Taxonomie et critères de classification des actinobactéries

Taxonomie et critères de classification des actinobactéries

Définition des actinobactéries

Etymologiquement, le mot Actinomycète a été dérivé des mots grecs «Aktis» qui veut dire rayon et «mykes» qui veut dire champignon «Champignons à rayons» ou «Champignons rayonnants» (Lamari, 2006). Les actinobactéries ont été considérés comme un groupe intermédiaire entre bactérie et champignons. Actuellement, ils sont reconnus comme des organismes procaryotes. Pourtant, ces micro-organismes présentent des similitudes à la fois avec les bactéries et avec les champignons (Andriambololona, 2010). Les actinomycètes, également connus sous le nom des actinobacteria (Perry et al., 2004), sont des bactéries dont la croissance donne lieu à des colonies circulaires et à une morphologie complexe (Colombié, 2005 ; Eunice et Prosser, 1983). Elles sont constituées d’hyphes c’est-à-dire des filaments qui irradient par croissance centrifuge tout autour du germe qui leur a donné naissance, (Gottlieb, 1973 ; Lechevalier et Lechevalier, 1981 ; Eunice et Prosser, 1983).
Les actinobacteries constituent l’ordre des actinomycétales. Ce sont des bactéries saprophytes formant des filaments minces et ramifiés, septées, bacilles à Gram positif (Dgigal, 2003); possédant un coefficient de Chargaff (GC%) élevé compris entre 60-70% (Larpent, 1989). La plupart des espèces sont immobiles, hétérotrophes mais certaines sont chimio-autotrophes (Ensign et al., 1993), aérobies, mésophiles et poussent de façon optimale  dans une gamme de pH 5,0 à 9,0 avec une proximité optimale à la neutralité (Williams et Wellington, 1982 a ; Goodfellow et Williams, 1983)

Caractéristique générale d’actinobactéries

Les actinobactéries comprend un groupe de micro-organismes unicellulaires ramifiés, dont la plupart sont aérobies formant des mycéliums connus sous le nom mycélium de substrat et aérien. Ils se reproduisent par fission binaire ou par production de spores ou de conidies. La sporulation des actinobactéries se fait à travers la fragmentation et la segmentation ou bien la formation de conidies. L’apparence morphologique des actinobactéries est compacte, souvent coriace, donnant un aspect conique avec une surface sèche sur les milieux de culture et souvent couverte par le mycélium aérien.

Taxonomie et critères de classification des actinobactéries

Systématique des actinobactéries

Les différentes éditions du Manuel de Bergey ont apporté des définitions actualisées des actinobactéries avec des données fournies par des travaux récents par rapport à l’époque de chaque édition. Selon la classification du « Taxonomic Outline of The Procaryotes, Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology », Deuxième édition 2004 (Garrity et al., 2004), le Phylum Actinobacteria ( bactéries à Gram positif et % G +C élevé) est constitué d’une seule classe dénommée également « Actinobacteria ». Celle-ci a été décrite par Stackebrandt et al. (1997). Selon le Bergey’s Manual de 2012, la définition des actinobactéries est restée la même (bactéries à Gram positif ayant un % G+C supérieur à 55% et présentant une grande variabilité morphologique, la plupart étant mycéliens). Mais sur la base des données de la biologie moléculaire notamment le séquençage du gène codant pour l’ARN 16S, la classification supragénérique des actinobactéries a subi un profond remaniement. Ces microorganismes sont classés actuellement dans le règne des Procaryotae, le phylum des Actinobacteria et la classe des Actinobacteria également.
Cependant, l’ordre des Actinomycetales a été subdivisé en plusieurs ordres (Actinomycetales, Streptomycetales, Streptosporangiales, Micromonosporales,Micrococcales, etc). L’ordre des Actinomycetales actuellement est un petit ordre regroupant peu de genres, dont Actinomyces. Ce dernier représente le genre anaérobie strict et pathogène pour l’homme.

