Taxonomie et identification des mycobacteries

Les mycobactéries de l’environnement sont des microorganismes hétérotrophes communs dans tous les types de milieu naturel tel que le sol et les eaux. Quelques espèces peuvent être à l’origine des infections semblables à la tuberculose chez les hommes et les animaux. Les patients immunodéprimés et les autres individus prédisposés sont exposés aux infections à mycobactéries sévères. Comparées aux autres espèces bactériennes, les mycobactéries de l’environnement sont exceptionnellement résistantes à certains produits conventionnels de désinfection comme le chlore (CARSON et al, 1978 ; KUBALEK et KOMENDA, 1995). A cet effet, elles peuvent échapper aux traitements de décontamination du réseau de distribution d’eau et du réseau de canalisation.

Après la recrudescence du SIDA et des infections opportunistes associées dont les infections à mycobactéries, les sources de contamination et les réservoirs de mycobactéries ont attiré l’attention des scientifiques. D’après la littérature, les systèmes de distribution d’eau qui alimentent les hôpitaux ou des complexes hôteliers figurent parmi les sources privilégiées de contamination. Les infections à mycobactéries sont aussi évoquées suivant l’exposition aux systèmes plus simples comme les baignoires chaudes (MANGIONE et al, 2001 ; WATANDO et al, 2001).

Ces dernières décennies, les scientifiques rapportent que les biofilms formés à la surface du réseau de canalisation ont un impact majeur sur la qualité microbienne des eaux du système. Aussi, les microorganismes potentiellement pathogènes peuvent se multiplier ou survivre dans ces biofilms qui leur offrent convenablement des conditions trophiques favorables et de protection contre la désinfection (PERCIVAL et al, 2000 ; SZEWZYK et al, 2000). La corrélation entre la formation de biofilms et l’occurrence des mycobactéries de l’eau est aussi démontrée (HALL STOODLEYET al, 1999 ; SCHULZE-ROBBECKE et FISCHEDER, 1989).

SYNTHESES BIBLIOGRAPHIQUES 

HISTORIQUE

Au début du XIXe siècle, LAENNEC individualise la tuberculose. En 1865, VILLEMIN montre qu’il s’agit d’une maladie inoculable à l’animal et transmissible d’un animal à l’autre. Le bacille responsable de la tuberculose, Mycobacterium tuberculosis, est isolé en 1882 par Robert KOCH, qui démontre pour la première fois qu’une bactérie est responsable d’une pathologie définie. De plus, il réussit à colorer celui-ci dans les lésions tuberculeuses et à le cultiver en 1884 sur milieu de sérums coagulés. Quelques années plus tard, en 1887, ROUX et NOCARD montrent que la croissance du bacille tuberculeux est stimulée quand la glycérine est ajoutée dans le milieu.

En 1873, Armauer HANSEN découvre l’agent étiologique de la lèpre sans pour autant l’isoler sur un milieu de culture. De nos jours, le bacille de la lèpre ou Bacille de Hansen (Mycobacterium leprae) n’est toujours pas cultivable sur milieux artificiels. Quant au bacille de la tuberculose aviaire (Mycobacterium avium), il est mis en évidence à la suite des travaux de RIVOLTA et MAFFUCI.

Les travaux de SMITH de 1896 à 1898 aboutissent à la découverte en 1902 du bacille tuberculeux bovin (Mycobacterium bovis) qui est différent du bacille de la tuberculose humaine. Au cours de la même période, Mycobacterium paratuberculosis, synonyme de Mycobacterium johnei (agent de l’entérite hypertrophiante des bovidés), est également décrit. (JOHNE et FROTHINGHAM, 1895) Cependant, jusqu’en 1950, les seules espèces considérées comme pathogènes chez l’homme sont M. leprae et M. tuberculosis. Par la suite, les travaux sur les mycobactéries se multiplient. ZIEHL et NEELSEN améliorent la technique de coloration mise au point par Paul EHRLICH, qui mettait en évidence l’acido-alcoolo résistance de ces bactéries. A. CALMETTE et C. GUERIN mettent au point en 1921 le vaccin contre la tuberculose qui portera leur nom, le bacille de Calmette et Guérin ou BCG. CASTETS, BOISVERT, GRUMBACH, BRUNEL et RIST en 1968 décrivent une variété des bacilles tuberculeux isolés chez les Africains. Cette espèce prend le nom Mycobacterium africanum.

