Soutenance mémoire
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Cycle asexué chez l’homme : schizogonie
Après une piqûre infectante, les sporozoïtes injectés dans les capillaires cutanés vont migrer rapidement vers le foie. Pendant ce court délai, ils sont sensibles aux effecteurs du système immunitaire et aux cellules phagocytaires. Seuls les sporozoïtes ayant réussis à pénétrer dans les hépatocytes pourront continuer leur maturation/réplication. Le parasite se trouve alors être dans une phase de réplication (figure 1). Elle dure 6 à 15 jours et se termine par l’éclatement des hépatocytes infectés permettant la libération d’un grand nombre de mérozoïtes dans la circulation sanguine. Plasmodium falciparum présente une spécifité importante lors de cette phase : c’est l’absence d’hypnozoïtes. Cette caractéristique explique entre autre les rechutes pouvant être observées avec Plasmodium vivax et Plamodium oval.
Libérés dans le sang, les mérozoïtes envahissent de nouveaux globules rouges et le cycle de réplication érythrocytaire (illustrée par la figure 1) peut ainsi commencer. C’est un processus cyclique allant de l’invasion d’un globule rouge à son éclatement permettant ainsi la libération d’une trentaine de nouveaux mérozoïtes qui pourront coloniser d’autres globules rouges. Pendant ce cycle qui dure 48 heures pour P, falciparum le parasite initialement présent sous la forme d’un mérozoïtes libre passe après invasion par différentes phases : anneau, trophozoïte, schizonte et rosace. La rosace est le stade de maturation ultime qui correspond à un schizonte sur le point d’éclater pour libérer de nouveaux mérozoïtes. L’éclatement des globules rouges, provoquant l’anémie, est à l’origine de nombreux symptômes cliniques du paludisme. Les gamétocytes mâles et femelles apparaissent tardivement (2).
Cycle sexué chez le moustique : sporogonie
Au cours d’un repas sanguin sur un hôte humain infecté l’Anophèle femelle va ingérer en même temps que le sang les gamétocytes mâles et femelles. Le moustique devient alors infecté et le cycle sexué de reproduction du parasite commence. Après fécondation, il y’a la formation d’oocystes, et cela en moins de 24h après le repas sanguin. Chaque oocyste formé se divise et se multiplie afin de libérer, 4 à 15 jours après le repas sanguin, plusieurs milliers de sporozoïtes qui iront coloniser les glandes salivaires. C’est à partir de ce moment-là que le moustique est infectieux pour l’homme. En effet, tout nouveau repas sanguin sera accompagné d’une inoculation des sporozoïtes chez l’hôte.
Diagnostic biologique direct
Il se réalise par l’examen direct au microscope optique de prélèvements sanguins effectués de préférence avant tout traitement antipaludique. Les techniques les plus utilisées sont la goutte épaisse et le frottis sanguin.
La goutte épaisse : elle a l’avantage de concentrer 20 fois plus de parasites qu’un frottis mince. C’est l’examen de référence. Sa réalisation consiste à prélever et à déposer une goutte de sang (souvent par piqûre au doigt) sur une lame porte objet bien nettoyée, puis par un mouvement en spirale et à l’aide d’un coin d’une autre lame, défibriner la goutte sur une surface d’environ un centimètre de diamètre.
Le prélèvement est séché puis coloré, sans fixation préalable, à l’aide d’une solution de Giemsa diluée qui aura une double action : déshémoglobinisation et coloration. Après coloration, les leucocytes et les parasites éventuels resteront sur la lame. L’examen se fait au microscope optique, à l’objectif 100 en utilisant de l’huile à immersion. La numération se fait en comptant les parasites rapportés au nombre de leucocytes. L’examen peut mettre en évidence de faibles taux de parasitémie de l’ordre de 10 à 20 parasites par microlitre de sang.
La densité parasitaire (DP) est calculée comme étant : DP (parasites/mm3 de sang) = nombre de parasites comptés x 8000/nombre de leucocytes comptés.
