonction provoque par gravitation un déplacement de la phase mobile le long de la colonne.

Ceci est constamment renouvelé et la collecte progressive en bas de colonne de cette phase mobile permet de faire une CCM de tous les volumes collectés afin de pouvoir rassembler les fractions ayant les mêmes composants.
La phase stationnaire que nous avons toujours utilisée est le gel de silice qui fonctionne comme une surface d‟adsorption ou comme support de liquide car il permet la séparation des substances acides ou neutres, traité par la soude il se prête à la séparation des alcaloïdes. L‟alumine convient préférentiellement aux composés basiques.
Les fractions ainsi obtenues peuvent être sous-fractionnées toujours par chromatographie sur colonne jusqu‟à l‟isolement et la purification d‟un constituant ou d‟une molécule.

Chromatographie sur couche mince (CCM)

Le principe de la chromatographie sur couche mince est analogue à celle de la chromatographie sur colonne sauf que la phase fixe est étalée sur un support solide (une plaque d‟aluminium, de plastique ou de verre) formant ainsi une couche mince. Si la chromatographie sur colonne est descendante, la chromatographie sur couche mince, elle est ascendante. L‟éluant migre par capillarité et entraîne avec lui le ou les composés qui ont une affinité pour lui.
Une bonne séparation ou résolution est obtenue en conjuguant judicieusement l‟adsorption sur la phase fixe qui est le gel de silice, son épaisseur pour que ce soit vraiment une chromatographie sur couche mince et la phase mobile qui est le système de solvant choisi pour l‟élution.
Une CCM faite sur une épaisseur de 0,1 mm à 0,3 mm de gel de silice permet de détecter les composés de l‟extrait à chromatographier. Avec ou sans réactifs révélateurs, visibles à l‟œil nu ou sous UV, la visibilité de spots plus ou moins colorés, mats ou fluorescents est indicative par rapport à la présence de molécules. Plus les spots sont distancés les uns des autres, plus la résolution est bonne. C‟est ce qu‟on appelle une chromatographie sur couche mince analytique.
Quant aux solvants de migration, il s‟agit de solvants organiques plus ou moins hydratés dont la nature dépend des substances à séparer. Ils sont parfois additionnés d‟acides ou de bases (acide acétique, ammoniaque) pour désactiver les phases stationnaires et éviter les traînées liées à l‟ionisation des substances.

Une chromatographie sur couche mince est qualifiée de préparative si elle est faite sur une couche de gel de silice de 1 à 2 mm d‟épaisseur. L‟extrait à chromatographier est déposé en formant une bande épaisse continue, à 2 cm du bord inférieur de la plaque pour éviter les effets de bord.
En un temps plus court et pour une quantité moins importante que celle utilisée lors d‟une chromatographie sur colonne, elle est réalisable. La migration se fait ainsi par bandes et l‟étape finale est de les racler, bande par bande, et d‟en extraire les composants.
Grâce aux CCM préparatives, si petite soit la quantité recueillie, cette étape permet de préparer une quantité de quelques milligrammes d‟extrait nécessaire à la détermination structurale de molécule.

Chromatographie sur colonne de séphadex

La séparation chromatographique des molécules de tailles différentes, en se fondant sur leur possibilité de pénétrer ou de ne pas pénétrer à l‟intérieur des phases stationnaires, était connue depuis longtemps.
Il a cependant fallu attendre 1959 que Porah et Flodin proposent l‟utilisation d‟un gel de dextrane (commercialisé sous le nom de Sephadex) artificiellement réticulé pour que cette chromatographie par tamisage prenne l‟extension que l‟on connaît.
D‟abord réservée à la séparation des protéines et polypeptides en biochimie, avec le développement de la nature des phases stationnaires, elle est devenue une méthode d‟analyse générale permettant d‟effectuer non seulement la séparation mais également la purification et l‟analyse de mélange complexe.
Cette méthode repose sur le comportement dissemblable de molécules de volumes différents, vis-à-vis des grains poreux d‟une phase stationnaire constituée par un gel : les molécules diffusent à l‟intérieur des grains du gel ou en sont exclues.
Contrairement aux autres méthodes chromatographiques, elle est pratiquement indépendante de la nature des solvants.