Evolution des critères d’identification

La systématique bactérienne a subi plusieurs modifications durant les trois dernières décennies dues à l’application de nouvelles techniques biochimiques, chimiques, génétiques, numériques et moléculaires (Abbas, 2006). Cette évolution fut marquée par quatre périodes essentielles dont chacune a apporté de nouveaux critères de classification.
Lors de la première période, seuls les critères macro- et micro-morphologiques permettaient de distinguer les différents genres entre eux. Cette période s’est étendue jusqu’au début des années 60, (Pridham et al., 1958; Tresner et al., 1961, in Zitouni, 2005).
La seconde période qui a débuté à partir des années 60, a vu le développement de la chimiotaxonomie est basée sur l’analyse des constituants cellulaires tels les acides aminés  (Becker et al, 1964 ; Staneck et Roberts, 1974), les sucres cellulaires (Lechevalier et Lechevalier, 1970a). La troisième période qui a débuté dans les années 70, avec une apogée entre 1980 et 1990 combine l’outil informatique aux tests physiologiques. La taxonomie numérique basée sur des tests physiologiques analysés par ordinateur grâce à des logiciels adéquats a permis d’apporter beaucoup de clarté (Grund et Kroppenstedt, 1990).

Habitat d’Actinobactéries

Environnement terrestres

Le sol demeure l’habitat le plus important pour les actinobactéries dont les streptomycètes existant en tant que composante majeure de leur population. Selon de nombreux rapports, les espèces du genre Streptomyces ont été signalées pour être les plus abondants et les plus isolées dans chaque étude. Les actinobactéries terrestres présentent divers potentiels antimicrobiens intéressants (Oskay AM, et al., 2005). Ces actinobactéries isolées avaient la capacité de produire de nouveaux antibiotiques à forte activité antibactérienne. Dans la rhizosphère de mangrove anoxique, les espèces d’actinobactéries telles que Streptomyces, Micromonospora et Nocardioform ont été les plus abondantes (Tan, et al., 2009). De même, Nocardia isolée du sol de mangrove a produit de nouveaux métabolites cytotoxiques qui inhibaient fortement les lignées cellulaires humaines, telles que l’adénocarcinome gastrique (Schneider et al., 2006). Le sol de désert est également considéré
comme un environnement terrestre extrême où seules certaines espèces, en particulier les actinobactéries, utilisent souvent une espèce de cyanobactéries, le Microcoleus chthonopastes comme source de nutriment. D’ailleurs il existe plusieurs rapports montrant la distribution des actinobactéries dans divers endroits, tels que le sol sablonneux, le sol alcalin noir, le sol limoneux sablonneux, le sol de désert alcalin et le sol de désert subtropical. Dans ces différents sols, Streptomyces sp. était dominant suivis par d’autres genres, tels que Nocardia, Nocardiopsis et Actinomycetes (Cundell et Piechoski, 2016)

Eaux douces et marines

Les Actinobactéries sont bien représentés dans ces milieux d’où l’on peut facilement isoler des souches de Microspora, d’Actinoplanes et de Streptosporangium.C’est essentiellement dans les sédiments des fonds fluviaux ou lacustres que ceux-ci sont présents où ils jouent un rôle important dans la décomposition des débris végétaux et donnent à l’eau son odeur de terre et sa flaveur. Alors qu’ils sont absents dans les eaux minières très acides (pH<1) et des sources thermales très chaudes d’origine volcanique (Xu et al, 1996 ; Hwang et al., 2001).

l’Air

L’air ne constitue pas un habitat pour les actinobactéries, mais un moyen de transport. Les spores des actinobactéries sont des contaminants importants de notre environnement. Les spores de certains actinobactéries se développent dans des matériaux détériorés et lorsqu’elles sont inhalées provoquant des maladies respiratoires (Nocardiose pulmoniare). Les spores d’actinobactéries thermophiles sont produites en une grande quantité et sont facilement mises en suspension dans l’air (Mazodier, 1974).