La tuberculose devient un problème majeur de Santé Publique avec la révolution industrielle qui crée les conditions idéales pour l’expansion de la maladie : elle est responsable notamment d’un décès sur trois en France (Paris) en 1850. Selon les données actuelles de l’OMS, la morbidité et la mortalité dues à la tuberculose s’élèvent à 8 millions de nouveaux cas et près de 2 millions de décès par an au niveau mondial. Dès le début du XXéme siècle, avec l’amélioration de l’hygiène et le développement des sanatoriums, le taux de mortalité due à la tuberculose diminue régulièrement, du moins dans les pays industrialisés. La découverte des antibiotiques antituberculeux à partir des années 1950 contribue considérablement à faire diminuer les taux de mortalité et l’incidence dans ces pays.

Cependant la dégradation des conditions sanitaires et sociales liées à la crise économique des années 1980, l’apparition de souches résistantes et la pandémie du SIDA donnent lieu à une augmentation de l’incidence de la tuberculose au niveau mondial et en particulier en Europe dans les pays de l’ex-URSS. À l’opposé, la polychimiothérapie antilépreuse instaurée au niveau mondial à partir de 1985 fait chuter le nombre de cas de lèpre de 20 millions à moins de 2 millions en 1997.

Le terme « mycobactéries atypiques » est appliqué en 1935 par PINNER pour caractériser des mycobactéries autres que les bacilles de la tuberculose et de la lèpre pouvant provoquer des pathologies chez l’homme ou chez l’animal. De nombreux autres termes sont également utilisés : « mycobactéries non tuberculeuses », « mycobactéries opportunistes » et « mycobactéries de l’environnement ». Par la suite, des mycobactéries atypiques responsables d’infections chez l’homme sont caractérisées : M. ulcerans en 1948 (MAC CALLUM et al, 1948), M. marinum en 1951 (LINELL et al, 1954). En 1953, de nouvelles infections à mycobactéries sont décrites : M. abscessus (MOORE et al, 1953), M. kansasii (BUHLER et al, 1953), M. avium-intracellulare (KARLSEN et al, 1953).

Les mycobactérioses dues aux mycobactéries atypiques sont difficiles à estimer car ces maladies ne sont pas à déclaration obligatoire. Il s’agit d’infections non transmissibles, acquises de l’environnement, le plus souvent pulmonaires chez l’adulte, ganglionnaires chez l’enfant, ostéo-articulaires et cutanées à la suite de traumatisme ou de gestes chirurgicaux. Chez les personnes immunodéprimées, en particulier chez les patients atteints de SIDA, les infections sont généralement disséminées. Contrairement à la tuberculose et à la lèpre pour lesquelles il existe des traitements spécifiques bien établis, les mycobactérioses restent des pathologies difficiles à traiter du fait de la résistance des mycobactéries atypiques à la plupart des antibiotiques antituberculeux.

TAXONOMIE ET IDENTIFICATION DES MYCOBACTERIES 

LE GENRE Mycobacterium 

Le genre Mycobacterium est un des plus vieux genres bactériens : il est décrit par LEHMAN et NEUMAN en 1896. Il est également un des mieux définis. Ce genre fait partie du sous-ordre des CORYNEBACTERINEAE, dans l’ordre des ACTINOMYCETALES. Il est le seul représentant de la famille des MYCOBACTERIACEAE (STACKENBRANDT et al, 1997). Les Corynebacterineae comprennent des micro-organismes d’écologie et de morphologie diverses qui produisent des acides mycoliques et comprennent les genres Rhodococcus, Nocardia, Gordonia, Mycobacterium, Dietzia, Tsukamurella et Corynebacterium, (EMBLEY et al, 1994 ; GOODFELLOW et al, 1984 ; RAINEY et al, 1995). Un autre nouveau genre, présentant aussi des acides mycoliques, est décrit sous le nom de Skermania gen. Nov (CHUN, 1997).

