Soutenance mémoire
Déroulement de l’étude immuno-moléculaire
Pour tous les patients, le statut de la mutation d’IDH1R132H a été recherché en immunohistochimie. En l’absence de mutation IDH1R132H, comme préconisé par la classification de l’OMS 2016, les mutations minoritaires d’IDH1/2 ont été recherchées en biologie moléculaire pour tous les patients de moins de 55 ans. En parallèle, le statut de l’ATRX a été recherché en immunohistochimie pour les patients dont la tumeur gliale n’avait pas une morphologie typique de glioblastome.
Pour les cas IDH mutés, une recherche de la codélétion 1p/19q ainsi que du statut de l’ATRX en immunohistochimie a été effectuée.
Etude immunohistochimique
Technique de l’étude immunohistochimique
L’étude immunohistochimique a été réalisée sur automate de coloration BenchMark XT (VentanaMedical Systems Inc, Tucson, AZ) avec les anticorps suivants : – Anticorps anti-IDH1R132H (clone H09, Dilution 1/20 e , Clinisciences) – Anticorps anti-ATRX (clone polyclonal, Dilution 1/200 e , SIGMA)
Les anticorps fixés ont été détectés avec un complexe avidine-biotine-peroxydase et un kit de Ventana avec du réactif 3,3′-diaminobenzidine (DAB).
Lorsque les résultats de l’immunohistochimie IDH1R132H étaient négatifs ou peu fiables, le statut des mutations IDH1 et IDH2 a été abordé par séquençage direct à l’aide de méthode de Sanger.
Biologie moléculaire
Nous avons analysé la codélétion des chromosomes 1p/19q par perte d’hétérozygotie (LOH = loss of heterozygosity) ou par hybridation in situ en fluorescence (FISH).
LOH (loss of heterozygosity)
Une coupe colorée à l’HES a été évaluée par une neuropathologiste, qui a marqué sur cette coupe la zone tumorale contenant au minimum 70% de cellules tumorales. Pour rechercher la codélétion 1p/19q, de l’ADN génomique (ADNg) a été extrait du tissu tumoral et du sang total utilisant le kit QiaAmp DNA mini (Qiagen SA, Courtaboeuf, France) selon les instructions du fabricant. Cent nanogrammes d’ADNg normal et tumoral ont été utilisés comme matrice pour l’amplification en chaîne par polymérase (polymerase chain reaction, PCR) en présence de 1μl d’amorce sens et antisens (20pmol/μL), 1μL MgCl2 (25μM), 1μLdNTP (10μM), 0.1μL Hot Start Taq (Qiagen), et 2.5μL Buffer 10x (Qiagen), dans un volume final de 25μL. Les amorces sens et anti-sens utilisées sont mentionnées en annexe
Les conditions de l’amplification étaient conformes à celles précisées par le fabricant de l’ADN-polymérase. Pour vérifier l’absence de contamination, des contrôles négatifs (sans ADN) ont été réalisés. Les produits de la PCR ont été séparés par électrophorèse sur geld’agarose à 2% pendant 20 minutes à 130V.
La LOH sur les chromosomes 1p, 19q a été évaluée à l’aide d’une analyse microsatellite. De multiples marqueurs microsatellites polymorphes ont été utilisés pour effectuer une analyse approfondie de ces régions chromosomiques. Nous avons utilisé 12 marqueurs microsatellites dans cette analyse : D1S206, D1S226, D1S476, D1S2734, D1S199, et D1S214 pour 1p et D19S254, D19S206, D19S219, D19S418, D19S409 etD19S433 pour 19 q). L’analyse des fragments obtenus se fait en comparaison des profils ’tissu sain’ et ’tissu tumoral’ pour chaque microsatellite.