Les Composts

Des actinobactéries sont isolés des composts, il s’agit de genres thermophiles tels que Thermoactinomyces, Sacharomonospora et d’autres thermotolérants tels que Microbispora, Micropolyspora, Pseudonocadia (Ensign et al., 1993 ; Lacey, 1997 ; Song et al., 2001). Les actinobactéries sont actives dans les derniers stades du compostage. Ils se sont spécialisés dans l’attaque des structures plus résistantes comme la cellulose, la Kératine, l’hémicellulose et la lignine (Zermane, 2007).

Les végétaux, les animaux et l’homme

Dans la distribution naturelle des actinobactéries, il faut ajouter les végétaux, les animaux et l’homme. Parmi les exemples les mieux connus, il faut citer : Streptomyces scabies, Actinomyces bovis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Nocardia asteroides et Micropolyspora faeni (Zermane, 2007). Actinomyces massiliensi sp.nov isolée du sang d’un patient (Renvoise et al, 2009), Actinomyces timonensis sp. nov. isolée d’un patient qui atteint un osteo-articulation (Renvoise et al, 2010).

Applications des actinobactéries

Les actinobactéries sont bien reconnues pour leur production de métabolites primaires et secondaires qui ont des applications importantes dans divers domaines. Ils sont également une source prometteuse de large gamme d’enzymes importantes, qui sont produites à l’échelle industrielle (Laccaze, tyrosinase et cellulase ..ect) . Une grande fraction d’antibiotiques sur le marché provient d’actinobacteries. Ils produisent des inhibiteurs enzymatiques utiles pour le traitement du cancer et les immunomodifiants qui améliorent la réponse immunitaire. Ils ont la capacité de dégrader une large gamme d’hydrocarbures, de pesticides et de composés aromatiques et aliphatiques (Skplovska et al., 2003). Ils effectuent des transformations de composés organiques. De nombreux genres d’actinobacteries peuvent être potentiellement utilisés dans la bioconversion des déchets agricoles et urbains sous-utilisés en produits chimiques de haute valeur. Les actinobactéries sont également importantes dans le domaine de la biotechnologie végétale (PGPR), en effet, certaines sont utiles dans la lutte biologique.

Production des métabolites antimicrobiens (Les Antibiotiques)

Les actinobactéries jouent un rôle important dans la production des antibiotiques. Ces médicaments sont variés et extrêmement importants pour notre santé. Ils sont majoritairement représentés par des molécules d’origine naturelles et leurs dérivés. Or, les maladies dues à des bactéries pathogènes multirésistantes augmentent vigoureusement. Ces résistances d’étendent quantitativement mais aussi qualitativement depuis plus de 20 ans, de nombreux déterminants de résistance ont été décrit avec l’émergence de bactéries de plus en plus résistantes (Alekshun et levy, 2007). Face à la perte d’efficacité de certains antibiotiques, la découverte de nouvelles molécules est devenue une nécessité absolue. Les efforts se concentrent sur la recherche de nouveaux antibiotiques avec des nouveaux mécanismes d’action et qui ne comportent aucun effet toxique.D’ailleurs près de 80% des antibiotiques commercialisés sont dérivés d’actinobactéries, principalement des genres Streptomyces et Micromonospora (Jensen et al., 1991; Hassan et al., 2011).