Le matériel servant de base à cette séparation est un gel, c’est-à-dire un milieu d‟aspect homogène formé par deux phases : une phase dispersée qui est la substance solide constituant le substrat du gel et une phase dispersante qui est le solvant.
Mis en leur présence, le solvant pénètre à l‟intérieur de chaque particule et provoque leur gonflement. Si dans ce solvant des substances sont dissoutes, celles dont les molécules sont de dimensions inférieures aux diamètres des mailles du réseau diffusent à l‟intérieur des grains de ce gel, alors que les molécules plus volumineuses restent à l‟extérieur.
Les plus petites diffusent et se répartissent entre les phases intra et extra-granulaires dans des proportions qui ne dépendent que de leur nature et de celle du gel.
L‟éluant entraîne en premier lieu les grosses molécules qui restent dans le liquide extra-granulaire, alors que les petites qui doivent diffuser sont ralenties. La poursuite de l‟élution accentue leur séparation et l‟ordre de sortie à l‟extrémité de la colonne est fonction de leur taille.
La capacité de gonflement d‟un gel sert souvent à caractériser sa porosité : c‟est la quantité de solvant capable d‟être adsorbée par gramme de gel sec. Elle s‟exprime par un chiffre d‟autant plus élevé que les mailles sont plus grandes.
Ces gels permettent d‟obtenir la séparation de molécules dont les poids moléculaires vont de 700 à 800 000.

La complémentarité de la phytochimie et de la botanique

Le Maba sp est une plante utilisée par les guérisseurs du sud de Madagascar, seulement n‟ayant pas pu être renseigné en botanique de manière précise à quelle famille elle appartenait, il a été préférable de juste faire la chimie et de tester l‟extrait sur une batterie de souches de l‟IMRA. D‟autre part, aucune information sur le net n‟a été trouvée par rapport au genre Maba.
Une molécule cytotoxique a été isolée et en collaboration avec d‟autre laboratoire, la détermination structurale a révélé il s‟agit d‟une isodiospyrine. Ce Maba sp a donc contenu un isodiospyrine comme les Diospyros [1] [2] [3] [4]. Ces résultats de recherches chimique et pharmacologique confirmeraient-ils l‟identification botanique selon Mary Susan Taylor de Missouri Botanical Garden dans « Flora Ethnobotany of Madagascar » en 1991, mentionné aussi par son confrère George Schatz en 2001 dans « Flore générique des arbres de Madagascar » comme quoi le genre Maba est le même que le genre Diospyros, si en 1952 Perrier de la Bâthie les a décrits différemment dans le livre « Flore de Madagascar ». Capuron (Mars 1957) l‟a aussi redit dans « Introduction à l‟étude de la Flore Forestière de Madagascar » que « Perrier de la Bâthie a montré que, pour les espèces malgaches, la distinction des Maba et des Diospyros était des plus artificielles. Plus récemment, des auteurs anglais, étudiant des espèces africaines, ont réuni les deux genres ».

HARMACOLOGIE ETHODES ET ROTOCOLES

LES TESTS BIOLOGIQUES

Les tests biologiques en tandem avec la chimie permettent non seulement de cibler les molécules actives mais ont aussi pour objectif de mieux cerner l‟étude de la plante et surtout de ses paramètres pharmacologiques.
Dans la médecine traditionnelle malgache, à partir des enquêtes menées auprès des guérisseurs et des tradipraticiens, les plantes ayant un goût amer sont en général utilisées pour soigner le tazo, le paludisme. Cependant ceci a coïncidé aux plantes contenant des molécules de la famille des alcaloïdes. Ainsi un screening phytochimique commence toujours les travaux de recherche selon la disponibilité qu‟on a en réactif, toutefois le screening d‟alcaloïdes nous est devenu systématique.

Culture in vitro du parasite du paludisme

Le Plasmodium falciparum FCM 29/Cameroun a été la souche de paludisme sur laquelle nous avons travaillée. Son cycle biologique est de 48 heures et son cycle de développement peut être divisé en trois stades : les rings, les trophozoïtes et les schizontes. La souche a été mise en culture in vitro dans des flasks contenant du milieu de culture liquide (le RPMI défini par Roswell Park Medium Institute) additionné de sérum humain et de globules rouges et incubé à 37°C dans un caisson de Wolf hermétiquement fermé où la composition gazeuse finale de 90% d‟azote, 5% d‟oxygène, 5% de gaz carbonique a été obtenue par la méthode de bougie allumée (candle jar) selon la méthode de culture continue décrite par Trager et Jensen. [34]
Un renouvellement du milieu et un frottis sanguin de contrôle (paramètre permettant de suivre la croissance des parasites, et exprimé en pourcentage de nombre de globules rouges infestés) ont été effectués quotidiennement.