FISH (hybridation in situ en fluorescence)
Des coupes représentatives non colorées de 3 à 5 µm d’épaisseur ont été découpées depuis des blocs inclus en paraffine, étalées sur des lames Superfrost et séchées à température ambiante. Ces coupes ont été déparaffinées par 2 bains successifs d’HistoClear™ de 10 minutes, réhydratées dans des bains successifs d’éthanol à 100%, 80%, 70% pendant 3 minutes et lavées dans du tampon de lavage Dako pendant 3 min utes. Les lames ont été ensuite immergées pendant 15 minutes dans la solution de prétraitement Dako chauffée à 97°C, puis refroidies à l’air pendant 15 minutes. Les coupes ont ensuite été digérées dans une solution de pepsine Dako pendant 15 minutes à 37°C, lavées avec le tampon de lavage Dako, déshydratées dans des bains successifs d’éthanol à 70%, 80% et 100% pendant 2 minutes et séchées à l’air. Les sondes ont été préparées selon les instructions du fabricant. Les sondes utilisées étaient : Sonde ZytoLight SPEC 19q13/19p13 zytovision et Sonde ZytoLight SPEC 1p36/1q25 zytovision. 5 µl du mélange a été déposé sur 20x20mm de la surface de la lame puis scellé avec du rubber cement. Les lames scellées ont été placées sur la plaque chauffante de l’appareil à hybridation et le programme correspondant à la sonde a été lancé. Après l’hybridation, toutes les lames ont été lavées dans du tampon de lavage stringent Dako chauffée à 65°C (±2) pendant 10 minutes, puis déshydratées dans des bains successifs d’éthanol à 70%, 80% et 100% pendant 2 minutes et séchées verticalement à l’air et à l’abri de la lumière. Pour la contre coloration, 1 à 3 µl de milieu de montage/DAPI (fourni avec le kit Dako) a été appliqué. Les lames ont été ensuite montées. Il a fallu respecter un temps d’incubation d’au moins 2 heures au frigo avant l’observation. Puis les lames ont été observées au microscope à fluorescence. La lecture se fait sur 100 cellules tumorales sur lesquelles on compte le nombre de signaux rouge et vert. Le bras court du chromosome 1 et le bras long du chromosome 19, s’hybrident avec la sonde rouge. Le bras long du chromosome 1 et le bras court du chromosome 19 s’hybrident avec la sonde verte. Une cellule est considéréecodélétée si elle a deux signaux verts et un seul signal rouge.
Analyses statistiques
La collection des données a été effectuée sur tableur informatique Excel (version 14.0.7194.5000). L’étude de survie (analyses et graphiques) a été réalisée avec le logiciel R (version 3.5.0). Les courbes de survie globale ont pris en considération comme événement la survenue d’un décès de toutes causes confondues et ont été construites par la méthode de Kaplan-Meier. Pour comparer les courbes de survie des différents groupes, un test de
Log-rank a été utilisé. Une analyse multivariée a été réalisée selon un modèle de Cox, après vérification de l’hypothèse d’homogénéité des risques instantanés pour chaque covariable .
Cette vérification a été réalisée par analyse des résidus de Schoenfield. Pour chaque test statistique réalisé, le risque alpha de premier ordre a été fixé à 0.05 et les hypothèses ontété formulées de manière bilatérale.
Résultats
Le diagramme de flux de l’étude
En se basant sur la nouvelle classification histomoléculaire de l’OMS 2016, sur les 109 patients sélectionnés pour l’étude, 105 patients ont été reclassés et 4 patients n’ont pas pu être reclassés. Sur les 105 patients reclassés, 8 patients étaient en récidive au moment de leur inclusion dans l’étude. Finalement, 97 patients ont été retenus pour l’analyse statistique.
La figure 2, montre le diagramme de flux de l’étude.
Les caractéristiques des patients
Au total, 109 patients atteints de gliome diffus de grade II à IV opérés entre 1990 à 2014 ont été inclus dans cette étude. L’âge médian au diagnostic était de 50,25 ans. 38,53% des patients ont bénéficié d’une exérèse chirurgicale complète et le traitement de la première ligne correspondait à l’association de la chimiothérapie et de la radiothérapie pour 41,28 % des patients. Plus de la moitié des patients ont récidivé malgré leur traitement initial (57,79%). 65,13 % des patients étaient décédés. La médiane de survie globale de tous les patients était de 5,11 ans (Figure 3).
Les gliomes diffus OMS 2007 reclassés selon l’OMS 2016
Ces 109 patients étaient classifiés comme suit : Astrocytome diffus (3), oligodendrogliome diffus (17), oligoastrocytome (13), astrocytome anaplasique (5), oligodendrogliome anaplasique (19), oligoastrocytome anaplasique (9), glioblastome (41) et gliomatose cérébrale (2). 105 patients ont été reclassés (Figure 4).
Analyse multivarié (modèles de Cox)
Une étude de survie multivariée a été réalisée par modèle de Cox pour chacune des deux classifications OMS 2007 et 2016. Préalablement à l’interprétation de ces deux modèles, l’hypothèse de l’homogénéité des survies instantanées (essentielle pour obtenir un modèle de Cox mathématiquement valide) a été vérifiée par analyse des résidus de Schoenfield (p-value > 0,05 pour chaque résidu de chaque covariable des deux modèles de Cox).