Le frottis sanguin : c’est un étalement mince d’une goutte de sang prélevée au doigt sur une lame de verre. L’examen se fait après fixation à l’alcool et coloration au Giemsa. Il permet un diagnostic d’espèce plus précis mais ne permet pas de détecter les faibles parasitémie.
Ces dernières années de nouvelles techniques fondées sur les testes immuno-chromatographiques du sang complet ont été développées pour le diagnostic rapide du paludisme (21).
Test de Diagnostic Rapide (TDR) : Ces méthodes reposent sur le principe de la détection de la protéine (HRP-2) Histidin Rich Protein2 ou de l’enzyme Lactate Déshydrogénase (pLDH) et l’aldolase présentent dans les infections palustres.
Pour ce qui concerne le test de détection de l’Histidin Rich Protein 2 (HRP-2), il est rapide, manuel et spécifique de Plasmodium falciparum. Il est basé sur la détection de l’Histidin Rich Protein 2 (HRP-2) qui est une glycoprotéine spécifique de Plasmodium falciparum. C’est un antigène soluble qui est sécrété de façon constante tout au long du cycle érythrocytaire du parasite. Le TDR est un test unitaire, sa réalisation et sa lecture ne nécessitent aucun appareillage. Après hémolyse et absorption par capillarité sur une bandelette de nitrocellulose de l’échantillon sanguin, l’HRP-2 est détecté par adjonction d’un anticorps monoclonal anti HRP2 couplé à un révélateur coloré. La sensibilité et la spécificité de ce test, respectivement de 98% et 99% avec une valeur prédictive positive de 91%, une bonne stabilité sur le terrain et l’absence de réaction croisée avec les autres espèces plasmodiales d’intérêt humain en font un test d’usage courant. (21)
Quant au test de détection de la lactico déshydrogénase plasmodiale (la pLDH : Plasmodium Lactico déshydrogénase plasmodiale) c’est une enzyme glycolytique soluble exprimée à des niveaux élevés aux stades asexués des parasites du paludisme qui est mise en évidence. Elle est trouvée chez chacune des quatre espèces humaines de Plasmodium. L’activité de la pLDH est corrélée avec le niveau de parasitémie trouvé dans les cultures in vitro de parasites et dans le plasma des patients infectés, diagnostiqués par la microscopie.
Diagnostic indirect : Méthodes sérologiques
Ce sont des méthodes immunologiques qui reposent sur la détection des anticorps dirigés contre les Ag de P.falciparum. La présence de Plasmodium dans le sang provoque la formation d’anticorps dirigés contre les antigènes du parasite. On peut ainsi titrer le complexe antigène – anticorps.
Les différentes techniques utilisées sont :
– L’immunofluorescence indirecte ;
– L’immunoélectrophorèse ;
– L’immuno-enzymologie (ELISA) ;
– L’hémoglutination, l’immunodiffusion.
– Il existe également d’autres moyens de diagnostic
La PCR (Réaction de Polymérisation en Chaine)est un technique d’amplification de l’ADN parasitaire.
Chimiorésistance
Définition
La chimiorésistance dans le paludisme a été défini par l’OMS (25) comme « l’aptitude d’une souche de parasite du paludisme à survivre ou à se multiplier malgré l’administration et l’absorption d’un médicament employé à des doses égales ou supérieures aux doses ordinairement recommandées mais comprises dans les limites de tolérance du sujet ». Elle se démontre par des contrôles parasitologiques associées à la vérification d’une concentration sanguine efficace du médicament ou par la culture in vitro des parasites (antipaludogramme), qui mesure le niveau d’action du médicament sur un cycle de multiplication (48 heures pour Plasmodium falciparum).
Méthodes d’études de la résistance
Trois approches méthodologiques sont couramment utilisées pour analyser le phénomène de la résistance du paludisme. Le test de l’efficacité thérapeutique (test in vivo), qui bien non standardisé pour tous les antipaludiques, représente la méthode de base pour déceler la résistance.
