Soutenance mémoire
TECHNIQUES DE PRELEVEMENT EN VU DU DIAGNOSTIC GENETIQUE PRENATAL
HYBRIDATION IN SITU EN FLUORESCENCE (FISH)
L’hybridation in situ en fluorescence est de devenue un outil diagnostique de routine dans les laboratoires de cytogénétique pour caractériser de manière ciblée les microremaniements chromosomiques inférieurs à 3 Mb (Mégabase), non détectables par le caryotype métaphasique
Principe L’hybridation in situ par fluorescence (FISH) est une technique qui permet de visualiser des séquences ADN au sein d’une préparation cellulaire. La technique utilise des sondes simple brin marquées avec un fluorochrome s’hybridant à des séquences spécifiques. L’hybridation de la sonde à l’ADN cellulaire est visible par détection directe à l’aide d’un microscope à fluorescence. Les cellules provenant d’échantillons de liquide amniotique sont montées sur des lames de verre, l’ADN des échantillons ainsi fixé est dénaturé sous forme simple brin, puis hybridé aux sondes CEP 18/X/Y et LSI 13/21. Après l’hybridation l’excès des sondes non hybridées est éliminé au cours d’une série de lavages. Les chromosomes et les noyaux sont contrecolorés avec le colorant DAPI (4,6diamidino-2-phenylindole). L’hybridation des sondes ADN CEP 18/X/Y et LSI 13/21 est examinée à l’aide d’un microscope a fluorescence équipé de filtres d’excitation et d’émission adéquats permettant de visualiser les signaux fluorescents intenses orange, verts et bleus. (Annexe 2) La procédure FISH permet l’énumération visuelle des chromosomes 13, 18, 21, X et Y dans les noyaux interphasiques grâce à la sonde CEP 18/X/Y qui contient un mélange de sondes ADN fluorescentes à marquage direct spécifiques des régions D18Z1, DXZ1 e DYZ3 des chromosomes 18, X et Y, respectivement et La sonde LSI 13/21 qui contient un mélange de séquences d’ADN uniques s’hybridant dans la région 13q14 du chromosome 13 et des séquences d’ADN uniques complémentaires des loci D21S259, D21S341 et D21S342 contenus dans les régions 21q22.13 à 21q22.2 sur le bras long du chromosome 21.
Sonde utilisée (Annexe 3) AneuVysion Multicolor DNA Probe Kit (Vysis CEP 18/X/Y – alpha satellite / LSI 13/21) (Figure 6) Sonde utilisant la technologie brevetée d’hybridation in situ en fluorescence (FISH) appliquée aux amniocytes non cultivés, permet de détecter les trisomies 13 (syndrome Patau), 18 (syndrome d’Edwards) et 21 (syndrome de Down) et les aneusomies des chromosomes sexuels en à peine 24 heures
Chaque kit AneuVysion comporte : cinq sondes FISH emballées en deux mélanges de sondes ; contre-colorant DAPI ; notice d’utilisation présentant des informations détaillées sur le protocole.
Protocole expérimentale
Préparation de lames à partir d’échantillons de liquide amniotique non cultivés Pour commencer on centrifuge 5 ml d’échantillon de liquide amniotique entier pendant 5 minutes à 2500 t/min (l’échantillon ne doit apparaitre ni sanglant ni marron). On remet le culot en suspension dans 4 ml de trypsine et on l’incube dans un bain-marie à 37 °C pour au moins 15 minutes.
On centrifuge la suspension pendant 5 minutes à 2500 t/min. On remet le culot en suspension dans 5 ml de KCl (0.56%) et on l’incube pendant 20 minutes dans un bain-marie à 37 °C. Ensuite on ajoute 2 ml de fixateur (méthanol/acide acétique glacial : 3/1) aux cellules où à la solution hypotonique, et on centrifuge délicatement. On centrifuge la suspension pendant 5 minutes à 2500 t/min et on remet le culot dans 1 ml de fixateur frais.
