Soutenance mémoire
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Suivis en cours de culture à chaque stade
Un suivi de près était régulièrement entrepris au champ. Il s’agissait d’observation visuelle au champ de la durée des différents stades de croissance et du développement des organes de reproduction.
Notons que les mesures et les observations ont été effectuées à partir de la deuxième semaine du semis. Elles ont été faites sur les 5 plantes centrales de la ligne centrale de chaque parcelle élémentaire.
Caractères morphologiques
Selon les références fournies par le laboratoire des ressources génétiques du Département de Recherche rizicole du FOFIFA, les paramètres suivants ont été déterminés au cours de la collecte des données :
– Caractères de la plante
– Caractères du feuillage
– Caractères des grains
– Caractères de la panicule
Caractères de la plante
Les caractères considérés sont relatifs à la croissance de la plante mais aussi à des traits qualitatifs :
• La hauteur (cm) a été mesurée au cours de la phase de maturité c’est-à-dire 140 jours après le repiquage. Une règle graduée de 30 cm avec 0,5 cm de précision a été utilisée. La mesure a été effectuée sur un échantillon de 5 plantes centrales. La hauteur a été prise du collet ou de la base des plantes jusqu’à l’extrémité de la panicule la plus haute lorsque cette dernière dépasse la taille de la feuille paniculaire. Il est important d’évaluer la hauteur de la plante car c’est un caractère spécifique de chaque variété. Elle est classée en terme de paille courte (70 cm environ), moyenne (90 cm) ou haute (120 cm).
• Le nombre total de talles: a été compté dans chaque parcelle élémentaire sur les 5 plantes centrales pendant le début de maturation (130 jours après le repiquage) et les résultats ont été obtenus par la moyenne de comptages. L’obtention des nombres de talles se fait par simple comptage à la main. Ces pieds ont été marqués pour faciliter la prochaine observation. Il est qualifié suivant le nombre de talles : faible (moins de 6), moyen (7 à 15), fort (plus de16).
• Le nombre de talles fertiles : le comptage est effectué 5 jours après le début de maturation sur les plants marqués auparavant. C’est le nombre de talles portant des panicules.
• Le diamètre de paille a été mesuré au cours de la phase reproductive (110 jours après le repiquage) à l’aide du pied à coulisse. Il est qualifié suivant les mesures des pailles comme petit diamètre (2 mm à 3,9 mm), moyen (4 mm à 5,9 mm), gros (6 mm à 8 mm) (Photo n°06).
Caractères du feuillage
Ils sont de nature quantitative et qualitative :
• L’angle de feuille paniculaire a été observé pendant la phase reproductive c’est-à-dire 110 jours après le repiquage (après l’épiaison : érigé, intermédiaire, horizontal, retombant). La couleur de l’entrenoeud central et des stigmates ; la coloration du feuillage ont été déterminées pendant la phase reproductive pour la couleur du stigmate et pendant la phase végétative pour la couleur d’entrenoeud central et la coloration du feuillage par une observation directe dans chaque parcelle élémentaire.
• La longueur de la ligule (en mm) : mesurée pendant la phase végétative (90 jours après le repiquage) de la base du collet jusqu’au sommet. La couleur et la forme de la ligule peuvent être angulaires à acuminé ou bifide et tronqué observés durant la phase végétative.
• La longueur du limbe foliaire (cm) a été mesurée au stade végétatif (90 jours après le repiquage) à l’aide de la règle graduée de 30 cm portée avec 0,5 cm de précision.
Caractères des grains
Des traits quantitatifs et qualitatifs ont été considérés :
• Aristation: observée pendant la phase de maturité : très aristée, aristée, peu aristée, apiculée et mutique.
• Longueur des glumes (sur 5 graines) : a été mesurée au cours de la phase de maturité (140 jours après le repiquage) à l’aide d’une règle graduée de 30 cm qualifiés suivant les mesures de glume courte (1,5 mm), moyenne (1,6 à 2,5 mm), longue (2 mm mais inférieure à la longueur de la glumelle supérieure), très longue (supérieure à la glumelle supérieure), asymétrique (longueur des 2 glumes différentes).