Le test in vitro (antipaludogramme), qui contourne certaines difficultés du test in vivo, nécessite un minimum de formation des réalisateurs et un équipement onéreux pour les laboratoires du sud.
La biologie moléculaire représente une approche technique importante, car elle permet d’analyser les gènes impliqués dans la résistance (26).
Le test de sensibilité in vivo
Plusieurs tests d’efficacité thérapeutique ont été mis au point mais le plus utilisé actuellement, est celui de l’OMS de 1994 modifié en 1996 et en 2001. C’est un test simplifié, standard de 14 jours de suivi dont l’interprétation également simplifiée tient compte des réponses cliniques et parasitologiques. Le test consiste à administrer à un sujet porteur de Plasmodium falciprarum, présentant un paludisme non compliqué, la dose ordinairement recommandée de l’antipaludique à étudier. Les contrôles cliniques et parasitologiques sont effectués les jours 2, 3,7 et 14. L’efficacité du traitement est exprimée en terme de réponse clinique et parasitologique adéquate (RCPA), en échec thérapeutique précoce (ETP) et en échec thérapeutique tardif (ETT). Il permet le recueil des données cliniques et épidémiologiques sur le terrain. Mis à part de ces avantages, le test comporte des inconvénients. Lorsqu’il s’agit de le réaliser en ambulatoire, les sujets ne se présentent plus à l’équip-e de recherche pour les contrôles dès qu’ils se sentent mieux et ce, malgré les engagements pris dés le départ. Aussi des facteurs humains individuels peuvent être responsables de fausses résistances, ce peut être des troubles d’absorption du médicament dus à un défaut d’absorption intestinale, une élimination rapide du produit par vomissement ou par diarrhée. D’autres facteurs tels qu’un faible taux de biotransformation du médicament, la dégradation du médicament avant même sa prise une réinfection comme c’est souvent le cas en Afrique tropicale, peuvent aussi être responsables de fausses résistances. Par ailleurs la prémunition et la prise non rapportée d’autres médicaments antipaludiques et remèdes à base de plantes avant ou après le traitement peuvent fausser l’interprétation des réponses cliniques adéquates qui dans ces conditions ne signifient pas obligatoirement une sensibilité des parasites au médicament.
Les tests de sensibilité in vitro (antipaludogramme)
Ils contournent certaines difficultés des tests de l’efficacité thérapeutique, nécessitent un équipement onéreux pour le laboratoire. Il existe actuelle plusieurs tests in vitro tels que le micro test de RIECKMANN adopté par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS), le test isotopique de DESJARDINS, le semimicrotest de LE BRAS et DELERON. Ils différent légèrement par des détails techniques et le mode d’interprétation, mais ces trois méthodes donnent des résultats corrélés. Ces tests consistent à mettre en culture des parasites, aux stades trophozoïtes, en présence d’antimalarique à dose croissante et à étudier l’inhibition de leurs multiplications. L’activité antipaludique est appréciée en fin de test, soit par lecture microscopique (numération des schizontes sur gouttes épaisse et détermination de la première dose de la molécule empêchant toute formation des schizontes), soit par la mesure de l’incorporation d’hypoxanthine tritiée, un des précurseurs des acides nucléiques.
Les résultats sont exprimés en concentration inhibitrice 50% (CI 50%) qui représente la dose pour laquelle on observe une diminution de la moitié de l’incorporation obtenue dans les puits témoins (en l’absence d’antimalarique).
Le génotypage moléculaire
Elle représente une autre approche technique importante, car elle permet d’analyser les gènes impliqués dans la résistance.
En pratique courante, la corrélation de modifications génétiques à un phénotype résistant nécessite le développement de techniques de biologie moléculaire relativement simples à mettre en œuvre, comme celles dérivées de la PCR (Polymerase Chain Reaction).
Cette technique est le plus souvent utilisée dans le cadre des résistances de P.falciparulm aux antipaludiques (particulièrement la pyriméthamine, la sulfadoxine et le cycloguanil), à la recherche de mutations des gènes impliqués dans le phénomène de la résistance.
