TECHNIQUES D’ECHANTILLONNAGE ET D’ANALYSE DES MOISISSURES DE L’ENVIRONNEMENT

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Colonisation des supports par les moisissures

Phases du développement fongique

La croissance fongique sur les matériaux de construction commence toujours par le dépôt à leur surface de spores fongiques souvent aéroportées de l’extérieur ou, moins fréquemment, de fragments d’hyphes. Ces derniers peuvent survivre dans l’air de quelques heures à quelques jours tandis que les spores sont, des structures très résistantes qui peuvent survivre de quelques jours à quelques mois. Les structures fongiques présentes dans l’air finissent par se déposer sur des surfaces horizontales ou même verticales. Elles peuvent également se déposer dans les systèmes de ventilation ou sur les tapis ou encore être déplacées vers d’autres surfaces de matériaux de construction lors de mouvements d’air importants [16].

Facteurs d’influence

Plusieurs facteurs peuvent influencerla colonisation des supports par les moisissures [17,18].
 L’humidité
L’humidité est le facteur essentiel nécessaire à la prolifération fongique. La teneur en eau de l’air participe à l’humidité des matériaux, elle peut être évaluée. On peut définir et mesurer la disponibilité en eau ou Aw, des différents matériaux. Les sources d’humidité peuvent être classées en trois catégories :
– eau issue du sol des fondations pour laquelle trois origines sont soupçonnées :
o nappe phréatique
o eaux d’infiltration
o fuite des canalisations enterrées
– eau en élévation (ou hors sol) qui peut avoir trois origines :
o eau de construction
o intempéries
o canalisations avec les fuites
– eau de l’air, les condensations
 Eléments nutritifs
La majorité des moisissures sont peu exigeantes quant aux éléments nutritifs nécessaires à leur croissance. En effet, leur contenu enzymatique leur permet de se servir des matières organiques retrouvées dans les matériaux de construction pour croître. Les produits cellulosiques tels que le carton, le papier et le placoplâtre constituent d’excellents supports à leur croissance. Plusieurs moisissures peuvent aussi vivre sur les fibres naturelles et synthétiques, des tapis et des peintures. Il est même possible de rencontrer des moisissures croissant sur des murs et des plafonds recouverts de peinture à base d’eau (peinture au latex) ainsi que sur des moulures autour des fenêtres recouvertes d’une peinture luisante. En plus des matériaux de construction, d’autres sources de prolifération de moisissures peuvent exister à l’intérieur des bâtiments tels les cartons ondulés, les plantes empotées, les textiles, les cuirs et les fourrures ainsi que tout aliment entreposé. Enfin, tout amas de matière végétale ou de poussière organique peut supporter la croissance des champignons [16].

Techniques d’échantillonnage et d’analyse des moisissures de l’environnement

Technique d’échantillonnage

La mesure des moisissures présentes dans les domiciles, sur les lieux de travail ou dans l’air extérieur est pratiquée depuis près de cinq décennies. Les méthodes d’échantillonnage notamment  de l’aérobiocontamination ont évolué depuis les premiers biocollecteurs [20,21,22].

Dans l’air

Les techniques de recueil ont pour objet de séparer les particules du flux d’air pour les recueillir sur un ou plusieurs milieux sélectionnés [23].
Les quatre méthodes utilisées sont la sédimentation, l’impaction (sur support adhésif ou sur milieu de culture solide en boite de Pétri, l’impaction en milieu liquide), la filtration et la précipitation électrostatique [24]

Sédimentation

C’est une technique ancienne qui a été très répandue et a constitué une approche simple de l’aérocontamination. Cette technique consiste à exposer de façon passive un support nutritif ou non (boite de Pétri, plexiglas, gel) à la chute naturelle des spores sous l’effet de la gravitation. Outre les avantages liés à un coût faible, à l’absence d’appareillage, cette technique permet d’exposer les supports pendant des durées importantes dans la limite toutefois de la dessiccation des gels et des milieux. Cependant le volume d’air ainsi traité n’est pas mesurable et dépend largement des flux au sein de l’espace échantillonné. Les inconvénients principaux de cette méthode sont liés à la remise en suspension des spores les plus petites favorisant la sélection des spores les plus volumineuses. La reproductibilité de ce type d’échantillonnage est faible [25].