Les acides mycoliques confèrent aux bacilles une propriété d’acido-alcoolo résistance plus ou moins marquée selon leur poids moléculaire. L’acido-alcoolo résistance est rarement rencontrée chez les corynébactéries qui possèdent des acides mycoliques courts. Elle est irrégulière chez les Nocardia et constante chez les mycobactéries qui présentent des acides mycoliques de plus haut poids moléculaire, de 60 à 90 atomes de carbone.

Le terme générique Mycobacterium désigne initialement un groupe d’organismes qui croît en pellicule comme des moisissures sur des milieux liquides. Cette forme de croissance ne se retrouve pas sur les milieux utilisés aujourd’hui. Les colorants usuels colorent difficilement les mycobactéries qui apparaissent alors positives après la coloration de Gram. L’utilisation de fuchsine phéniquée selon la méthode de Ziehl-Neelsen permet l’entrée du colorant et sa rétention malgré l’action d’acides dilués et d’alcool (DAVID et al, 1989). Au début du XXéme

siècle, les caractères définissant les mycobactéries reposent sur l’absence de mobilité, la morphologie des bacilles et l’acido-alcoolo résistance (WAYNE et al, 1986). Cependant ces critères morphologiques ne sont pas suffisants pour caractériser le genre Mycobacterium. La chimiotaxonomie reposant sur l’étude des acides mycoliques permet de mieux caractériser le genre grâce à deux critères : la longueur de la chaîne de la molécule totale et la longueur de la chaîne des esters de pyrolyse. Les premières études génétiques, menées sur les mycobactéries, portent sur la détermination de la taille du génome et du pourcentage de guanine et de cytosine (BAESS et al, 1984 ; BRADLEY et al, 1973 ; CROWTHER et al, 1986 ; IMAEDA, 1987). Le génome des mycobactéries, comme celui des autres actinomycètes, comporte un haut pourcentage en paire de bases guanine et cytosine (GC %) qui varie de 62 à 70 % (sauf pour M. leprae dont le GC % est 50%). Actuellement la classification des Mycobacterium repose sur trois critères principaux : l’acido-alcoolo résistance, un GC % compris entre 58 et 71 %, et la synthèse d’acide mycoliques de 60 à 90 atomes de carbone libérant des esters de pyrolyse de 22 à 26 atomes de carbone (LEVY-FREBAULT et al, 1992).