Table des matières

INTRODUCTION
Chapitre I : Revue Bibliographique
I. Les Actinobactéries
1. Historique
2. Définition des actinobactéries
3. Caractéristique générale d’actinobactéries
II. Taxonomie et critères de classification des actinobactéries
1. Systématique des actinobactéries
2. Evolution des critères d’identification
3. Critères actuels d’identification
3.1. Caractères morphologiques
3.1.1. Caractéristiques culturales ou macromorphologiques
3.1.1.1. Mycélium aérien
3.1.1.2. Mycélium de substrat
3.1.2. Caractéristiques micromorphologiques
3.2. Caractères chimiotaxonomiques (chimiotaxonomie)
3.2.1. Constituants pariétaux: isomères de l’acide diaminopimélique et acides aminés
3.2.2. Glucides
3.2.3. Constituants membranaires et pariétaux: lipides
3.2.3.1. Les phospholipides
3.2.3.2. Les ménaquinones
3.2.3.3. Acides gras
3.2.3.4. Les acides mycoliques
3.3. Critère physiologique et taxonomie numérique
3.4. Critères moléculaires
3.4.1. Séquençage de l’ADN ribosomique 16S et phylogénie
3.4.2. Hybridation ADN-ADN et détermination du pourcentage de guanine-cytosine
3.4.3. Taux de GC
3.4.4. Séquençages de nouvelle génération (NGS)
3.4.4.1. Préparation des banques ou librairies
3.4.4.2. PCR en émulsion
3.4.4.3. Bridge PCR
3.4.4.4. Séquençage Illumina
3.4.4.5. Annotation des génomes
III. Cycle de développement d’actinobactérie
1. Formation des spores par les actinobactéries
1.1. Les Exo-spores
1.2. Endospores
IV. Habitat d’actinobactéries
1. Environnement terrestres
2. Eaux douces et marines
3. l’Air
4. les Composts
5. les Végétaux, les animaux et l’homme
V. Applications des actinobactéries 
1. Production des métabolites antimicrobiens (Les Antibiotiques)
2. Production d’enzymes
3. Production des Bioherbicides
4. Production de Vitamines
5. Production de Pigments
6. Bioremédiation
7. Utilisation des actinobactéries en lutte biologique
VI. Famille des Streptomycétacées
1. Le genre Streptomycès
1.1. Classification du genre Streptomyces (Bergy’s manual of systematic bacteriology,2006)
1.2. Cycle de développement
1.3. Caractéristiques du genre Streptomyces
1.3.1. génétique des Streptomyces
1.4. Identification moléculaire (ARN ribosomique 16S) des Streptomyces
1.4.1. limites de la PCR universelle 16S en tant qu’outil de définition de nouvelles
espèces bactériennes
1.5. L’Hybridation ADN-ADN
VII. Les Antibiotiques
1. Les cibles bactériennes des antibiotiques
2. Les antibiotiques produits par le genre Streptomyces
3. Effet de la composition de milieux de culture sur la production des antibiotiques
4. Stratégie moléculaires de lutte contre la résistance bactérienne
Chapitre II : Matériel et Méthodes
I. Origine des échantillons de sol et isolement des actinobacteries
1. Les échantillons de sols
2. Isolement des actinobactéries
2.1. Prétraitement des échantillons de sols
2.2. Les milieux de cultures utilisés
2.3. Préparation de la suspension-dilution et ensemencement
2.3.1.-Ensemencement en masse
2.3.2.-Ensemencement en surface
3. Reconnaissance des actinobactéries
4. Dénombrement et sélection des actinobactéries
5. Purification et conservation des actinobactéries
II. Criblage de l’activité antimicrobienne des actinobacteries
1. Souches de microorganismes-cibles
2. Test d’antagonismes (étude de l’activité antagonistes in vitro)
2.1. Méthode de stries croisées
2.2. Méthode des cylindres d’agar
2.3. Méthode de confrontation directe en boîte de Pétri
3. Choix des meilleurs isolats d’actinobactéries antagonistes
III. Etude de l’activité antibiotique de la souche sélectionnée « D2 »
1. Cinétiques de production des antibiotiques en milieu liquide
2. Préparation de pré-culture
2.1. Ensemencement en fioles agitées