Impaction

Dans les impacteurs (Figure 3) l’air est brusquement accéléré par passage au travers d’une section réduite et brutalement dévié par une surface de collection solide (gélose ou surface adhésive) ou liquide. Les particules selon leur inertie vont, soit suivre les lignes de courant, soit s’impacter sur la surface de collection pour celles possédant l’inertie la plus importante.
L’impaction dépend de plusieurs facteurs tels que la taille, la densité et la vélocité initiale des particules ainsi que des paramètres physiques du dispositif de collecte (dimension de la buse, débit du gaz porteur, distance entre la buse et la surface de collection) [26].
L’efficacité physique de ces biocollecteurs peut être figurée par le diamètre de coupure d50 qui correspond au diamètre aérodynamique des particules à partir duquel toutes les particules de diamètre supérieur sont théoriquement collectées.

Précipitateurélectrostatique

En 2002, Willeke développe un précipitateur électrostatique adapté à la collecte des microorganismes aéroportés [30].
La collecte des particules repose alors sur leurs charges électriques, qu’elles soient produites naturellement ou artificiellement. Dans un précipitateur électrostatique conventionnel, l’aérosol, une fois chargé grâce à un ioniseur d’air, est soumis à un champ électrostatique. Les particules, par passage au travers d’un champ électrostatique, vont, selon leur charge, suivre ou quitter le flux d’air porteur et venir s’impacter sur une surface de collection.

Les prélèvements de surface

L’aérosolisation des spores de moisissures dépend de plusieurs facteurs tels que la « viscosité » de leur paroi. Ainsi des spores de Stachybotrys ou de Fusarium dites visqueuses auront davantage de difficultés à être décrochées de leur support que des spores de Penicillium ou d’Aspergillus dites sèches. Plusieurs techniques de prélèvement de surface existent.

Adhésif

Sur les surfaces planes et non humides un support adhésif est appliqué. Les spores adhérent à la surface et peuvent être soit transférées sur un milieu de culture, soit être dénombrées et identifiées directement au microscope.

Boites et lames « contact »

Le milieu nutritif est contenu dans une boite de Pétri particulière (boite « contact ») qui permet de couler le milieu sous forme d’une surface en léger ménisque, afin que celle-ci puisse être en contact avec la surface à prélever. Après l’échantillonnage, la surface de gélose est protégée par un couvercle qui ne vient pas en contact avec la gélose. Le prélèvement est
standardisable en durée et en terme de pression appliquée. Les valeurs communément utilisées sont une pression de 25g par cm2 pendant 10 secondes.

Ecouvillonnage

L’écouvillonnage, avec un écouvillon stérile humidifié ou non, d’une surface de 25 cm2 est considéré comme équivalent au prélèvement par boite contact à condition de décharger l’écouvillon en étoile sur une boite de Pétri de diamètre 9 cm.

Les substrats

Les substrats peuvent être source de contamination et refléter une pollution ambiante. Des analyses de substrats ont montré la présence de Stachybotrys chartarum, alors que cette espèce n’était pas ou était peu retrouvée dans l’air [31].

Les poussières domestiques

Les particules sont généralement collectées à l’aide d’un aspirateur puissant équipé d’un filtre absolu (protection des personnes), soit dans un sac neuf, soit dans un cornet en textile nylon d’un tissage très dense placé dans le manche de l’aspirateur. Ce prélèvement est standardisé : l’aspiration des surfaces est réalisée à raison de 2 minutes par m2. Après détermination de la masse de poussières, l’échantillon est dilué en série et ensemencé.

Les revêtements

Les échantillons (tapisserie, jutes, plâtre, moquette…) sont prélevés stérilement, pesés et lavés avec une solution d’eau physiologique additionnée d’un agent mouillant (0,1 % de Tween 80). Les dilutions sont ensemencées sur les milieux appropriés.

Techniques analytiques

Avec le progrès des techniques microbiologiques, les moisissures ne sont plus seulement dénombrées au microscope ou après culture, mais aussi comptabilisées au moyen de techniques biochimiques, immunologiques et moléculaires.

