Soutenance mémoire
Systèmes optiques de visualisation en 3D pour la biologie
Positionnement de notre projet : le laboratoire dédié à la microscopie en 3D
Jusqu’à présent, nous avons détaillé le fonctionnement de laboratoires sur puce microfluidiques fondés sur des techniques de fabrication plus ou moins complexes et dédiés à des analyses chimiques, biochimiques et médicales. Au cours de ce travail de thèse, nous avons développé un nouveau type de laboratoire sur puce, combinant l’optique et les technologies de microfabrication du silicium, optimisé pour l’observation en 3D avec une grande rapidité d’acquisition des transactions biologiques dans la cellule. La microscopie optique permet de collecter des informations sur un échantillon cible projetées dans le plan focal d’observation. Cette projection en 2 dimensions est pénalisante lorsque l’on souhaite étudier des cellules, qui sont par définition des objets complexes en 3 dimensions. Aussi, le développement de techniques de microscopie résolutives dans les 3 dimensions de l’espace est un enjeu ancien en microscopie, qui fait toujours l’objet de développements méthodologiques. Dans la suite, et afin de positionner scientifiquement notre travail, nous proposons un inventaire non exhaustif de techniques anciennes ou récentes de microscopies 3D. Nous nous intéresserons en particulier aux performances et aux limitations de chaque technologie, et nous tenterons ensuite d’imiter ou de dépasser ces caractéristiques avec une optimisation rigoureuse de notre laboratoire sur puce .
La microscopie confocale
Le microscope confocal a été conçu pour éliminer la fluorescence émise hors du plan focal d’observation, et ainsi capter l’image non pas dans toute son épaisseur de l’objet, mais suivant un plan donné. En effet, dans un microscope à fluorescence classique, les zones situées immédiatement au dessus et au dessous sont floues et perturbent l’acquisition, et la microscopie confocale permet de collecter des sections optiques d’au mieux ~ 500 nm.
Un peu d’histoire
Tout d’abord, rendons hommage à Marvin Minsky qui proposa en 1957 le concept de base du microscope confocal , qui prit tout son essor à partir de 1980 suite au développement des sources laser et aux progrès en instrumentation électronique et informatique. Dans le dispositif confocal, la lumière d’excitation est focalisée en un point dont les dimensions sont limitées par la diffraction. La fluorescence ainsi émise provient de tous les fluorophores ayant été balayés par le faisceau, en dessous et au-dessus du plan focal d’observation. Mais la fluorescence issue des régions inférieures et supérieures au plan de focalisation constitue un signal indésirable, qui est éliminé à l’aide d’un petit diaphragme placé devant le photodétecteur. La construction d’une image en deux dimensions (plan X, Y) est réalisée point par point grâce à un balayage du faisceau laser le long de l’échantillon. Une image en 3D est enfin réalisée avec l’acquisition d’une succession de sections optiques suivant l’axe vertical Z.
Avantages et inconvénients
La technique s’est très vite imposée comme l’outil indispensable en biologie cellulaire des eucaryotes supérieurs en permettant l’observation de structures microscopiques dans des échantillons biologiques transparents épais tels que des cultures cellulaires ou des tranches de tissus [Terasaky 1995]. Le problème majeur de cette technique est la surexposition lumineuse de l’échantillon pour la collection d’une image en 3D, ce qui induit une dégradation rapide des échantillons biologiques vivants (Photoblanchiment, phototoxicité, échauffement…). En outre, la reconstitution d’une image 3D nécessite de réaliser plusieurs vues et une cadence temporelle d’échantillonnage lente, qui peut être réduite à 1 s dans les meilleurs cas dans les levures [48-49], après une optimisation des paramètres d’imagerie.
Techniques innovantes en 3D
Revenons maintenant à un certain nombre d’approches récemment proposées pour effectuer de l’imagerie rapide en 3D moins photo-toxique.