Discussion
Mutation d’IDH et codélétion 1p/19q, des altérations moléculaires robustes
Dans cette série, nous avons reclassé 96% des gliomes diffus. Sur les 113 gliomes initialement retrouvés, seul 4 n’ont pas pu être relus faute de matériel suffisant et répondent à la définition des gliomes diffus NOS.
Si dans notre expérience, la recherche par séquençage de mutation IDH a pu être mise en défaut, l’étude immunohistochimique s’avère fiable y compris sur les blocs de paraffine conservés depuis plus de 20 ans. La recherche de la codélétion 1p/19q réalisée dans 18 cas par technique de FISH a été interprétable dans 90 %.
Valeur du statut d’ATRX en immunohistochimie
Finalement, l’étude immunohistochimique de l’expression d’ATRX s’est avérée la moins robuste. En effet la perte d’expression nécessite un pourcentage de cellules tumorales suffisantes avec une validité des contrôles internes (Marquage des neurones, cellules endothéliales). Si le diagnostic d’astrocytome repose aujourd’hui sur la présence d’une mutation d’IDH sans codélétion 1p/19q, la perte d’expression d’ATRX est reconnue comme suffisante et ne nécessite pas la recherche de codélétion par des techniques de biologie moléculaire. Dans le groupe des oligodendrogliomes, comme attendu la codélétion ne s’est pas accompagnée d’une perte d’expression d’ATRX. Par contre, dans le groupe des patients reclassés en astrocytomes IDH mut de grade II ou III, l’expression nucléaire d’ATRX s’est avérée conservée dans 20% des cas (5/25). Il est rapporté dans la littérature, qu’une minorité des astrocytomes IDH mut , peuvent ne pas perdre l’ATRX.
D’après l’étude menée par l’équipe de Reuss (14), 3% des astrocytomes IDH mut de grade II ou III, ne perdent pas l’expression nucléaire d’ATRX en immunohistochimie.
L’expression nucléaire d’ATRX en immunohistochimie n’est pas toujours corrélée à la biologie moléculaire. En effet, ces tumeurs peuvent porter la mutation d’ATRX sans perte d’expression nucléaire en immunohistochimie (mutations faux-sens) (14). Il est également possible que l’expression de la protéine d’ATRX soit régulée par d’autres mécanismes que les mutations du gène d’ATRX, comme la méthylation de son promoteur. Ainsi devant un astrocytome IDH mut , il faut avant tout s’assurer de l’a bsence de codélétion 1p/19q et si possible rechercher la mutation d’ATRX en biologie moléculaire.
Dans un astrocytome IDH mut , en l’absence de perte d’expression d’ATRX, une expression nucléaire de P53 élevée plaide en faveur du diagnostic d’astrocytome IDH mut.
Un patient présentait un glioblastome IDH wt avec perte d’expression nucléaire d’ATRX. Ce rare phénotype moléculaire a été déjà rapporté par l’équipe E.Tabouret et al. (16). Il est intéressant de s’assurer du bon déroulement de l’étude moléculaire. Chez notre patient, les mutations rares d’IDH étaient recherchées en 2007. Aujourd’hui les méthodes moléculaires sont plus sensibles. Ainsi nous avons recontrôlé la technique (Dr R. SAFFROY, Plateforme de bio-pathologie des tumeurs – Groupe hospitalier Paul Brousse-Bicêtre-Antoine Beclère) et confirmé la négativité des mutations rares d’IDH1/2.
La perte d’ATRX n’est pas pathognomonique du diagnostic d’astrocytome IDH mut . En effet, d’autres gliomes sans mutations IDH peuvent présenter une perte d’expressiond’ATRX.
Parmi les tumeurs gliales de morphologie anaplasique ATRX muté, nous pouvons évoquer.
Les glioblastomes avec instabilité microsatellitaire des gènes MMR
Notre patient avait un antécédent d’adénocarcinome colique. Ceci était notre première hypothèse. Un possible syndrome de Turcot a été évoqué. Le syndrome de Turcot est un syndrome héréditaire rare associant une tumeur du système nerveux central et une prédisposition héréditaire au cancer colorectal (Polypose adénomateuse familiale ou syndrome HNPCC (Hereditary Non Polyposis Colorectal Cancer) (17). Par conséquent, une recherche de l’instabilité microsatellitaire des gènes MMR (Mismatch Repair) a été effectuée en immunohistochimie. Parmi les différentes protéines MMR (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2), il y avait une perte d’expression de la protéine MSH6 en immunohistochimie. Une confirmation en biologie moléculaire (Dr R. SAFFROY, Plateforme de bio-pathologie des tumeurs-Groupe hospitalier Paul Brousse-Bicêtre-Antoine Beclère) a été demandée mais n’a pas trouvé de mutation. Devant cette discordance et comme ces tumeurs présentent des profils d’hypermutation de l’ADN (18), il est intéressant de réaliser un séquençage du whole exome. Une des particularités du syndrome de Turcot est la survenue précoce de la tumeur du SNC, or notre patient avait 64 ans au moment du diagnostic.