Principe de la PCR
Dans la cellule, la duplication a lieu juste avant la mitose. L’enzyme qui intervient dans cette duplication est l’ADN polymérase. Cette enzyme allonge les chaînes de nucléotides. Après la séparation des deux brins de la molécule d’ADN (on parle de dénaturation), des fragments d’ARN appelés amorces s’apparient (ou s’hybrident) à leur séquence complémentaire au niveau de chaque brin. L’ADN polymérase les allonge par ajout de nucléotides, aboutissant à la formation d’une copie complémentaire de chaque brin d’ADN. On obtient ainsi deux nouvelles molécules identiques à la molécule de départ. Il y’a eu polymérisation.
La PCR est basée sur ce même principe mais elle utilise deux amorces qui sont sous forme d’ADN simple brin. Elle comporte trois étapes principales (10).
Etapes de la PCR
La dénaturation
L’ADN est dénaturé par une élévation de la température à une valeur supérieure à la température de fusion (Tm, c’est-à-dire la température pour laquelle 50% de l’ADN se trouve sous la forme de simple brin). Elle se fait à 94°C pendant environ 15 secondes. En fait, plus la température est élevée, plus le nombre de molécules d’ADN sous forme de simple brin est grand.
Les mauvaises amplifications peuvent résulter d’une dénaturation incomplète. Pour cette raison, une première phase de dénaturation assez longue de 5 min est incluse. Elle ne se répète pas tout au long de l’amplification. Elle permet de s’assurer que tout l’ADN cible se trouve sous forme de simple brin. Avec des temps de dénaturation très long, on assiste à une baisse du rendement puisque l’effet de plateau est très vite atteint. L’effet de plateau se traduit par une inactivation d’une grande partie de la Taq polymérase, une raréfaction des Nucléotides et des amorces.
Les composants de la réaction
L’ADN
Il constitue la cible à partir de laquelle se feront les copies. Il doit pour cela être pur, c’est-à-dire être débarrassé des protéines qui lui sont associées. Ces impuretés peuvent conduire à des amplifications parasites dues aux ARN ou à une baisse du rendement par le fait des protéines associées comme les histones.
Les origines de cet ADN peuvent être multiples : sang total, sang sur papier buvard, tissus frais, tissus conservés à l’état sec, tissus secs conservés à -70°C, tissus conservés dans de l’alcool, dans du Carnoy, etc. (26). De l’ADN peut être également extrait de tissus colorés à l’hématoxyline et à l’éosine. L’ADN ne doit pas comporter de rupture au niveau des séquences à amplifier.
L’ADN peut être associé à des produits qui sont des inhibiteurs de la Taq polymérase soit lors de son extraction (phénol) soit lors de sa conservation (EDTA). Des lavages au chroloforme permettent d’éliminer le phénol. Des dilutions de solutions d’ADN permettent de réduire l’effet de ces produits (12).
L’ADN polymérase
La plus utilisée est la Taq polymérase. Cette enzyme est extraite d’une archéobactérie, Thermus aquaticus qui vit dans les sources thermales entre 80° et 90°C (13). Son ADN polymérase (la Taq polymérase) est thermostable (27) et supporte la température de dénaturation de l’ADN. Son activité est optimale entre 65 et 72°C (17) relativement élevée à laquelle la spécificité de la duplication est accrue. A cette température la Taq polymérase est capable de juxtaposer 100 nucléotides par seconde et par molécule. Les faibles ainsi que les fortes températures ont pour effet de diminuer l’activité de la Taq polymérase. Le pH influe également sur l’activité de cette enzyme. Les meilleures enzymes sont obtenues pour des valeurs comprises entre pH 8.2 et ph 90. Une augmentation ou une diminution du pH par rapport à ces valeurs entraîne une baisse de l’activité de la Taq polymérase.
Les concentrations en enzyme varient généralement entre 1 et 2.5 unités par 100 L final si les autres paramètres sont à leur valeur optimale. Il est à noter que lorsque les Taq polymérases ont des origines différentes, elles se comportent différemment. Ce fait très important est à prendre en compte si l’on veut utiliser la technique PCR.