• Longueur de la graine : les mesures ont été faites sur 10 graines bien développées issues des 5 panicules centrales à partir de la base des glumes jusqu’au sommet de la plus longue glumelle (barbe à exclure).
• Largeur de la graine: les mesures ont été effectuées sur les 10 graines précédentes et sur la partie la plus large.
• Estimation de la stérilité sur les 5 panicules centrales :
Si le pourcentage des grains bien développés est :
– de 90% : elle est dite très fertile,
– entre 75 % et 90 % : elle est dite fertile,
– supérieur à 50% : elle est partiellement stérile,
– égales à 0% : elle est dite complètement stérile.
• Poids de 100 grains: ce sont des grains bien développés issus des cinq principales panicules centrales séchées dans des conditions égales. Compter 100 grains et les peser à l’aide d’une balance de précision de portée 100 g et de précision 1 g.
• Taux d’égrenage à maturité : résistant (peu égrené), moyen 25-50% égrené, sensible 50%. La couleur de l’apex maturité, la couleur des glumelles à maturité, la couleur des glumes à maturité, et la pubescence des glumelles (floraison à maturité : glabre, carène de la glumelle supérieure poilue, bout supérieur poilu, poils courts, poils longs) ont été déterminées par une observation directe dans chaque parcelle élémentaire.
• Translucidité : évaluée visuellement sur une dizaine de caryopses sectionnés au rasoir dans la plus grande épaisseur. Dix classes sont utilisées et notées de 0 à 1 ; avec 0, totalement opaque ou grain entièrement crayeux et 1, entièrement translucide.
Caractères de la panicule
Différents caractères de panicule ont été observés :
• Type de panicule peut être fermé ou compact, lâche ou intermédiaire, ouvert
• Longueur de panicule : c’est la distance entre le collet et le sommet de la panicule la plus élevé. Les mesures ont été effectuées quelques jours avant la maturité complète de la panicule. Chaque mesure consiste en une panicule par plante avec 5 pieds différents. Elle est classée en moyenne, pour une longueur de 15 à 20 cm, petite (inférieure à 13 cm) ou longue (20 à 30 cm).
• Ramification secondaire : comptée manuellement au laboratoire à partir de la panicule. Le nombre moyen de ramifications est calculé à partir d’une moyenne obtenue sur 10 panicules.
Caractères physiologiques
Ils sont également enregistrés aux champs ou au laboratoire sur les traits suivants :
• Comportement vis-à-vis de la verse et de l’égrenage noté en quatre classes : très résistant (1) ; moyennement sensible (3) ; sensible (7) ; très sensible (9). La résistance à l’égrenage est évaluée manuellement en faisant subir un choc à la panicule. La verse caractérise les plants tombés au niveau de chaque variété au cours de l’expérimentation. La verse est notée à la phase de maturité, 140 jours après le repiquage.
• Longueur du cycle : déterminée lorsque 85% des panicules sur chaque parcelle présentent la couleur paille. Par la suite, la différence entre cette date et la date de semis détermine la durée du cycle semis- maturité de chaque variété.
Système de nomination vernaculaires des variétés du riz
Ce système se réfère surtout aux dénominations paysannes des variétés, lesquelles apportent dans certains cas des informations sur les qualités du grain. Comme exemple, le « Congo Mangakely » peut se traduire par « Congo avec apex de couleur pourpre ». Le « Congo Mavokely » peut se traduire par « Congo avec apex de couleur rose foncé ».
Caractérisation moléculaire
Collecte des échantillons
La première étape consiste à la collecte et à la conservation des échantillons végétaux. Une très bonne conservation des échantillons permettra d’obtenir une de très bonne qualité d’ADN. Pour leur conservation, les 22 échantillons prélevés à Kianjasoa sont stockés dans des sachets zips mis sous vide avec du silicagel. Ce dernier a pour rôle de déshydrater l’échantillon sans pour autant le sécher (photo 7). Notons que le granulé de silicagel, de couleur bleu vire au rose lorsqu’il est imbibé d’eau issue des échantillons de feuilles. Dans ce cas, il a fallu changer le silicagel si les feuilles contenaient encore de l’eau.
