Taxonomie et zones d’origine des bananiers

Taxonomie et zones d’origine des bananiers

Plantes

Les échantillons foliaires utilisés pour ce travail ont été prélevés aléatoirement dans différentes zones de production bananière de Guadeloupe et conservés à –80°C avant leur analyse. Le génotype des plantes échantillonnées, la présence de cochenilles sur leurs feuilles ou leur pseudo-tronc et la présence éventuelle de symptômes liés au BSD ont été notés (voir tableau joint en annexe).
La position géographique des lieux d‘échantillonnage a été déterminée avec un marge d’erreur moyenne de 15 mètres, au moyen d’un système GPS portable (E Trex Vista Garmin, Kansas City, Etats Unis). L’altitude des lieux d’échantillonnage a pour sa part été déterminée à partir des valeurs de longitude et latitude, à l’aide des cartes IGN au 1 :25000 couvrant l’ensemble de la Guadeloupe et du logiciel Antilles Carto Explorer 3 version 3.01 (Bayo, Auxerre, France).

Détection du BSV par multiplex-immunocapture-PCR (M-IC-PCR)

Pour la détection du BSV, 0,5g de feuille ont été broyés dans 5 mL de tampon de broyage (2% polyvinylpyrrolidone 40, 0,2% sodium sulfite et 0,2% serumalbumine bovine) préparé dans du PBS Tween (136mM NaCl, 1,4mM Kh2PO4 , 2,6mM KCl, 8mM Na2HPO4, 0,05% Tween-20, pH 7,4]), dans des sachets de broyage en plastique (Biorad Phytodiagnostics, Marnes-la-Coquette, France). Un mL d’extrait de plante a ensuite été transféré dans des microtubes et clarifié par centrifugation pendant 2 minutes à 21000 rpm à température ambiante. Des microtubes ou des microplaques de 96 puits en polypropylène ont été coatés durant une nuit à 4°C à l’aide de 25l d’IgG purifiées à partir d’un antiserum anti-BSV polyclonal (Ndowora et al, 1998) et diluées à 2g/mL dans un tampon carbonate (15mM de sodium carbonate, 34mM sodium bicarbonate, pH 9,6), puis lavés trois fois avec une solution de PBS Tween. Les particules virales présentes dans les échantillons infectés ont été piégées par immunocapture. Pour cela, 25L d’extrait clarifié de plantes ont été incubés pendant 3 heures à température ambiante dans des microtubes ou des puits coatés. Après 4 lavages avec 100L de PBS Tween et un lavage avec 100L d’eau stérile, une PCR a été réalisée à l’aide d’amorces espèces spécifiques (voir tableau 2), afin d’amplifier la partie du génome viral encapsidé correspondant aux domaines RT/Rnase H de la polyprotéine codée par l’ORF3 (voir figure 8). Des amorces microsatellites spécifiques des génomes Musa (Lagoda et al, 1998) ont également été utilisées dans cette réaction de PCR (voir tableau 2), afin de détecter d’éventuelles contaminations par de l’ADN génomique de M. balbisiana, qui héberge des séquences EPRV susceptibles d’être amplifiées par les amorces espèce spécifiques BSV et de fausser le diagnostic (Le Provost et al., 2006). Le mélange réactionnel de PCR de 25L contient 20mM Tris HCl (pH 8,4), 50mM KCl, 100mM de chaque dNTP, 1,5mM MgCl2, 10mol de chaque amorce et 1U de Taq DNA polymérase (Eurogentec, Seraing, Belgique). Les conditions d’amplification par PCR sont : une étape de dénaturation initiale de 94°C pendant 3min, puis 35 cycles (94°C pendant 30sec, 58°C pendant 30sec, 72°C pendant 1min) suivis d’une étape d’élongation finale de 5min à 72°C. 12L de produits d’amplification ont ensuite été analysés par électrophorèse en gel d’agarose à 1,5% dans 0,5x TBE (45mM Tris-borate, 1mM, 1mM EDTA, pH 8,0) et visualisation sous lumière UV après coloration au bromure d’ethidium.