Les gliomes diffus de la ligne médiane avec la mutation H3K27M
10 à 15% de mutation d’ATRX dans les gliomes diffus de la ligne médiane H3K27M muté est rapportée dans la littérature (7).
3- Les glioblastomes pédiatriques (Mutations G34R/V, ATRX et P53)
4- Les astrocytomes pilocytiques ou d’aspect piloïde avec signes d’anaplasie.
Patients non reclassés
Dans notre étude, nous n’avons pas reclassé 4 patients.
Tous les patients avaient une tumeur hémisphérique sus-tentorielle et avaient moins de 55 ans au moment du diagnostic (Tableau 2).
Sur le plan moléculaire, aucun cas n’avait les mutations des gènes IDH1/2. L’absence de mutation des gènes IDH est inhabituelle pour les gliomes diffus de grade II et III.
Ce groupe a fait depuis la publication de la classification de l’OMS 2016 l’objet de nombreux travaux.
L’équipe de Reuss et al. (14) a étudié une série de 160 tumeurs astrocytaires IDH wt (120 astrocytomes anaplasiques de grade III et 40 astrocytomes de grade II) et a essayé de les reclasser par leurs altérations moléculaires (le profil de méthylation (G-CIMP) et la variabilité du nombre de copie). 124/160 (78%) des tumeurs ont été reclassés en tant qu’équivalent moléculaire du glioblastome conventionnel et 15/160 (9%) en tant que glioblastome-H3F3A muté. 13/160 (8%) présentaient un profil de méthylation distinct qui était le plus similaire à celui des glioblastomes H3K27M muté, cependant, il manquait la mutation H3F3A. Ce groupe a montré une tendance vers un pronostic plus favorable. 7 tumeurs parmi les 40 astrocytomes IDH wtde grade II, ne comprenaient aucune altération ou des altérations chromosomiques mineures ou des trisomies. Ces tumeurs avaient été considérées appartenir aux groupes des tumeurs neuroépithéliales de bas grade. Selon c es auteurs, 80% des tumeurs IDH wt sont le plus souvent des glioblastomes ou des glioblastomes H3F3A mutés et une petite fraction représente les tumeurs gliales de bas grade comme les astrocytomes pilocytiques ou les astrocytomes pléomorphes et les tumeurs glioneuronales.
L’équipe de Hasselblatt et al. (19) a étudié récemment une série de 212 astrocytomes diffus de grade II. 25/212 patients ne portaient pas les mutations des gènes d’IDH1/2 et n’avaient pas de prise de contraste en imagerie. Sur ces 25 patients IDH wt , le profil de méthylation de l’ADN et la variabilité du nombre de copie ont été étudiés. 10/25 des astrocytomes IDHwtavaient un profil de méthylation de l’ADN semblable aux glioblastomes IDH wt et ont été reclassés en glioblastome, IDH wt . 7 autres cas n’ont pas pu être reclassés en utilisant l’analyse du méthylome, mais ont montré les caractéristiques du glioblastome moléculaire (Gain du 7p, perte du 10q). Les autres astrocytomes IDH wt ont été reclassés en gliome diffus de la ligne médiane H3 K27M muté, astrocytome diffus IDH mut, astrocytome pilocytique ou en tissu cérébral réactif ou normal (N=8). Selon ces auteurs, la plupart des astrocytomes IDH wt présentant des caractéristiques histologiques et radiologiques d’un astrocytome diffus de grade II présentent des caractéristiques moléculaires et cliniques de gliome de haut grade et peuvent représenter un stade précoce de glioblastome primaire.
Nous n’avons pas pu rechercher l’ensemble des altérations moléculaires chez nos patients.
Plusieurs diagnostics différentiels sont à évoquer chez ces patients :
– Les tumeurs glioneuronales rentrant dans le cadre des gliomes circonscrits (gangliogliome, tumeur dysembryoplasique neuroépithéliale). Dans l’hypothèse d’un gangliogliome, une recherche de la mutation V600E du gène BRAF et dans l’hypothèse d’une tumeur dysembryoplasique neuroépithéliale, des anomalies de FGFR1 (mutations, duplications) pourraient être recherchées. L’imagerie a été revue avec le Dr L. Bekaert, elle n’était pas en faveur d’un gliome circonscrit. Aucun marquage extravasculaire de CD34 n’a été trouvé, ni de mutation BRAF V600E en biologie moléculaire.