Extraction d’ADN des échantillons du riz Congo
Cette étape consiste à récupérer l’acide nucléique dans un échantillon biologique, nécessaire et indispensable pour une analyse moléculaire. Dans cette étude, l’ADN est l’acide nucléique à extraire dans les échantillons du riz Congo (ANNEXE 5).
Pour pouvoir obtenir une quantité suffisante et une bonne qualité d’ADN du riz dans les échantillons pour les analyses moléculaires, deux méthodes d’extraction d’ADN ont été réalisées sur vingt-deux (22) échantillons mais avec un même protocole d’extraction.
La première méthode sur l’incubation à 72 °C pendant 60 min de la poudre du broyage de feuille de riz n’a abouti à aucun résultat. L’équipe de l’UMR Agap du CIRAD de Montpellier a proposé l’incubation de la poudre à 72 °C pendant 30 min qui a permis d’avoir une bonne qualité et une quantité suffisante d’ADN pour les analyses moléculaires. Cette méthode a été utilisée pour l’extraction d’ADN pour tous les échantillons.
Pour l’extraction d’ADN, le protocole utilisé sur le riz est proposé par l’équipe de l’UMR Agap du CIRAD de Montpellier. Cette extraction a été réalisée sur des jeunes feuilles âgées de 30 jours.
❖ Broyage manuel avant l’extraction.
50 g de feuille de chaque échantillon ont été broyées à l’aide d’un mortier en ajoutant de l’azote liquide et conserver à – 20°C si l’échantillon n’est pas tout de suite utilisé (Photo 8).
❖ Extraction.
Les ADN totaux ont été extraits en utilisant du MATAB, selon la méthode décrite par (RISTERUCCI et al. 2000). La figure 4 résume les étapes d’extraction d’ADN et sa purification.
Ajout d’ADN dans le mix
Le Volume d‘ ADN à utiliser pendant le PCR est de 5μl. Pour le PCR, le volume de chaque réactif est calculé en fonction du nombre d’individus à analyser en ajoutant un témoin positif et un témoin négatif. Ces derniers permettent de valider les réactions PCR. Pour le témoin négatif, un volume d’eau distillée stérile équivalent remplace l’ADN. Par contre, le témoin positif est un individu préalablement testé positif lors d’une précédente PCR.
Lancement de l’amplification du PCR
Le cycle de réaction PCR sert à amplifier le nombre d’ADN. Le programme d’amplification par PCR appliqué est le suivant (tableau 3) :
• La dénaturation à 94°C dure 20 s pour permettre aux 2 brins d’ADN de se séparer. La liaison hydrogène des bases nucléotidiques est brisée à haute température ;
• L’hybridation ou fixation des amorces dure 30 s à 64°C : les amorces se fixent sur les bornes de la séquence à amplifier ;
• L’élongation à 72°C s’effectue en 40 s : cette phase est favorisée par l’ADN polymérase. En allongeant les amorces, les dNTPs se fixent sur les bases complémentaires de la séquence de la matrice.
Ces trois étapes constituent un cycle. La dénaturation initiale se fait à 94°C pendant 1min et l’élongation finale à 68°C pendant 10 min. 25 cycles au total ont été effectués sur TECHNETC-412 Thermal cycler et S1000 System Thermal Cycler, dans lesquelles les différentes étapes de la PCR ont été programmées. Le tableau 4 montre le profil thermique de la PCR (WEISING et al. 2005).
Traitement des données et analyses statistiques
Analyses statistiques des données morphologiques
Les analyses des données morphologiques obtenues ont été effectuées à l’aide du logiciel XLSTAT 2015. Les données ont été soumises à une analyse de variance (ANOVA). La comparaison des moyennes a été réalisée à l’aide du test LSD : Least Significant Difference au seuil α= 5%).
La lecture des résultats de l’analyse de variance s’est faite comme suit :
• Les différences sont significatives lorsque le niveau de probabilité (P) est inférieur au niveau de probabilité théorique au risque (α= 5%) : P ‹ 0,05 ;
• Non significative : P › 0,05.