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
Chapitre I: SYNTHESES BIBLIOGRAPHIQUES
HISTORIQUE
TAXONOMIE ET IDENTIFICATION DES MYCOBACTERIES
I- LE GENRE Mycobacterium
I-1- Les espèces mycobactériennes
I-2- Les mycobactéries de la tuberculose
I-3- Les mycobactéries atypiques
II- LES METHODES D’IDENTIFICATION CLASSIQUES
III- LA CHIMIOTAXONOMIE
III-1- La paroi mycobactérienne
III-2- L’analyse chimiotaxonomique
IV- L’IDENTIFICATION PAR BIOLOGIE MOLECULAIRE
IV-1- Les sondes spécifiques d’espèces
IV-2- Les sondes commercialisées
IV-3- L’amplification d’un gène conservé suivi d’une restriction enzymatique (PCR-RFLP)
IV-4 – Le séquençage
IV-5- La biologie moléculaire et l’identification informatisée
ECOLOGIE DES MYCOBACTERIES
I- LES BACILLES DE LA TUBERCULOSE
I-1- Habitat et transmission de l’infection
I-2- Pathogenèse
II- ECOLOGIE DES MYCOBACTERIES ATYPIQUES
II-1- Le réservoir animal
II- 2- Le réservoir hydro-tellurique
II-2-1- Faculté d’adaptation
II-2-2- Influence des conditions environnementales sur la répartition des mycobactéries
II-2-3- Biodégradation
LES MYCOBACTERIOSES
I- TRANSMISSION DES MYCOBACTERIOSES ET MODES DE CONTAMINATION PRIVILEGIES
I-1- Transmission par des aérosols
I-2- Transmission direct par l’eau
I-3- Autres modes de transmission
II- PATHOGENICITE ET SIGNES CLINIQUES
II-1- Manifestations cliniques
II-1-1- Chez les patients immunocompétents
II-1-1-1- Infections pulmonaires et disséminées
II-1-1-2- Infections extra-pulmonaires
– Ulcère de Buruli
– Infection à M. marinum
– Adénites mycobactériennes
– Infections cutanées
– Bursites et ténosynovites
II-1-2- Mycobactérioses et SIDA
II-2- Diagnostic
II-3- Traitement de la mycobactériose
II-3-1- Les différents types de traitement
– Antibiothérapie
– Chirurgie
– Abstention thérapeutique
II-3-2- Stratégies thérapeutiques
– Cas d’infection à M. marinum
– Cas de gommes et abcès
– Cas de bursites et ténosynovites
– Cas d’infection à M. ulcerans
– Cas d’adénites
III- EPIDEMIOLOGIE DES MYCOBACTERIOSES
BUT DE LA RECHERCHE
Chapitre II: LES MYCOBACTERIES ATYPIQUES DES EAUX EN MILIEU URBAIN
I- PRESENTATION DE L’ETUDE
I-1- ETUDE DE L’OCCURENCE DES MYCOBACTERIES
I-2- APPROCHE ECOLOGIQUE DES SITES D’ETUDE
II – LES MYCOBACTERIES DES RESEAUX DE CANALISATION DANS LES VILLES D’ANTANANARIVO ET DE TOAMASINA
II-1- INTRODUCTION
II-2- MATERIELS ET METHODES
II-2-1- Echantillonnage et isolement
II-2-2- Dénombrement des colonies d’un échantillon
II-2-3- Caractérisation biochimique
II-2-3-1- Le type respiratoire des souches mycobactériennes (DAVID HL, 1991)
II-2-3-2- L’influence des agents chimiques et des antibiotiques
II-2-3-3- Les différentes activités physiologiques
II-2-4- Technique d’identification par biologie moléculaire
II-2-4-1-Amplification du gène codant l’ARNr 16S
II-2-4-2- Amplification du gène hsp 65
II-2-4-3- Séquençage de nucléotide
II-2-4-4- Analyse et alignement des séquences
II-3- RESULTATS
II-3-1- La fréquence de mycobactéries dans les réseaux
II-3-2- Nomenclature et classification des mycobactéries isolées
II-3-3- Distribution des souches isolées dans les réseaux
II-4- DISCUSSION
III- CORRELATION ENTRE L’OCCURRENCE DES MYCOBACTERIES ET LES FACTEURS ECOLOGIQUES DU SITE D’ETUDE
III-1- INTERET DE L’ETUDE
III-2- MATERIELS ET METHODES
III-2-1- Etude des facteurs écologiques des sites
III-2-1-1- Collecte des données climatiques
III-2-1-2- Analyses des paramètres physico-chimiques
III-2-1-3- Analyse des autres facteurs chimiques
III-2-1-4- Analyses microbiologiques
III-2-2- Analyse mycobactériologique
III-2-3- Méthode d’analyse statistique des corrélations
III-3- RESULTATS