Microscopie astigmatique contrôlée
Une solution très élégante pour l’imagerie d’objets ponctuels fluorescents en 3D s’appuie sur l’introduction d’une lentille cylindrique dans le chemin optique d’émission d’un microscope à champ large . Cette lentille produit un astigmatisme qui déforme l’image de l’objet de manière plus ou moins marquée suivant la distance au plan focal d’observation. Cette approche a été utilisée pour suivre des particules fluorescentes en 3D [50], plus récemment pour suivre des nano-cristaux photoniques dans des cellules vivantes [9]. Elle a enfin été combinée avec succès aux techniques de super-résolution de type PALM ou STORM pour la visualisation nanoscopique de structures cellulaires .
Cette technique a pour principale vertu de perdre un minimum de lumière au moment de la collection de la fluorescence. Elle est toutefois fortement limitée en termes de profondeur de champ qui est de l’ordre de 600 nm .
Techniques mutliplans et bifocales
Les techniques d’imagerie multiplans et bifocale [53-54] consistent à utiliser un diviseur de faisceau dans un microscope à champ large , qui dissocie le faisceau d’émission suivant un trajet optique correctement focalisé et un autre défocalisé, qui sont recombinés sur une caméra [55], ou deux caméras [56]. La profondeur de champ maximale atteint ≈ 1 µm, voire même 2,5 µm avec des nanocristaux photoniques [56]. La précision de ces méthodes est nanométrique et l’erreur de localisation axiale est trois fois plus grande que dans les directions latérales. Elle présente toutefois un inconvénient majeur lié à la division du faisceau, ce qui implique de collecter deux fois plus de photons pour obtenir deux images résolutives.
Microscopie à deux photons
Levi et al [57] ont développé une technique de suivi 3D en microscopie de fluorescence par excitation à deux photons. Cette approche est fondée sur un faisceau laser tournant en orbite circulaire autour de la particule cible, ce qui revient à considérablement diminuer la zone de balayage du microscope, et permet ainsi d’accéder à des cadences d’acquisition de ~ 32 ms. L’utilisation d’une source à 2 photons engendre moins de photoblanchiement et de photodégradation pour les cellules vivantes.
Récemment Carlton et al ont reporté une nouvelle plateforme de microscopie dite OMX pour l’imagerie rapide dans des cellules vivantes [58]. Ce système est capable d’enregistrer simultanément quatre longueurs d’ondes avec des temps d’exposition de ~10 millisecondes. Cette plateforme a été utilisée pour étudier la viabilité des levures sous un microscope avec des temps d’exposition de 10 ms en 2D, et 10 images en 3D avec 100 ms par image. En utilisant des intensités d’éclairage comparables, nous avons atteint des cadences d’acquisition ~5 fois plus rapides avec les micromiroirs. Notons en outre que ces auteurs ont montré qu’ils pouvaient minimiser les effets de photodégradation, très critiques en imagerie cellulaires. En outre, OMX peut facilement être appliquée pour l’illumination structurée 3D (3D SIM), PALM et TIRF.
Quelques mots sur nos performances
Les technologies que nous venons de présenter sont issues du monde de l’optique, et démontrent un fort potentiel pour les applications d’imagerie en biologie cellulaire. Notre approche repose sur les technologies de microfabrication, et n’implique pas de modification du trajet optique dans un microscope. Elle est donc plutôt celle d’un technologue, au sens de la micro-électronique. A noter que d’autres groupes ont développé des techniques fondés sur des miroirs mais sans une application biologique [59-60]. Pour situer d’emblée les performances de notre méthode d’imagerie 3D, mentionnons qu’elle permet atteindre de fortes profondeurs de champ jusqu’à 10 µm, c’est à dire dix fois plus que les techniques optiques, sans aucun calibrage pour les mesures en 3D. Les outils actuels de suivi 3D dans la levure permettent d’atteindre des cadences d’acquisition de 1 s au mieux pour l’acquisition d’un seul [48-49, 61]. Suite à nos améliorations, nous avons sondé la dynamique de la chromatine en 3D à l’échelle de 15 ms (60 fois plus vite que la littérature) avec une erreur de 27 nm.