Culture

Il existe plusieurs milieux de culture pour une même famille de champignons. Certains genres ont des besoins nutritifs spécifiques (cellulosiques, osmophiles) ou des conditions d’incubations spécifiques (thermophiles, psychrophiles) [32,33].
Les milieux les plus utilisés sont :
– Milieu à l’extrait de malt (Malt Extract Agar ou MEA) ;
– Milieu Rose Bengale : ce milieu inhibe la croissance des espèces à croissance rapide et les colonies restent plus petites donc plus facilement dénombrables. ;
– Milieu DG18 (dichloranglycerol 18) : ce milieu est adapté aux champignons xérophiles [34,35] ;
– Milieu Sabouraud : classiquement utilisé pour la recherche de champignons en clinique.
Les températures d’incubation varient entre 25 et 30°C pour les flores fongiques globales, 35-42°C pour les espèces thermotolérantes d’Aspergillus [14].
La durée d’incubation est comprise entre 7 et 14 jours avec une lecture à 3 jours puis une surveillance régulière de la croissance pour éviter l’envahissement des boîtes par certaines espèces.

Le comptage microscopique

Microscope photonique

Des lames ou filtres peuvent être observés au microscope photonique pour dénombrer les spores totales (viables et non viables). Toutefois une mauvaise répartition des spores peut induire des erreurs de comptage. Le pouvoir de différenciation de cette technique est faible, les spores de Penicillium et d’Aspergillus ne peuvent pas être distinguées [20].

La microscopie électronique à balayage (Scanning Electron Microscopy ou SEM)

La microscopie électronique à balayage utilise un faisceau d’électrons et permet un grossissement allant de 50 à 300 000, ce qui permet de distinguer des structures inférieures à 0,2 μm. Les images apparaissent en trois dimensions et permettent de visualiser les micro-organismes et leur structure.
Cette méthode est utilisée pour l’étude des spores fongiques et d’actinomycètes prélevés par filtration. L’identification de certaines espèces est possible par la visualisation de détails morphologiques, mais des spores d’espèces différentes peuvent avoir le même aspect. Une identification de toutes les espèces présentes nécessite donc l’association d’une méthode par culture [36,37].

Méthodes d’identification des champignons de la flore aérienne du laboratoire

Méthode d’échantillonnage

Les prélèvements ont été réalisés par la technique de la sédimentation qui permet de recueillir les spores de l’air ambiant.
Une boite de Pétri de diamètre 120mm contenant le milieu de Sabouraud-Chloramphénicol a été déposée pendant une heure au niveau des différents sites de prélèvement : la salle de prélèvement, la salle de manipulation, dans le réfrigérateur à 4°Cet les étuves (25° et 37°C).

Culture

Après échantillonnage, les milieux de culture ont été incubés à l’étuve (25°C à 28°C) pendant au maximum sept jours. Une observation a été faite dès la 48h avec une surveillance régulière jusqu’à sept jours.
Une boite contrôle non ouverte de la même série a été en même temps incubée pour servir de témoin de stérilité des milieux de culture utilisés lors des prélèvements.

Identification

 Préparation des cultures
Les colonies filamenteuses sont prélevées par la technique du drapeau. Un morceau de cellophane adhésive (Scotch ®) a été collé à une de ses extrémités sur un ose ou une baguette de verre et appliquée sur la surface de la culture à étudier.
Il a été ensuite examiné entre lame et lamelle dans une goutte de bleu de lactophénol.
Les colonies levuriformes ont été mises en suspension dans l’eau physiologique avant d’être montées entre lame et lamelle.
 Identification
L’identification des champignons a été basée sur leurs caractères culturaux, macroscopiques et microscopiques.
 Acremonium
 Caractères culturaux
La colonie varie du blanc au rose orangé (figure 5a). La température optimale de croissance varie entre 25°C à 37°C, et la croissance est restreinte.
 Morphologie microscopique
Le thalle végétatif est constitué de filaments septés, isolés ou disposés parallèlement les uns aux autres.
Sur les phialides naissent directement des filaments végétatifs. Elles sont fines et cylindriques, plus étroites à l’extrémité apicalequ’à la base (phialidesacirculaires). Elles sont solitaires, plus rarement groupées en 2 ou 3.
Les conidies cylindriques ou elliptiques (3,5μm de long sur 1à 2μm de large) sont regroupées en amas à l’extrémité des phialides. Elles sont généralement unicellulaires (parfois bicellulaires) et hyalines (figure 5b).