Il faut conserver les échantillons fixés à 4 °C pendant au moins 30 minutes ou jusqu’à ce que le test FISH soit prêt à être effectué. Pour une conser ation à long terme on conserve les échantillons fixés à -20 °C (5 °C dans un fixateur).
Avant de monter les cellules sur les lames, on ajuste le volume de la suspension cellulaire en fonction de la taille du culot. Si nécessaire, notamment après une conser ation prolongée (plus d’un mois) on la e les culots a ec du fixateur.
Pour préparer les lames en vue d’un test FISH, on dépose la suspension cellulaire directement sur une ou deux lames en erre froides pour créer 2 zones d’hybridation (15 à 25 μl de suspension cellulaire par zone).
Prétraitement des cellules de liquide amniotique non cultivées
La méthode suivante peut être utilisée pour prétraiter les lames préparées à partir d’échantillons de liquide amniotique non culti é. Cette procédure est recommandée pour l’obtention de résultats FISH optimaux. Ce prétraitement s’applique tout particulièrement aux échantillons prélevés à un stade avancé de la grossesse et aux échantillons à hybrider immédiatement après la préparation des lames.On place la lame préparée à partir d’amniocytes non culti és dans du SSC 2X pendant 1 heure à 37 °C. Ensuite on la place dans une solution active de pepsine récemment préparée pendant 13 minutes à 37 °C, et on la rince dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à température ambiante pendant 5 minutes.
On Place la lame dans une solution de post-fixation (formaldéhyde à 0,95 % : 1,3 ml de formaldéhyde a 37 %, 0,23 g de MgCl2 et 48,7 ml de PBS. On la conserve à 4 °C, et on
l’utilise dans le mois qui suit.) pendant 5 minutes à température ambiante et on la rince dans du PBS aussi à température ambiante pendant 5 minutes. On sèche la lame, on l’immerge dans de l’éthanol (70%) à température ambiante et on la laisse pendant 1 minute.
On retire la lame de l’éthanol (70%) et on répète l’étape précédente a ec de l’éthanol (85%) puis a ec de l’éthanol (100%). Finalement on dénature la lame.
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I. DIAGNOSTIC GENETIQUE PRENATAL
1. Définition
2. Objectifs
II. INDICATIONS DU DIAGNOSTIC GENETIQUE PRENATAL
1. En pathologie chromosomique
2. En pathologie génique
III. TECHNIQUES DE PRELEVEMENT EN VU DU DIAGNOSTIC GENETIQUE PRENATAL
1. Choriocentése ou placentocentése
2. Amniocentèse
3. Cordocentése
4. Adn fœtal circulant
IV. ANALYSES GENETIQUES EN VU DU DIAGNOSTIC GENETIQUE PRENATAL
1. Analyse des chromosomes
1.1 Caryotype fœtal
1.2 Hybridation in situ en fluorescence (FISH)
2. Analyse moléculaire
MATERIEL ET METHODE
I. MATERIEL BIOLOGIQUE
II. METHODES UTLILISEES
1. Prélèvement
2. Hybridation in situ en fluorescence
2.1 Principe
2.2 Sonde utilisée
2.3 Protocole expérimentale
a) Préparation de lames à partir d’échantillons de liquide amniotique non cultivés
b) Prétraitement des cellules de liquide amniotique non cultivées
c) Dénaturation de l’ADN des échantillons
d) Préparation de la sonde
e) Hybridation
f) Lavage post-hybridation
g) Lecture et interprétation des lames
3. Traitement des données
RESULTATS ET DISCUSSION
I. DONNEES EPIDEMIOLOGIQUES
1. Age maternel
2. Age de grossesse
3. Consanguinité
4. Antécédent d’anomalie chromosomique
II. SIGNES D’APPEL ECHOGRAPHIQUES
III. RESULTATS DE LA CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE
CONCLUSION GENERALE
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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