|
Table des matières
Introduction générale
Chapitre I: Introduction
I.1. Quelques éléments sur les laboratoires sur puce
I.1.1. De 1950 à 1990, la naissance du concept
I.1.2. Intérêts des laboratoires sur puce
I.1.3. Application des laboratoires sur puce
I.1.4. Nouvelles applications pour le cancer
I.1.5. Technologies de laboratoire sur puce déjà commercialisées
I.2. Systèmes optiques de visualisation en 3D pour la biologie
I.2.1. Positionnement de notre projet : le laboratoire dédié à la microscopie en 3D
I.2.2. La microscopie confocale
I.2.3. Techniques innovantes en 3D
I.3. Quelques mots sur nos performances
Chapitre II: Laboratoire sur puce pour la visualisation 3D
II.1. Introduction
II.2. Microfabrication sur silicium
II.2.1. Photolithographie
II.2.2. Gravure
II.2.3. Évaporation de métaux
II.2.4. Lithographie douce avec le PDMS
II.3. Technologie du laboratoire sur puce
II.3.1. Etapes de fabrication
II.4. Principe de la reconstruction 3D
II.4.1. Introduction
II.4.2. Stéréovision dans notre laboratoire sur puce
II.5. Validation du principe d’imagerie 3D
II.6. Application du laboratoire sur puce à la biologie
II.6.1. Observation du noyau de cellules eucaryotes
II.7. Optimisation des performances optiques du système
II.7.1. Introduction
II.7.2. Substrat en silicium
II.7.3. Choix du métal
II.7.4. Choix de l’ouverture numérique de l’objectif
II.8. Limitations des miroirs en V
II.8.1. Introduction
II.8.2. Protocole de fabrication des micro-miroirs à une facette
II.8.3. Précision de pointé
II.8.4. Comparaison avec les miroirs en V
II.9. Conclusion
Chapitre III: Optimisations des conditions d’imagerie
III.1. Introduction
III.2. La microscopie de fluorescence
III.2.1. Historique
III.3. Notions sur la physique de la fluorescence
III.4. Composants du microscope à fluorescence
III.4.1. Principe des cubes dichroïques
III.5. Microscopes optiques à fluorescence
III.6. Optimisation des conditions d’imagerie pour le suivi de particules
III.6.1. Limite de résolution pour une particule unique
III.6.1.a. Approche de Thompson
III.6.1.b. Approche d’Ober
III.6.2. Source de lumière
III.6.3. Obturateur mécanique
III.6.4. Filtres
III.6.5. Ouverture numérique et le grossissement
III.6.6. Caméra EMCCD
III.6.7. « Binning »
III.6.8. Taille du pixel
III.6.9. Logiciel Andor
III.7. Evaluation des performances en imagerie 2D
III.8. Conclusion
Chapitre IV: Dynamique de la chromatine
IV.1. Introduction
IV.2. Quelques rappels sur la chromatine
IV.2.1. Introduction
IV.2.2. Le nucléosome, premier niveau d’organisation de la chromatine
IV.2.3. Fibre de 30 nm (niveau d’organisation supérieur)
IV.2.4. Fibre de 30 nm in vivo
IV.3. Organisation nucléaire de Saccharomyces cerevisiae
IV.3.1. Existence des compartiments hétéro- et eu-chromatiniens
IV.3.2. Organisation des chromosomes
IV.4. Description de notre méthode expérimentale
IV.4.1. La culture cellulaire
IV.4.2. Marquage d’un site chromosomique
IV.4.3. Déplacement quadratique moyen
IV.4.4. Méthodes de fixation des levures
IV.4.5. 2D versus 3D
IV.5. Dynamique de la chromatine
IV.6. Etat de l’art concernant la diffusion des chromosomes
IV.6.1. Résultats indiquant une diffusion libre confinée
IV.7. Enjeu de notre travail
IV.7.1. Sites chromosomiques étudiés
IV.7.2. Etude basée sur la dynamique des polymères
IV.7.3. Interprétation des résultats
IV.7.4. Chromosome XIV (longueur 785 kb)
IV.7.5. Chromosome VI (longueur 270 kb)
IV.7.6. Chromosome IV (longueur 1531 kb)
IV.7.7. Chromosome III (longueur 315 kb)
IV.8. Premiers éléments quantitatifs
IV.9. Conclusion
Conclusion générale