– La gliose réactive fait également partie des diagnostics différentiels. Le double immunomarquage par ATRX/GFAP permet de faire la distinction entre une tumeur astrocytaire et une gliose réactive. Dans une tumeur astrocytaire on s’attend à avoir une perte d’ATRX et une GFAP positive. Dans une gliose réactive, nous aurons le double immunomarquage ATRX/GFAP (20). – Chez le 4 e patient, devant des signes d’anaplasie en histologie, dans l’hypothèse d’un éventuel glioblastome, l’amplification de l’EGFR et l’altération du promoteur de hTERT ont été recherchées et étaient négatifs.
– Un glioblastome moléculaire. Mais nous n’avons pas pu compléter l’étude moléculaire dans ce sens. Le 4 e patient, inclus dans l’étude POLA avait bénéficié d’une CGH array (Puce d’hybridation génomique comparative) qui ne montrait pas de gain du 7pni de perte du 10p.
Dans ces situations de discordance histologique, immunohistochimique et moléculaire, le diagnostic de gliome diffus IDH wt , NEC (Not Elsewhere Classified) pourrait être évoqué. Constatant, un pourcentage de cas pour lesquels, on note une discordance histo-moléculaire, le cIMPACT-NOW (le Consortium d’information sur les approches moléculaires et pratiques de la taxonomie des tumeurs du SNC – non officiel de l’OMS) a été créé pour évaluer et recommander des changements proposés aux futures classifications des tumeurs du SNC. Depuis sa création en 2016, cIMPACT a réuni trois comités de travail pour relever les défis actuels en matière de classification et de classement. La Commission de travail 3 a introduit le terme NEC. Les diagnostics NEC reflètent les situations dans lesquelles les tests nécessaires pour établir un diagnostic OMS ont été réalisés et sont disponibles, mais dans lesquels ces résultats ne permettent pas d’établir un diagnostic spécifique de l’OMS. Cela se produit généralement lorsque les caractéristiques histologiques, immunohistochimiques et / ou moléculaires ne concordent pas (21). Cependant, il s’agit d’un diagnostic d’élimination et doit être évoqué avec précaution.
Le tableau 9, montre quelques situations dans lesquelles les diagnostics NEC pourraient être utilisés chez un adulte atteint d’un gliome diffus de grade II (Les statuts IDHet de la codélétion 1p/19q sont utilisés pour le diagnostic) :
|
Table des matières
I. Introduction
A. Les gènes IDH (isocitrate deshydrogénase)
B. La codélétion 1p/19q
C. Gène TP53
D. Gène ATRX
E. Objectifs
II. Matériel et Méthodes
A. Type d’étude
B. Sélection des patients
1. Critères d’inclusion
2. Recueil des données cliniques
C. Déroulement de l’étude immuno-moléculaire
D. Etude immunohistochimique
1. Technique de l’étude immunohistochimique
E. Biologie moléculaire
1. LOH (loss of heterozygosity)
2. FISH (hybridation in situ en fluorescence)
3. Mutations IDH1/2
F. Analyses statistiques
III. Résultats
A. Le diagramme de flux de l’étude
B. Les caractéristiques des patients
C. Les gliomes diffus OMS 2007 reclassés selon l’OMS 2016
1. Les données moléculaires
2. Reclassification des oligodendrogliomes
3. Reclassification des astrocytomes
4. Reclassification des oligoastrocytomes
5. Reclassification des glioblastomes
6. Gliomatoses cérébrales
D. Les gliomes diffus OMS 2007 non reclassés
E. Analyses de survie
1. Courbes de survie globale
2. Analyse univariée (comparaisons par paires)
a) Classification OMS 2007
b) Classification OMS 2016
3. Analyse multivarié (modèles de Cox)
4. Courbe de survie globale de 3 groupes de patients (Gliomes IDH wt , gliomes IDH mut , non codélétés et gliomes IDH mutet codélétés)
a) Analyse univariée (comparaisons par paires)
IV. Discussion
A. Mutation d’IDH et codélétion 1p/19q, des altérations moléculaires robustes
B. Valeur du statut d’ATRX en immunohistochimie
C. Patients non reclassés
D. L’impact pronostique de la classification de l’OMS 2016
E. Perspectives
V. Conclusion
VI. Bibliographie