Exploitation des résultats

Nous avons utilisé Microsoft® Excel 2007 pour la saisie des données et une analyse statistique n’a pas été nécessaire. Seuls des calculs de fréquence ont été réalisés.

Champignons isolés

Durant les quatre mois, 15 échantillons ont été recueillis sur les cinq compartiments (salle de prélèvement, salle de manipulation, réfrigérateur 4°C, étuves 25°C et 37°C). Nous avons ainsi isolé, 18 espèces de champignons appartenant à 13 genres répartis en trois groupes (TableauIII). Tous les échantillons prélevés dans les différents compartiments ont eu une culture positive soit un pourcentage de positivité de 100% (Figure 9).Les résultats du mois de Mai ont été éliminés suite à la contamination de la boite témoin.

DISCUSSION

L’émergence de nouveaux champignons en pathologie est devenue un problème de santé publique. Ces champignons qui étaient considérés comme des contaminants des cultures ou de l’environnement sont de plus en plus isolés chez les patients au laboratoire. Ce constat nous a poussé a mené cette étude sur la dynamique de la flore fongique du laboratoire de Parasitologie-Mycologie du CHU Le Dantec de Dakar (Sénégal). La détection des moisissures de l’environnement d’un laboratoire peut s’avérer particulièrement pertinente pour rechercher un lien entre les champignons isolés chez les patients et ceux de l’environnement du laboratoire de mycologie.
Le but de cette étude était de surveiller la flore fongique aérienne du laboratoire et d’identifier les différentes sources de contamination.
Les prélèvements ont été réalisés sur cinq compartiments : la salle de prélèvement, la salle de manipulation, le réfrigérateur à 4°C et les deux étuves (25°C et 37°C).
La technique de la sédimentation était utilisée pour tous les prélèvements réalisés. C’est une technique ancienne qui a été très répandue et a constitué une approche simple de l’aérocontamination. Mais elle est de moins en moins utilisée à cause de sa reproductibilité faible [51]. Cette technique même si elle est ancienne nous a permis d’avoir un pourcentage de positivité de 100%. Ce dernier est très élevé par rapport à ce qui a été trouvé dans une étude sur la dynamique de la colonisation fongique dans un nouveau laboratoire de mycologie médicale en France avec des appareils d’échantillonnage plus sensibles [7]. Les techniques les plus utilisées à l’heure actuelle sont l’impaction, la filtration, la précipitation électrostatique et la recherche de constituants du champignon [20,29].
Avec cette technique d’échantillonnage, nous avons isolé 18 espèces de champignons appartenant à 13 genres répartis en trois groupes (Hyalohyphomycètes, Phaéohyphomycètes et Blastomycètes). Les souches appartenant aux genres Aspergillus, Cladosporium, et Penicillium ont été les plus retrouvées comme dans d’autres études réalisées en France [52,53].
Selon la fréquence d’isolement, Cladosporium sp était la moisissure la plus retrouvée avec des fréquences d’isolement allant jusqu’à 100% dans certains compartiments (réfrigérateur, salle de manipulation, salle de prélèvement). Sa présence en milieu intérieur est facilitée par sa température de croissance qui varie de 3 à 28°C. Elle reste la moisissure la plus importante des logements humides et mal ventilés [54]. Ce champignon, souvent isolé de l’air ambiant, est de ce fait un fréquent contaminant de laboratoire[14].
Les champignons appartenant au genre Aspergillus ont été retrouvés dans tous les compartiments avec des fréquences plus élevées (66,66%) au niveau des étuves. Les différentes enquêtes aérodynamiques montrent que Aspergillus sp arrive au quatrième rang des spores fongiques de l’environnement [14].
Penicillium spp, très ubiquiste a été retrouvé partout sauf au niveau du réfrigérateur. C’est un contaminant fréquent de laboratoire. C’est un saprophyte très répandu dans l’environnement [14].
Certaines espèces comme Ulocladium spp., Fusarium sp., Mucorsp., Scopulariopsis spp., isolées dans l’étude de Diongue et al en 2014 au niveau des services à risque d’infection fongique du CHU Le Dantec n’ont pas été retrouvées dans notre étude [2].
Seules deux levures ont été isolées, Candida spp au niveau de la salle de prélèvement et Rhodotorulla à la salle de manipulation. Ces deux champignons ont été également isolés dans l’étude de Diongue et al, en 2014 [2].
Selon le nombre d’espèces isolées par compartiment, la salle de manipulation était la plus contaminée, suivie de la salle de prélèvement, du réfrigérateur, et des étuves 37°C et 25°C. Cela peut être expliqué par le fait que c’est dans cette partie du laboratoire que les cultures sont manipulées quotidiennement. Cette salle ne disposait pas de hotte au moment de l’étude, raison pour laquelle les spores de champignons présentes dans les milieux de culture pourraient être relarguées dans l’environnement du laboratoire.
Le réfrigérateur à 4°C dans lequel les milieux de culture sont conservés était plus contaminé que les étuves, sans doute lié au fait de l’humidité, qui est un facteur favorisant la multiplication des champignons en général et des moisissures en particulier [17,18]
Les levures et moisissures isolées durant la même période d’étude chez les patients venus au laboratoire pour un examen mycologique étaient Trichosporon, Eurotium amstelodami (Aspergillus du groupe glaucus), Cylindrocarpon (restauré comme des Fusarium en 2002 par Summerbell et Schoroers [55,56]), Candida et Fusarium. Parmi ces champignons, seuls Candida et Eurotium amstelodami ont été isolés de l’environnement du laboratoire et ne peuvent être considérés comme contaminant puisque les examens directs étaient positifs pour tous les prélèvements. L’incrimination d’une moisissure comme responsable d’une mycose nécessite l’isolement répétitif du champignon à partir de plusieurs prélèvements associée d’un examen direct positif [57]. Certaines moisissures isolées de l’environnement du laboratoire durant notre étude sont parfois agents de mycose comme Curvularia (agent de kératite, sinusites, pneumonie, endocardite, de mycétomes [58-61]), S. apiospermum (agent de mycétomes [62]), Hortaea werneckii (agent de piedra noir) [63] mais n’ont pas encore étaient isolés en situation pathogène dans notre laboratoire.