Lorsqu’une différence significative est observée, les analyses continuent avec les comparaisons multiples en effectuant le test de la plus petite différence significative (ppds) en vue d’identifier les variétés qui diffèrent significativement les unes des autres (AKEDRIN et al. 2011).
Analyse du Composante Principale (ACP) et Analyse Factorielle Ascendante (AFC)
Les douze paramètres morphologiques étudiés ont été soumis à une analyse en composante principale (ACP) et une analyse factorielle ascendante (AFC). Ces techniques ont permis de faire une étude des projections de nuage. Cette projection a été faite dans un espace de dimension plus faible qui était représentable sous forme de graphique. Cette représentation était donc approximative mais la déformation était minimisée. Le principe de ces analyses consiste à réduire « m » variables initiales (observées ou mesurées) liées ou inter corrélées en « p » nouvelles indépendantes appelées FACTEURS pour (pour AFC) ou COMPOSANTES PRINCIPALES (pour ACP). L’objectif de cette analyse est de déterminer les axes déterminant des plans de projection pour la visualisation des phénomènes. Cette détermination consiste à extraire les valeurs propres de la matrice des corrélations entre les variables par la méthode de diagonalisation. Les vecteurs propres représentant un fort pourcentage de variance constituent les axes factoriels à considérer (DUBY et ROBIN, 2006).
Longueur de la panicule
Connaître la longueur de la panicule est nécessaire pour distinguer les différentes variétés. L’analyse de variance (p‹0,05) a montré des différences significatives entre les 22 échantillons étudiés. Les résultats obtenus ont permis d’identifier 5 groupes homogènes au niveau de la longueur de la panicule des échantillons (Figure 8) :
– Le premier groupe est composé de CMav1, CMan2, CMav2, CMav3, CMav4, CMav5, CMav6 et CMav7. Leur longueur varie de 20,60 cm à 21,80 cm en moyenne.
– Le deuxième groupe est constitué de CMan1, CP1, CP2, CP3 et le Témoin. Leur longueur est de 20,40 cm.
– Le troisième groupe ne comprend qu’une seule variété : le CB2 avec 16,20 cm de longueur.
– Le quatrième groupe est constitué seulement de la variété CA avec une longueur de 17,40 cm.
– Le cinquième groupe contient le CB1, CB3, CB4, CB5, CB6, CB7 et le CB8. Leur longueur est de 15,20 cm en moyenne.
Caractères qualitatifs
Sur l’ensemble des échantillons étudiés regroupés en 5 variétés avec le Témoin, les caractères les plus proches sont la couleur de la gaine foliaire, la translucidité du caryopse, le taux d’égrenage à maturité, le type de panicule, l’estimation de la stérilité, l’exertion paniculaire, la couleur de la ligule, la couleur des auricules, la forme de la ligule, l’aristation, le caryopse et la ramification secondaire (ANNEXE 8). Pour la pubescence de feuille au sein de la population, presque toutes les variétés présentent des feuilles lisses sauf le CA qui a une feuille pubescente. La feuille paniculaire était semi-érigée pour la plupart des variétés.
En ce qui concerne la verse, l’aristation et la ramification secondaire, les observations sur le terrain ont permis de montrer qu’aucune variation n’a été observée sur l’ensemble de 5 variétés qui n’ont pas été affectées par la verse. Leur aristation est nulle et la ramification secondaire est absente. Pendant l’observation de la couleur du stigmate, l’entre-noeud central, la feuille, la ligule, l’apex maturité, des glumelles à maturité, des glumes à maturité sur le terrain, elles sont toutes de même couleur sauf le caryopse et l’apex à maturité. Le premier caryopse est divisé en deux groupes. Le premier groupe ne comprend qu’un seul type de variété qui est le CB de couleur brun claire alors que le deuxième groupe est composé de 4 types de variétés à savoir le CA, CMav, CMan, CP de couleur brun. La deuxième (apex à maturité) est aussi divisée en deux groupes. Le groupe 1 est constitué par la variété CMan avec une couleur pourpre et le groupe 2 est formé par les autres variétés qui sont de couleur de paille.