On commence les tests de chimiosensibilité au moment où les formes ring sont prédominantes. Pour suivre la croissance du Plasmodium falciparum, il faut fournir à ce parasite un corps radiomarqué qui sera incorporé dans son ADN au cours de la schizogonie. En effet, la radioactivité enregistrée est proportionnelle à la multiplication du parasite : plus il y a de radioactivité enregistrée, plus il y a de parasites.
Pour évaluer cette activité intrinsèque, le protocole proposé par Le Bras et Deloron a été suivi : c‟est le semi-microtest isotopique qui consiste à mettre les parasites en culture asynchrone mais avec prédominance des formes ring, dans des cupules recevant une quantité identique de suspension parasitaire de 2,5% d‟hématocrite contenant 1% de globules rouges infestés. Le test s‟étend sur trois jours. [8] [20]
Les résultats obtenus sont exprimés par :
– le pourcentage d‟inhibition (%I) de la croissance du parasite dans les cupules traitées par les différentes concentrations d‟alcaloïdes par rapport à celui des parasites dans les cupules non traitées
– l‟activité intrinsèque des extraits a été évaluée par les concentrations inhibitrices 50% et 90% (CI50/CI90)

Test de cytotoxicité

Il consiste à mettre les cellules en culture en présence d‟un extrait de produit à concentration connue. Le taux de survie cellulaire ou le pourcentage d‟inhibition de la prolifération cellulaire est ensuite évalué afin de déterminer la valeur de la CI50. L‟activité cytotoxique partielle des produits est caractérisée par la valeur de sa CI50. [2] [8] [9]
Les souches des cellules P388 conservées sous forme de cryostabilisat dans l‟azote liquide à – 196°C sont décongelées à 37°C. Les cellules ont été lavées avec une quantité de milieu RPMI. Elles ont été dispersées par pipetage répétés, ensuite centrifugées pendant 5 mn à 120 tours/mn. Après avoir éliminé le surnageant, le culot cellulaire a été récupéré dans un nouveau milieu complet et mis en culture dans des flacons stériles de 75 cm2.

Les flacons sont incubés dans un incubateur à 5% de CO2 à la température de 37°C. La croissance cellulaire est surveillée quotidiennement évaluant le facteur multiplicatif (F) en fonction du temps. Lorsque la phase stationnaire de la croissance cellulaire est atteinte, les cellules en cultures sont en confluences. L‟observation microscopique est nécessaire pour préciser la concentration cellulaire dans le flacon de culture. 50 µl de suspension cellulaire ont été ajoutés avec 50 µl de bleu de trypan et étalés sur une lame de Thomas (10-4 ml). La numération cellulaire a été immédiatement faite au microscope optique de grossissement x 10. Dans une microplaque de 96 puits à fond rond, les puits sont répartis en puits essai, témoin négatif, témoin positif et blanc dont les compositions sont les suivantes :
– Essai : 100µl de produit + 100µl de suspension cellulaire
– Contrôle du témoin négatif : 100µl de iRPMI à 1% DMSO + 100µl de suspension cellulaire
– Témoin positif : 100µl de Camptothécine + 100µl de suspension cellulaire
– Blanc : 200µl de iRPMI.
Le volume final des solutions dans chaque puits est à 200µl dont 100µl fixés à la suspension cellulaire à 200 000 cellules/ml soit 20 000 cellules/puits. La concentration finale du produit à tester est de 10µl/ml avec 0,5% de DMSO après addition d‟un volume égal de 100µl de suspension cellulaire. Le test est réalisé en triple.
Les microplaques sont ensuite incubées à 37°C et 5% de CO2 pendant 72 heures, puis après sont centrifugées à 1 200 tours/mn pendant 5 mn. Les surnageants sont aspirés puis 100µl de rouge neutre sont ajoutés dans chaque puits. Uniquement les cellules vivantes incorporent le rouge neutre et absorbent à 540 nm. La valeur de la densité optique est donc proportionnelle au nombre de cellules vivantes contenues dans chaque puits.
Ensuite, à 37°C les microplaques sont ré-incubées pendant 60 mn. La même opération est répétée en remplaçant le rouge neutre par le PBS puis par le lauryl sulfate mais sans plus incuber.