CONCLUSION

La présence des moisissures dans le milieu intérieur est devenue une préoccupation tant pour la population en général que le personnel de santé. Ces moisissures autrefois considérées comme flore de l’environnement ou contaminants des milieux de culture sont de plus en plus isolées en pathologie humaine. Le laboratoire de mycologie joue un rôle fondamental dans le diagnostic de ces infections fongiques à moisissures. Un lien peut être établi entre les moisissures isolées chez les patients et celles de l’environnement du laboratoire, raison pour laquelle nous avons mené une étude sur la surveillance de la flore fongique aérienne du laboratoire de Parasitologie et Mycologie de l’hôpital Aristide Le Dantec.
Cette étude s’est déroulée durant les mois de Mars, Avril, Mai et Juin 2015 au sein du laboratoire. Un prélèvement a été réalisé chaque mois dans chacun des compartiments impliqués dans la chaine du diagnostic mycologique (la salle de prélèvement, la salle de manipulation, le réfrigérateur à 4°C qui conserve les milieux de culture coulés en boites et les étuves de 25°C et 37°C).
La sédimentation sur boite de Pétri a été la technique d’échantillonnage utilisée. Le milieu de Sabouraud Chloramphénicol coulé en boite Pétri de diamètre 120mm a été ouvert pendant 1h au niveau des différents sites de prélèvement puis incubés entre 25 et 28°C pendant 7 jours au maximum en présence d’un milieu témoin.
Tous les échantillons prélevés dans les différents compartiments ont eu une culture positive soit un pourcentage de positivité de 100%.
Dix-huit (18) espèces de champignons appartenant à 13 genres répartis en trois groupes ont été isolées. Il s’agit de Penicillium spp, A. flavus, A. nudilans, A. versicolor, Cladosporium spp, Altenaria spp, Scedosporium apiospermum, Acremonium spp ,Aureobasidium spp, Curvilaria spp, Rhodotorulla spp, Candida spp, Trichoderma spp, Hortaea werneckii, Bipolaris spp, Aspergillus du groupe glaucus, A. niger, A.fumigatus.
Cladosporium, Aspergillus et Penicillium étaient les champignons les plus retrouvés avec des fréquences d’isolement allant jusqu’à 100% pour Cladosporium spp.
Les compartiments les plus contaminés en fonction du nombre de champignons isolés étaient par ordre décroissant : la salle de manipulation, suivie de la salle de prélèvement, du réfrigérateur, des étuves 37°C et 25°C.
Durant la période d’étude, 21 souches de moisissures et levures appartenant aux genres Candida, Fusarium, Cylindrocarpon, Eurotium et Trichosporon ont été isolées chez des patients venus au laboratoire pour un examen mycologique. Ces champignons ne pouvaient pas être considérés comme des contaminants parce que l’examen direct des prélèvements effectués chez ces patients était positif.
Pour réduire la prolifération des moisissures dans l’environnement intérieur du laboratoire, des stratégies ou mesures dont l’efficacité est reconnue doivent être appliquées. Elles consistent à :
– contrôler d’abord les sources à l’origine de leur croissance (l’humidité) : contrôle des locaux intérieurs et extérieurs : vérification régulière de l’étanchéité des toitures et ouvertures, canalisations, gouttières, localisation et traitement des fissures, infiltrations ;
– associer la surveillance de l’air à celle des surfaces qui sont des témoins de la sédimentation des spores fongiques ;
– manipuler toutes les cultures sous hotte afin de réduire la dispersion de spores fongiques dans l’environnement du laboratoire.
Pour mieux évaluer l’aérocontamination fongique au laboratoire, d’autres techniques de prélèvements plus standardisées (l’impaction ou la filtration) et d’identification (PCR, CLHP) doivent être utilisées. Il est possible également de génotyper les souches pour affirmer une réelle relation entre les moisissures de l’environnement et celles isolées en situation pathologique chez les patients.
Une étude sur les moisissures retrouvées directement dans les milieux de culture ensemencés à partir des prélèvements de patients serait très intéressante pour connaitre l’origine des contaminants des milieux de culture. Cela va permettre d’établir un rapport entre les moisissures de l’environnement du laboratoire et celles retrouvées dans les milieux de culture probablement provenant des environnements des patients.