Longueur du cycle du riz
Les résultats de l’analyse de variance (p‹0,05) ont montré des différences significatives entre les 22 échantillons étudiés. Les résultats obtenus ont permis d’identifier 4 groupes homogènes (Figure 16):
– Le premier groupe ne comprend qu’une variété le CMav. Dans ce groupe, le cycle végétatif est de 158 jours.
– Le deuxième groupe est constitué par le CB et le Témoin avec 154 jours en moyenne
– Le troisième : le CA dont la moyenne est de 148 jours
– Le dernier : CMan et CP avec 143 jours en moyenne.
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Table des matières
Généralités
1. Riz
1.1 Systématique
1.2 Morphologie
1.3 Physiologie
2. Génome Chloroplastique
3. Techniques moléculaires
3.1 Electrophorèse
3.2 Réaction de polymérisation en chaine PCR
3.3 Technique de séquençage selon la méthode de SANGER
Matériels et Méthodes
1. Matériels biologiques
2. Conditions de réalisation de l’expérimentation : Milieu d’étude
2.1 Région Itasy
2.2 Région Bongolava
2.2.1 Situation climatique
2.2.2 Caractères pédologiques
3. Expérimentation au champ
3.1 Collecte des échantillons de matériels végétales
3.2 Mise en place de l’expérimentation
4. Méthodologie
4.1 Suivis en cours de culture à chaque stade
4.2 Caractères morphologiques
4.2.1 Caractères de la plante
4.2.2 Caractères du feuillage
4.2.3 Caractères des grains
4.2.4 Caractères de la panicule
4.3 Caractères physiologiques
4.4 Système de nomination vernaculaires des variétés du riz
4.5 Caractérisation moléculaire
4.5.1 Collecte des échantillons
4.5.2 Extraction d’ADN des échantillons du riz Congo
4.5.3 Isolement, purification et quantification de l’ADN
4.5.4 Analyse moléculaire par Polymerase Chain Reaction (PCR)
4.5.4.1 Préparation du mix
4.5.4.2 Ajout d’ADN dans le mix
4.5.4.3 Lancement de l’amplification du PCR
4.5.5 Electrophorése
4.5.6 Méthode de séquençage
5. Traitement des données et analyses statistiques
5.1 Analyses statistiques des données morphologiques
5.1.1 Analyse du Composante Principale (ACP) et Analyse Factorielle Ascendante (AFC) 22
5.1.2 Analyse des corrélations entre les caractères
5.2 Analyse des données moléculaires : Structure de la population
Résultats et Interprétations
1. Caractérisations morphologiques
1.1 Caractères quantitatifs
1.1.1 Poids de 100 grains
1.1.2 Hauteurs des plants
1.1.3. Diamètre de la paille
1.1.3 Longueur de la panicule
1.1.4 Longueur de la glume
1.1.5 Longueur des grains
1.1.6 Largeur des grains
1.1.7 Longueur de la ligule
1.1.8 Longueur du limbe
1.1.9 Nombre total de talles
1.1.10 Nombre de talle fertile
1.2 Caractères qualitatifs
2. Longueur du cycle du riz
3. Corrélation entre les caractères morphologiques et physiologiques des plants
4. Variable quantitative des caractères morphologiques et physiologiques du l’axe AFC
5. Caractérisation moléculaire
5.1 Vérification de l’ADN sur le gel d’agarose
5.2 Résultats du séquençage du produit PCR
Structure des populations : Regroupement selon le logiciel DARwin
Discussions
1. Caractérisation morphologique
1.1 Caractères quantitatifs
1.1.1 Poids de 100 grains
1.1.2 Hauteur du plant et diamètre de la paille
1.1.3 Longueur de la panicule et longueur de la glume
1.1.4 Longueur et largeur des grains
1.1.5 Longueur de la ligule et longueur du limbe
1.1.6 Nombre de talles total et de talles fertiles
1.2 Caractères qualitatifs
2. Longueur du cycle du riz
3. Caractérisation moléculaire
Conclusion et Perspectives
Références bibliographiques
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