La Taq polymérase présente néanmoins des imperfections. Etant dépourvue d’exonucléases, il n’y aura donc pas de correction des erreurs d’incorporation. Elle fait une erreur toutes les 400 bases (27). Il existe une ADN polymérase thermostable pourvue d’une activité exonucléasique appelée « vent DNA polymérase » (13, 14, 29,). Certains auteurs préfèrent ajouter la Taq polymérase après le premier cycle de dénaturation pour avoir un rendement maximum. Cela est pratique si le nombre d’échantillons à traiter est petit. Si ce n’est pas le cas il est préférable de mélanger la Taq polymérase à la mixture (« mix »).
Les nucléotides (dNTPs)
Les solutions de travail sont constituées d’un mélange équimolaire des quatre désoxynucléotides : aDTP, dTTP, dGTP et dCTP. Ils sont regroupés sous le terme général de dNTPs. Ce type de mélange équimolaire permet d’éviter les erreurs d’incorporation par la Taq polymérase. Les solutions de travail sont divisées en de petits aliquots et gardées à -20°C. La concentration utilisée est de 2 mM. Il est préférable d’utiliser les faibles concentrations en nucléotides car elles ont pour effet de minimiser les mauvais appariements des amorces à des sites non ciblés.
Les amorces ou « primers »
Il s’agit de courts fragments d’ADN sous forme de simple brin de 20 à 35 paires de bases chacun (11, 15). Ces amorces doivent avoir des quantités de (G + C) et (A + T) sensiblement égales afin d’éviter la formation de structures secondaires comme les boucles (11, 29). Mais des températures d’hybridation trop élevées diminuent la spécificité. Une des deux amorces ne doit pas être complémentaire de l’autre pour éviter l’hybridation des amorces entre elles (4, 29). Généralement, la concentration des amorces est de l’ordre de 0.2 mM. A cette concentration, l’hybridation se fait en quelques secondes. Pour éviter de congeler et décongeler très souvent, les solutions de primer sont séparées en de petits aliquots. Les fortes concentrations doivent être évitées car elles entraînent des amplifications de séquences non ciblées.
Le tampon
Il existe toute une variété de tampons. Les tampons sont optimisés en fonction des paramètres de la PCR. Ils se composent en général de Tris-HCl (tris (hydroxyméthyl) aminométhane), de chlorure de magnésium (MgCℓ2), de chlorure de potassium (KCℓ2) de gélatine et de détergents.
Le tris-HCℓ (tris (hydroxyméthyl) aminométhane)
Il régule le pH de la réaction. Ce pH joue un rôle très important car il intervient au niveau de l’activité de la Taq polymérase. Le pH du tris-HCℓ décroît de 0.03 unité par degré lorsqu’on augmente la température, permettant ainsi d’obtenir à 72°C la valeur d’activité optimale de la Taq polymérase (12, 16). Le chlore de magnésium (MgCℓ2) :
Il fournit les ions Mg2+ qui affectent pratiquement tous les autres paramètres de la réaction : hybridation, dénaturation, spécificité, formation de dimères d’amorces (primers dimers). Ces ions sont nécessaires à l’activité et à la fidélité de la Taq polymérase (11). Il peut interagir ave les nucléotides, mais aussi avec les chélateurs comme l’EDTA.
De ce fait il devient inaccessible à la Taq polymérase qui est alors inhibée, entraînant ainsi une baisse du rendement de la synthése. Sa concentration (0.2 à 205 mM) dans le milieu d’incubation doit être supérieure à celle des nucléotides de quelques millimoles. Les protéines et les acides nucléiques peuvent également fixer le MgCℓ2, le rendant inaccessible à la Taq polymérase, d’où l’intérêt d’éviter les très fortes concentrations en ADN cible.
Le chlorure de potassium (KCℓ)
Les sels ne sont pas indispensables à la réaction. Ils ont une action inhibitrice sur la Taq polymérase. Cependant ils ont un rôle très important car ils facilitent l’hybridation des amorces. Il convient donc d’optimiser la concentration du KCℓ dans le milieu d’incubation (11, 13, 15).