III-3-1- Facteurs écologiques
III-3-1-1- Données climatiques
III-3-1-2- Paramètres physico-chimiques
III-3-1-2- Les autres facteurs chimiques
III-3-1-3- Les bactéries hétérotrophes
III-3-1-4- Les mycobactéries potentiellement pathogènes
III-3-2- Corrélations entre les différents facteurs étudiés
III-3-2-1- Corrélation entres les facteurs climatiques et les paramètres physicochimiques des sites d’échantillonnage
III-3-2-2- Corrélation entre les facteurs écologiques et les microorganismes dans les sites d’échantillonnage
III-3-2-3- Corrélation entre les facteurs physico chimiques des sites et l’occurrence des mycobactéries
III-4- DISCUSSION
Chapitre III : EFFET ANTIBIOTIQUE DE SUBSTANCES NATURELLES DE MADAGASCAR SUR LES MYCOBACTERIES
I – CRIBLAGES DE L’ACTIVITE ANTI-MYCOBACTERIENNE DES SUBSTANCES NATURELLES DE MADAGASCAR
I-1- INTERET DE L’ETUDE
I-2- MATERIELS ET METHODES
I-2-1- Investigation des données ethno-pharmacologiques
I- 2- 2- Préparation des substances à tester
I-2-2-1- Extraction hydro-alcoolique
– Cas des spermaphytes
– Cas des champignons
– Cas des algues marines et des organismes marins
I-2-2-2- Extraction par l’entraînement à la vapeur
– Extraction à l’échelle du laboratoire
– Extraction sur le terrain
I-2-3 – Test d’activité inhibitrice de la croissance in vitro des mycobactéries
I-2-3-1- Mise au point de la technique de criblage
I-2-3-2- Les activités inhibitrices sur la croissance mycobactérienne des extraits bruts de substance naturelles
– Test d’inhibition de M. bovis var. BCG1173-P2 par des extraits bruts
– Test d’inhibition de mycobactéries non tuberculeuses (MNT) par des extraits bruts
I-2-3-3- Les activités inhibitrices des huiles essentielles de plantes malgaches sur la croissance de mycobactéries
– Activité inhibitrice des huiles essentielles sur la croissance in vitro de M. bovis var. BCG 1173-P2
– Activité inhibitrice des huiles essentielles sur la croissance in vitro de M. intracellulare
I-3- RESULTATS
I-3-1- Collectes des matériels à éprouver
I-3-2- L’activité inhibitrice sur la croissance des mycobactéries
I-3-2-1- Les activités inhibitrices des extraits bruts de substance naturelle sur la croissance de mycobactéries
– L’inhibition sur M. bovis var. BCG 1173-P2
– L’inhibition sur le complexe M. intracellulare (MAC)
I-3-2-2- Les activités inhibitrices des huiles essentielles sur la croissance de mycobactéries
– Activité inhibitrice de la croissance in vitro de M. bovis var. BCG1173-P2
– Activité inhibitrice de la croissance in vitro de complexe M. intracellulare
I-4- CONCLUSION
II– ETUDE DE L’ACTIVITE ANTI-MYCOBACTERIENNE DE L’HUILE ESSENTIELLE DE Phellolophium madagascariensis Baker (APIACEAE)
II-1- INTRODUCTION
II-1-1- Cadre de l’étude
II-1-2- Matériel d’étude
II-1-2-1- Description botanique
II-1-2-2- Le genre Phellolophium et ses intérêts biologiques
II-1-2-3- L’huile essentielle et ses compositions chimiques
II-2- MATERIELS ET METHODES
II-2-1- Collecte et étude chimique du matériel d’étude
II-2-2-Test d’inhibition in vitro de la croissance
II-2-3-Isolement et purification de composés actifs
II-2-4-Activité anti-mycobactérienne de l’huile de P. madagascariensis
II-3- RESULTATS
II-3-1- Extraction et fractionnement de l’huile essentielle
II-3-2- Inhibition in vitro de la croissance de M. intracellulare
II-3-3- Isolement et purification de composés actifs
II-3-4- Activité anti-mycobactérienne du terpinène-4-ol et du linalol isolés du produit oxygéné de l’huile de P. madagascariensis
II-4- DISCUSSION
II-5- CONCLUSION
CONCLUSION GENERALE

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