Détection du BVX par reverse transcription nested PCR utilisant des amorces polyvalentes dégénérées (PDO-RT-nested PCR)

Un test de détection du BVX par PDO RT-nested PCR à partir d’ARN total de plantes a été mis au point (Teycheney et al., manuscrit en préparation). Les amorces dégénérées PDOF1i, PDO-R3i et PDO-R4i ciblant les domaines conservés I, VI et VII de l’ARN polymérase ARN dépendante (RdRp) codée par l’ORF1 des Flexiviridae et décrites par Foissac et al. (2005) ont été utilisées pour l’étape de RT-PCR, selon le protocole décrit par ces auteurs (figure 9B).
Deux amorces spécifiques du BVX, BVX1 et BVX3, ciblant les domaines II et VI de la RdRp codée par l’ORF1 du BVX ont été dessinées à partir de la séquence partielle de l’ARN génomique de ce virus (Teycheney et al., 2005a) et utilisées pour la réaction de nested PCR (figure 9C). Le mélange réactionnel contient 1L du milieu réactionnel de PDO-RT-PCR dans 10mM Tris-HCl [pH 8,8], 50mM KCl, 0,19% TritonX-100, 4mM MgCl2, 200M de chaque dNTP, 1M de chaque amorce et 1 unité de Taq polymerase. Les conditions d’amplification PCR sont : une étape de dénaturation initiale de 3 min à 94°C, puis 30 cycles (95°C pendant 30s, 53°C pendant 30s et 72°C pendant 30s) suivis d’une phase d’élongation finale de 5min à 72°C. 12L de produits d’amplification ont été analysés par électrophorèse en gel d’agarose comme décrit plus haut.
Afin d’éliminer l’étape de purification des ARN totaux, qui est longue et fastidieuse, des essais d’optimisation du protocole de détection ont été réalisées. Pour cela, les particules de BVX ont été piégées sur la paroi de microtubes ou de microplaques 96 puits par immunocapture ou par fixation directe, préalablement à la réaction de PDO-RT-nested PCR.

IC-PDO-RT-nested PCR

L’immunocapture a été réalisée à l’aide d’un antiserum polyclonal de lapin dirigé contre des particules purifiées de BanMMV. Ce sérum permet le piégeage de particules virales de BVX (Teycheney et al. 2005a), avec une efficacité qui n’a pas été déterminée. Des plaques de 96 puits stériles en polypropylène et garanties RNAse-free (Starlab, Paris, France) ont été coatées pendant 4h à 37°C ou toute une nuit à 4°C avec 50L d’IgG purifiées à partir de cet antiserum anti-BanMMV et diluées à 1g/mL dans le tampon coating décrit plus haut. Les puits ou les tubes ont ensuite été lavés trois fois avec 100L de PBS Tween et une fois avec 100 μL d’eau distillée stérile RNAse-free, puis séchés. Les plaques coatées ont été utilisées directement ou stockées à –20°C pour une utilisation ultérieure.
Des extraits de plantes ont été préparés en broyant dans des sachets plastiques de broyage (Biorad Phytodiagnostics, Marnes-la-Coquette, France) 0,5g de feuilles dans 5mL de tampon de broyage (2% polyvinylpyrrolidone 40, 20mM d’acide diethyldithiocarbamique) préparé dans du PBS Tween. Les extraits ont été clarifiés comme décrit plus haut puis 50L d’extraits clarifiés ont été déposés dans les plaques ou les tubes coatés, et incubés à 4°C durant une nuit. Les plaques ou les tubes ont ensuite été lavés quatre fois avec 100L de PBS Tween et une fois avec 100L d’eau distillée stérile RNAse-free puis séchés brièvement. Les particules virales ont alors été dénaturées par la chaleur avant de réaliser la RT-PCR. Pour cela, 15L d’eau stérile RNAse-free (Sigma, St Quentin Fallavier, France) ont été ajoutés à chaque puits ou tube, incubés pendant 2min à 95°C dans un thermocycleur (Hybaid, Royaume-Uni) puis placés immédiatement dans la glace pendant 1-2min.