Les détergents et la gélatine
En solution aqueuse, la Taq polymérase fortement hydrophobe a tendance à précipiter. Pour cette raison, les détergents tels que le Triton X-100, le NP 40 ou le Tween 20 sont parfois ajoutés dans le milieu pour stabiliser la Taq polymérase et lui conférer le maximum d’activité (11, 15). Les protéines stabilisent également la Taq polymérase ; lé gélatine a l’avantage de supporter les températures de dénaturation.
L’eau joue également un rôle important dans la réaction car elle apporte des ions hydrogénés.
Les contaminations en PCR
Les premières PCR ont montré très souvent des amplifications au niveau des témoins négatifs (théoriquement dépourvu d’ADN) donnant ainsi naissance à de faux positifs. Ces faux positifs apparaissent très souvent après une longue utilisation des mêmes produits d’incubation qui ont été contaminés au cours du temps par de l’ADN pouvant provenir d’aérosols lors de l’ouverture des tubes, des parois internes des pipettes ayant servi à l’extraction d’ADN ou à la distribution des produits de PCR. Pour minimiser les contaminations, il est conseillé de préparer un « mix » et de réaliser les incubations dans des pièces différentes de celles où sont analysés les produits d’amplification et de celles où est extrait l’ADN. Le travail sous une hotte permet de purifier l’air ambiant du grand nombre d’aérosols contaminants qu’il contient. L’irradiation des lieux par des UV, l’aliquotage en de petits volumes de tous les produits de l’incubation, la distribution de l’ADN en dernier permet de minimiser considérablement les contaminations. Les pipettes et la hotte sont nettoyés avant usage par de l’éthanol à 72°.
La confection de TDR
Tests recherchant l’antigène HRP – 2 : ces tests permettent la mise en évidence de l’antigène HRP2, libéré spécifiquement par P. falciparum dans le sang des malades (First Response*). Il s’agit de kits très sensibles et spécifiques qui permettent le diagnostic d’infection et de l’espèce P. falciparum de façon qualitative. Test unitaire, sa réalisation et sa lecture sont très faciles et ne nécessitent aucun appareillage. (15)
Dans le kit de TDR il y a la cassette, le vaccinostyle, le tube capillaire et le tampon alcoolisé. Pour sa réalisation, le 4ème doigt de la main gauche a été désinfecté au moyen du tampon imbibé d’alcool puis séché avant d’être piqué avec le vaccinostyle pour le recueil d’une goutte de sang à l’aide du tube capillaire.
La goutte de sang a été déposée dans l’alvéole carrée marquée « A » de la cassette (figure 8). Puis nous avons ajouté une solution tampon dans l’alvéole ronde marquée « B ». Les résultats du TDR ont été lus au bout de 15 minutes.
L’apparition de la ligne rouge dans la fenêtre C et une ligne rouge dans la fenêtre « T » signifie que le test est positif.
Les patients dont les TDR sont positifs sont pris en charge et un traitement par les ACT leurs est appliqué.
La confection de goutte épaisse
Nous avons recueilli une goutte de sang d’environ 3 à 4 µL après avoir désinfecté la pulpe de l’annulaire de la main gauche avec un tampon d’alcool à 70°C. La goutte de sang est déposée sur une lame porte objet et ensuite étalée à l’aide du coin d’une autre lame de façon à en faire une couche régulière d’environ 1 cm de diamètre. Le sang ne doit pas être trop défibriné : 3 à 6 mouvements suffisent à donner à la goutte une forme circulaire.
La confection sur papier filtre buvard
Pour sa réalisation, la face latérale du 4ème doigt de la main a été désinfectée au moyen du tampon imbibé d’alcool puis séché avant d’être piqué avec le vaccinostyle. La première goutte de sang a été essuyée et ensuite, nous avons recueilli trois gouttes de sang de façon séparé sur un papier buvard.