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
1. DEFINITIONS
1.1. Définition de champignons
1.2. Définition de moisissure
2. CLASSIFICATION DES CHAMPIGNONS
3. COLONISATION DES SUPPORTS PAR LES MOISISSURES
3.1. Phases du développement fongique
3.2. Facteurs d’influence
4. PRINCIPALES MOISISSURES RETROUVEES DANS L’ENVIRONNEMENT INTERIEUR DES HOPITAUX
5. TECHNIQUES D’ECHANTILLONNAGE ET D’ANALYSE DES MOISISSURES DE L’ENVIRONNEMENT
5.1. Technique d’échantillonnage
5.1.1. Dans l’air
5.1.1.1. Sédimentation
5.1.1.2. Impaction
5.1.1.3. Filtration
5.1.1.4. Précipitateur électrostatique
5.1.2. Les prélèvements de surface
5.1.2.1. Adhésif
5.1.2.2. Boites et lames « contact »
5.1.2.3. Ecouvillonnage
5.1.3. Les substrats
5.1.3.1. Les poussières domestiques
5.1.3.2. Les revêtements
5.2. Techniques analytiques
5.2.1. Culture
5.2.2. Le comptage microscopique
5.2.2.1. Microscope photonique
5.2.2.2. Microscope à épifluorescence
5.2.2.3. La microscopieélectronique à balayage (Scanning Electron Microscopy ou SEM)
5.2.3. Autres méthodes
5.2.3.1. Dosage des composants d’origine fongique
5.2.3.2. Techniques de biologie moléculaire
6. DECONTAMINATION DES LOCAUX
DEUXIEME PARTIE
1. CADRE, TYPE ET PERIODE D’ETUDE
1.1. Type et Cadre d’étude
1.2. Période d’étude
2. MATERIELS ET METHODE
2.1. Matériels
2.2. Méthodes d’identification des champignons de la flore aérienne du laboratoire
2.2.1. Méthode d’échantillonnage
2.2.2. Culture
2.2.3. Identification
3. EXPLOITATION DES RESULTATS
3.1. Champignons isolés
3.2. Fréquence d’isolement de chaque espèce en fonction du compartiment
3.3. Principales sources de contamination en fonction du nombre de champignons isolés
3.4. Moisissures isolées chez les patients durant la période d’étude
2. DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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