2.2. Cinétique de production de la substance antimicrobienne
2.3. Extraction de la substance antimicrobienne (filtrat de culture)
2.4. Choix de meilleur solvant d’extraction
2.5. Révélation microbiologiquede la substance antimicrobienne « bio-autographie»
2.6. Origine et caractéristiques des souches
2.7. Séparation de l’extrait brut sur chromatographie sur couche mince (CCM)
2.8. Purification de la substance antimicrobienne par HPLC semi préparative
2.9. Etude spectrométrique du produit purifié
2.9.1. Spectrométrie de masse
IV. Taxonomie polyphasique des isolats d’actinobactéries antagonistes choisis
1. Etude morphologique
1.1 Etude macromorphologique et caractères culturaux
1.2 Etude micromorphologique
1.3. Observation au microscope électronique à balayage (MEB) (Tresner et al., 1961)
2 .Etude physiologique caractérisation physiologique des isolats d’actinobactéries
2.1. Production de pigments mélanoïdes
2.2.- Utilisation des composés glucides comme seules sources de carbone
2.3. Hydrolyse de l’amidon
2.4. Hydrolyse de la caséine
2.5. Hydrolyse de la gélatine (Test gélatinase)
2.6. Recherche de nitrate réductase
2.7. Croissance en présence d’inhibiteurs (Résistance à divers agent chimiques)
2.8. Croissance en présence de différentes concentrations de NaCl
2.9. Croissance à différents pH
2.10. Croissance à différentes températures
2.11. Tests de sensibilité aux antibiotiques
3. Etude moléculaire
3.1.- Extraction de gène de l’ARN ribosomial 16S
3.2. Quantification de l’ADN
3.3.- Amplification par PCR et électrophorèse en gel d’agarose
3.4. Purification des produits PCR
3.5.- Séquençage de l’ARN ribosomial 16S
3.6- Analyse phylogénétique
3.7. Extraction de l’ADN génomique des deux isolats et séquençage
Chapitre III : Résultats et Discussions
PARTIE I : Isolement des actinobacteries des sols arides et semi arides et évaluation de leur
potentiel antimicrobien
1. Isolement et dénombrement
2 Résultats de l’action antagoniste des isolats d’actinobactéries
2.1 Technique de stries croisées
2.2 Technique de cylindre d’agar
PARTIE II : Production, purification et identification de l’antibiotique Secrété par la souche
D2
1. Production d’antibiotiques en milieux liquides
2. Production, extraction et semi purification des antibiotiques
2. 1. Production et extraction de l’antibiotique à partir des filtrats de culture
2. 2. Mise en culture de l’isolat D2 et extraction des antibiotiques et antibiographie
2. 3.Détection des antibiotiques par bio autographie
2. 4. Autobiographie de l’extrait brut de l’isolat D2
2. 5. Analyse et purification des antibiotiques par HPLC
2. 5.1. Analyse par la technique d’HPLC
2. 5.2. Purification des antibiotiques de l’isolat D2 par HPLC
2. 5.3. Résultats de l’optimisation des paramètres d’HPLC
2. 6. Caractérisation spectrométrique des composés actifs
PARTIE III : étude taxonomique des isolats d’actinobacteries sélectionnés
1. Etude des caractères morphologiques (aspect cultural)
1.1. Etude macroscopique
1.2. Etude microscopique
1.3. Coloration de Gram
2. Résultats de l’étude physiologique
2.1. Tests de sensibilité aux antibiotiques
2.2. Production de pigments mélanoides
3. Résultats de l’étude physiologique et biochimique
4. Résultats de l’étude des paramètres physico-chimiques
5 . Résultats de l’étude moléculaire
5.1. Identification Moléculaire des espèces (séquençage de gène de l’ARNr 16S)
5.2. Identification moléculaire des deux isolats (D2 et Ms1)
5.2.1 .Extraction de l’ADN génomique total des deux isolats (D2 et MS1)
5.2.1.1. Vérification de l’extraction de l’ADN
5.2.1.2. Séquençage de génome total des deux isolats D2 et MS1
Conclusion et perspectives

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