Le prélèvement est séché à l’abri des mouches et de la poussière. Ces confettis sont, scellés dans des sachets avec du sillicagel et gardés à l’abri de l’humidité.
Ils sont ensuite acheminés au laboratoire pour extraction et l’amplification de l’ADN parasitaire.
Génotypage moléculaire
Extraction d’ADN sur papier filtre buvard
L’ADN plasmodiale a été extrait par la méthode de Chelex suivant la protocole ci-dessous :
Porter des gants stériles pour minimiser les contaminations
Numéroter les tubes eppendorf de 1,5 ml conformément aux numéros des papiers buvards à traiter. Avant de découper les papiers buvards imprégnés de sang il faut toujours nettoyer les ciseaux avec de l’eau distillée, bien les sécher avec du coton.
Découper approximativement 3 mm2 de la partie imbibée de sang du papier buvard et le placer dans le tube eppendorf correspondant.
Ajouter 0,8 ml de saponine 20% (0,5g dans 100 ml d’eau distillée pour lyser la membrane cellulaire) dans chaque tube contenant les morceaux de papier buvard préalablement découpés de manière à les immerger entièrement.
Centrifuger les tubes à 1500 tours/mn pendant 10 minutes.
Fermer les tubes et laisser incuber pendant toute la nuit à température ambiante du laboratoire.
Enlever le surnageant et laver 2 fois avec du PBS1 x pendant 5 minutes.
Ajouter 150 µL de Chelex 20% dans chaque tube.
Chauffer les tubes pendant 8 minutes à 100°C en les vortexant régulièrement.
Laisser refroidir les tubes puis centrifuger 2000 tours/mn pendant 5 minutes.
Récupérer le surnageant dans de nouveaux tubes en prenant soin de ne pas prendre le Chelex et de bien les numérotés. L’ADN ainsi extrait est immédiatement utilisé pour faire la PCR ou conservé à -20°C.
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Table des matières
PREMIERE PARTIE GENERALITES SUR LE PALUDISME
INTRODUCTION
I- EPIDEMIOLOGIE DU PALUDISME
I-1- Définition
I-2- Mode de transmission et vecteur du paludisme
I-3- Cycle biologique du parasite
I-3-1- Cycle asexué chez l’homme : schizogonie
I-3-2- Cycle sexué chez le moustique : sporogonie
I-4- Facteurs favorisants
II- Diagnostic du paludisme
II-1- Diagnostic biologique direct
II-2- Diagnostic indirect : Méthodes sérologiques
III- Chimiorésistance
III-1 Définition
III-2 Méthodes d’études de la résistance
III-2-1 Le test de sensibilité in vivo
III-2-2 Les tests de sensibilité in vitro (antipaludogramme)
III-2-3 Le génotypage moléculaire
III-2-3-1- Principe de la PCR
III-2-3-2- Etapes de la PCR
III-2-3-3- Les composants de la réaction
III-2-3-4- Détection et analyse des produits de PCR
III-2-3-5- Les contaminations en PCR
DEUXIEME PARTIETRAVAIL PERSONNEL
I- METHODOLOGIE
I-1- Zone d’étude
I-2- Type et période d’étude
I-3- Population d’étude
I-4- Examens de laboratoire
I-4-1- La confection de TDR
I-4-2- La confection de goutte épaisse
I-4-3- La confection sur papier filtre buvard
I-4-4- Génotypage moléculaire
I-4-4-1-Extraction d’ADN sur papier filtre buvard
I-4-4-2- Techniques d’amplification de l’ADN plasmodial : PCR
I-4-4-2Restriction enzymatique
I-4-4-3-Electrophorése
II- RESULTATS
II-1- Caractéristiques de la population
II-2- Prévalence des mutations du gène Pfmdr 1 associées à la résistance du
II-3- Prévalence des mutations du gène Pfmdr 1 associées à la résistance du
II-4- Prévalence des mutations du gène Pfmdr 1 associées à la résistance du
III- DISCUSSION
IV- LIMITES DE L’ETUDE
CONCLUSION ET PERSPECTIVE
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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