Ces dernières sont agitées pendant 10 mn et les densités optiques (DO) de chaque puits sont mesurées à la lumière UV à l‟aide d‟un spectrophotomètre à la longueur d‟onde de 540 nm.
La détermination du pourcentage d‟inhibition (% I) et la survie cellulaire sont données comme suit :
Une courbe est tracée à partir de la viabilité cellulaire ou du pourcentage d‟inhibition en fonction de la concentration du produit testé. La CI50 est obtenue par projection de cette courbe.

Test d’activité antimicrobienne

Toutes les manipulations se déroulent dans un environnement stérile, sous une hotte à flux laminaire et à environ 15 à 20 cm de la flamme d‟un bec Bunsen.
Les bactéries indicatrices utilisées sont des bactéries à Gram positif dont le Bacillus subtilus, le Staphylococus aureus et le Staphylococus foecalis. Les bactéries à Gram négatif sont le Pseudomonas aeruginosa coli, l‟Escherichia coli et le Salmonella typhii. Le champignon indicateur est le Candida albicans.
Les milieux de culture liquides sont le bouillon de Muller Hinton (MHB) pour les bactéries et le bouillon de Sabouraud (SAB) pour le Candida albicans, tandis que les milieux solides sont respectivement du Muller Hinton gélosé (MHA) et du Sabouraud gélosé (SA). [16] [17]

Rajeunissement des souches

Pour chaque souche 2 à 3 colonies ont été prélevées à l‟aide d‟une anse préalablement stérilisée à la flamme de bec Bunsen et mise dans un tube contenant quelque microlitre d‟eau distillée stérile, puis agitées. Une goutte a été prélevée puis ensemencée en stries serrées sur milieu solide MHA et SA dans des boîtes de Pétri. Ces dernières ont été incubées à 37°C pendant 24 heures.

Préparation de l’inoculum

A partir des souches jeunes préparées, 2 à 5 colonies pour chaque souche ont été prélevées et mises dans 25 ml de MHB. Ces dernières ont été également incubées à 37°C pendant 24 heures.
Quelques microlitres de la suspension microbienne préparée ont été prélevés puis dilués dans 3,5 ml de MHB dans un tube à essai. La turbidité de la suspension microbienne a été mesurée à l‟aide d‟un densicheck jusqu‟à avoir environ 0,5 Mcf correspondant à 10 8 ufc/ml de bactéries ou de 10 7 ufc/ml de levures. Des dilutions successives ont été effectuées jusqu‟à l‟obtention de 10 6 ufc/ml de germes qui constituent l‟inoculum pour chaque test.

Méthode des disques

La méthode de diffusion sur gélose ou méthode de disque consiste à imbiber les disques par les produits à tester puis de les mettre en contact avec les cultures microbiennes sur gélose. La diffusion de ces produits sur ce milieu peut inhiber ou non la croissance microbienne. La présence de zone claire autour du disque dite zone ou halo d‟inhibition montre la sensibilité du germe.

Méthode de microdilution

La méthode de microdilution est surtout utilisée pour la détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) d‟un produit actif lors de la méthode de diffusion sur gélose.
Elle permet de suivre et de comparer la croissance normale des germes pathogènes utilisés et celle en présence du produit à tester.
Elle consiste à faire croître dans une microorganismes indicateurs (environ 10 microplaque à 96 puits un nombre connu de 6 ufc/ml) dans une quantité donnée de milieu de culture liquide et en présence ou non d‟une série de concentrations de produits à tester (dilution successive de raison 2) avec leurs témoins. La croissance des germes est observée avec un lecteur de densité optique à la lumière de longueur d‟onde 630 nm. [1]

Test d’activité pharmacodynamique

Préparation d’anneau d’aorte isolé de rat

Les expériences ont été réalisées sur des fragments d’aorte de rats de souche Wistar. Les rats ont été tués par dislocation cervicale et ensuite saignés par transaction de l’artère de la carotide. Des aortes thoraciques de rats ont été rapidement et soigneusement disséquées et placées dans une solution de Krebs-Henseleit composé en mM par : NaCl (112) , KCl (5) , NaHCO3 (25) , MgSO4 ( 1,2 ) , KH2PO4 ( 1,2 ) , glucose ( 11,5 ) , CaCl2 ( 1,25 ) . L‟aorte thoracique a été nettoyée en le débarrassant des tissus adipeux et conjonctif et a été coupée en anneaux de 5 mm (longueur). [7] [15]