DB-PDO-RT-nested PCR (direct binding polyvalent degenerate oligonucleotides reverse transcription nested PCR)

Pour la DB-PDO-RT-nested PCR, 50L des extraits de plantes préparés pour l’IC-PDO-RTnested PCR ont été déposé dans des plaques ou microtubes non coatés et incubés à 4°C pendant une nuit. Les lavages, réactions de PDO-RT-nested PCR et l’analyse des produits de nested PCR par électrophorèse en gel d’agarose ont été réalisés comme décrit précédemment.

Analyse des séquences nucléotidiques

Une sélection de produits d’amplification obtenus par PCR a été clonée dans le plasmide pGEM-T (Promega, Madison, USA). Ce plasmide possède un gène codant la b-lactamase conférant aux bactéries qui l’hébergent une résistance à l’ampicilline, ainsi qu’un gène codant la b-galactosidase utilisé pour sélectionner par a-complémentation les plasmides recombinants (figure 10). Une partie des mélanges réactionnels de ligation a été utilisée pour transformer des bactéries compétentes JM101, à l’aide d’un électroporateur Micropulser (BioRad, Marnes la Coquette, France). L’ADN plasmidique a été extrait par lyse alcaline (Sambrook et Russell, 2001) à partir de clones bactériens recombinants préalablement sélectionnés par PCR. En moyenne, les inserts de trois clones cDNA recombinants distincts ont été séquencés pour chaque produit de PCR. Le séquençage a été réalisé par Genome Express (Meylan, France). Chaque séquence a été vérifiée individuellement en utilisant l’electrophorégamme original. L’alignement des séquences et les reconstructions phylogéniques ont été réalisés en utilisant le programme CLUSTALX (Thompson et al, 1997). Les taux de diversité et les distances génétiques (distances p calculées selon l’identité des acides aminés ou des nucléotides) ont été calculés en utilisant le programme Mega 2 (Kumar et al, 2001).

Table des matières

INTRODUCTION
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1. Taxonomie et zones d’origine des bananiers
2. Cycle biologique et physiologie
3. Importance économique
4. Amélioration génétique
5. Ravageurs et principales maladies bactériennes et fongiques 
5.1. Ravageurs
5.2.Maladies bactériennes
5.3. Maladies fongiques
6. Maladies virales
7. Les virus associés à la maladie en tirets du bananier (banana streak disease, BSD)
7.1. Historique
7.2 Symptômes
7.3. Biologie, taxonomie et organisation génétique
7.4. Transmission
7.4.1. Transmission horizontale
7.4.2. Transmission verticale
8. Le virus X du bananier (BVX) 
8.1. Historique
8.2 Symptômes
8.3 Biologie, taxonomie et organisation génétique
8.4. Transmission
MATERIEL ET METHODES
1. Plantes
2. Détection du BSV par multiplex-immunocapture-PCR (M-IC-PCR) 
3. Détection du BVX par reverse transcription nested PCR utilisant des amorces polyvalentes
dégénérées (PDO-RT-nested PCR)
3.1. IC-PDO-RT-nested PCR
3.2. DB-PDO-RT-nested PCR (direct binding polyvalent degenerate oligonucleotides reverse
transcription nested PCR)
4. Analyse des séquences nucléotidiques
RESULTATS
1. Prévalence des principales espèces de BSV en Guadeloupe 
1.1. Détection des principales espèces de BSV
1.2. Prévalence du BSV en Guadeloupe
1.3. Etude de la diversité moléculaire du BSV en Guadeloupe
2. Prévalence et diversité moléculaire du BVX en Guadeloupe
2.1. Détection du BVX
2.2. Prévalence du BVX en Guadeloupe
2.3. Diversité moléculaire du BVX en Guadeloupe
DISCUSSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES : RESULTATS COMPLETS DES INDEXATIONS

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