Toutes les procédures de dissection ont été réalisées avec un soin extrême pour protéger l’endothélium de tout dommage.
Afin d’étudier les réponses de l’endothélium vasculaire indépendant, certains anneaux ont été frottés intentionnellement sur la surface interne avec un coton-tige mince pour retirer l’endothélium. Ces anneaux sont placés dans une chambre de bain d’organe à double enveloppe d’une capacité de 20 ml en verre de borosilicate, et montés sur deux petits crochets en acier inoxydable. Le fragment d’aorte ainsi préparé a été fixé par une de ses extrémités à la base de la cuve à organe isolé et par l’autre extrémité à un transducteur isométrique.
Le bain d’organe a été rempli avec une solution de Krebs-Henseleit maintenue à 37 ° C et gazé avec un mélange de 5 % de CO2 et 95 % d‟O2.
Les anneaux ont été laissés s’équilibrer pendant 1 heure sous une tension de repos de 1 g à l’aide d‟un micromanipulateur jusqu’à ce qu’une force constante de base ait été établie. Pendant ce temps, le milieu du bain a été changé toutes les 15 minutes.

Table des matières

INTRODUCTION
1er OLET HIMIE – ETHODES ET ROTOCOLES
Chapitre 1 : EXTRACTION DES CONSTITUANTS CHIMIQUES
I – Extraction par solvant
1 – Extraction hydroalcoolique suivie de plusieurs chromatographies de partage
2 – Extraction par polarité ascendante de solvant
3 – Méthode utilisée pour l’extraction des alcaloïdes
II – Fractionnement et isolement de molécules à activité biologique
ABLE DES MATIERES (SUITE)
1 – Chromatographie sur colonne de gel de silice
2 – Chromatographie sur couche mince (CCM)
3 – Chromatographie sur colonne de séphadex
ESULTATS DE HIMIE
I – Des molécules nouvelles découvertes
II – La complémentarité de la phytochimie et de la botanique
2ème OLET : HARMACOLOGIE – ETHODES ET ROTOCOLES
Chapitre 2 : LES TESTS BIOLOGIQUES
I – Culture in vitro du parasite du paludisme
II – Test de cytotoxicité
III – Test d’activité antimicrobienne
1 – Rajeunissement des souches
2 – Préparation de l’inoculum
3 – Méthode des disques
4 – Méthode de microdilution
IV – Test d’activité pharmacodynamique
1 – Préparation d’anneau d’aorte isolé de rat
2 – Enregistrement de la tension
V – Test d’activité antidrépanocytaire ou antifalcémiante
1 – Matériel biologique
2 – Test antifalcémiant (antidrépanocytaire)
a – Test d’Emmel
b – Evaluation du profil Fe+++/Fe++
VI – Test d’activité antioxydante
1 – Réaction entre le radical libre DPPH• et
l’antioxydant
2 – Evaluation du potentiel anti-radicalaire
3 – Activité anti-radicalaire par le test au DPPH•
4 – Courbe d’étalonnage de la solution du DPPH•
ABLE DES MATIERES (SUITE) ESULTATS ET ISCUSSIONS DE LA HARMACOLOGIE
I – Les publications
II – Confirmation des usages de tradimédicaments
III – Bilan des Résultats de recherches
3ème OLET : THNOBOTANIQUE ET AUVEGARDE DE L’ NVIRONNEMENT – ETHODES ET ROTOCOLES
Chapitre 3 – ETUDE ETHNOBOTANIQUE ET ECOLOGIQUE
I – Enquête ethnobotanique
II – L’environnement
ESULTATS DE L’ THNOBOTANIQUE ET AUVEGARDE DE L’ NVIRONNEMENT
I – Les Publications
II – Inventaires de plantes utilisées en médecine traditionnelle
ISCUSSION DES TRADIMEDICAMENTS VERS DES PHYTOMEDICAMENTS
I – Le paludisme
II – Le cancer
III – Les infections bactériennes
IV – L’hypertension artérielle
V – La drépanocytose
VI – Les antioxydants
ENSEIGNEMENT – ENCADREMENT
I – La méthodologie de la recherche: Modes d’investigation
II – L’enseignement proprement dit
1 – Pédagogie – Didactique
ABLE DES MATIERES (SUITE)
2 – L’enseignant
3 – L’apprenant
4 – L’encadrement
III – Enseignement de la langue française, outil de communication
ONCLUSION ET ERSPECTIVE
IBLIOGRAPHIE

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