Soutenance mémoire
Systèmes modèle des membranes biologiques
Les systèmes modèles membranaires sont essentiellement constitués de lipides.
Liposomes
Les liposomes sont des structures en bicouches lipidiques refermées sur elles-mêmes. Ils séparent un milieu aqueux intérieur d’un milieu aqueux extérieur. On distingue deux grands types de liposomes : les unilamellaires et les multilamellaires. Les multilamellaires sont appelés MLV (Multi Lamellar Vesicles). Il y a plusieurs catégories de liposomes unilamellaires classés selon leur taille : les SUV (Small Unilamellar Vesicles) .
Vésicules multilamellaires (MLV)
La méthode pour les préparer consiste à évaporer le solvant organique dans lequel sont dissous les lipides, puis à les remettre en suspension dans un solvant aqueux en agitant. Il se forme alors des liposomes multilamellaires (MLV). Ils sont constitués d’un empilement concentrique de bicouches dont le diamètre varie de 500 nm à 1 µm (Figure 8). Les MLV sont utilisées dans des expériences de calorimétrie, de RMN et de Diffraction des rayons X. En effet, à forte concentration, leur structure en multi couches comprenant des distances répétitives constantes permet au faisceau de rayons-X de diffracter.
Vésicules unilamellaires de petite taille (SUV)
Un traitement physique des liposomes multilamellaires par ultrasons ou à pression élevée permet de former des vésicules de taille homogène constituées d’une seule bicouche lipidique. Ces vésicules (SUV) ont un diamètre inférieur à 50 nm. Leur petite taille est avantageuse pour certaines mesures optiques car les artefacts liés à la diffusion de la lumière sont atténués. Ces vésicules sont donc utilisées pour la spectroscopie et notamment en dichroïsme circulaire. Les SUV sont métastables et leur forte courbure peut perturber l’arrangement lipidique. Leurs propriétés mécaniques diffèrent de celles d’une membrane cellulaire.
Vésicules unilamellaires de taille moyenne (LUV)
Les LUV sont obtenues par « extrusion » d’une solution de MLV à travers un filtre de polycarbonate. Leur diamètre dépend du filtre utilisé. Pour obtenir des vésicules unilamellaires il faut, en général, les générer à un diamètre de 100 nm. En ce qui concerne les propriétés physico-chimiques et mécaniques, celles des LUV sont plus proches de celles des membranes biologiques (en particulier des endosomes et certaines vésicules de sécrétion) que les SUV car ces dernières, trop petites, ont une courbure trop importante entraînant une forte tension de surface. Les LUV ont des rayons de courbure plus importants que les SUV et sont relativement stables dans le temps. Malgré une diffusion de la lumière plus importante, elles constituent un bon compromis pour mener des études en spectroscopie. Elles peuvent être aussi observées en microscopie électronique tout comme les SUV et les MLV .
Vésicules géantes unilamellaires (GUV)
Les vésicules géantes peuvent être préparées de différentes façons. Une méthode dite spontanée consiste à hydrater un film de lipides avec un tampon aqueux. Dans ce cas, de petites vésicules sont régulièrement présentes à l’intérieur des vésicules géantes formées. Une autre méthode, l’électroformation, consiste à hydrater un film de lipides séché au-dessus de la température de transition de la phase gel (voir partie 5) vers la phase fluide Tm (Tm : température en dessous de laquelle le lipide est en phase gel). Puis, on fait croître les GUV en utilisant un champ électrique. Par cette méthode d’électroformation, les vésicules géantes ne contiennent pas d’autres vésicules à l’intérieur. La taille de ces vésicules est voisine de celle de cellules : entre 10 et 100 µm environ. Elles sont donc visualisables en microscopie optique (contraste de phase, fluorescence ou confocale). La première observation directe de domaines lipidiques fut faite avec des GUV (Korlach et al. 1999, Dietrich et al. 2001). Elles peuvent être formées à partir de lipides extraits de membranes cellulaires (De La Serna et al. 2004) et on peut également y incorporer des protéines membranaires fonctionnelles (Girard 2004). Les GUV ont notamment été utilisées pour l’étude des microdomaines de membranes et mettre en valeur la coexistence de phases (Korlach et al. 1999, Dietrich et al. 2001). Ces membranes restent cependant éloignées des membranes biologiques puisqu’elles ne présentent pas d’asymétrie membranaire et il est difficile d’y insérer des protéines membranaires ou d’y associer un cytosquelette.
Les géométries membranaires possibles
Dans une membrane, les lipides sont organisés en bicouche mais cette organisation peut être amenée à changer en fonction des conditions expérimentales comme le degré d’hydratation ou la température. En dessous d’une concentration appelée concentration micellaire critique (CMC), les lipides sont sous forme de monomères. Audelà de la CMC, les lipides se trouvent sous forme de micelles, en équilibre avec des monomères (s’ils ne sont pas trop concentrés). Il faut également que la température soit supérieure à une température appelée température de Krafft. Les lipides peuvent aussi s’auto-organiser pour former différentes mésophases, à plus forte concentration, comme des phases hexagonales, hexagonales inverses, cubiques, micellaires ou en bicouche.
La phosphatidylcholine (PC) s’organise en bicouche lipidique en milieu aqueux et forme des liposomes tant que la concentration en lipides est inférieure à 50% en masse. Les lipides maintiennent une organisation en bicouche et se trouvent au sein de lamelles très fines par rapport à leur surface. Ces lamelles parallèles sont séparées par des couches d’eau dont l’épaisseur bien définie est fonction de la quantité d’eau dans le système. Cette organisation lamellaire, appelée Lα, est caractéristique des membranes composées de lipides à géométrie cylindrique de type PC, SM et PS. Pour ces lipides, la forme lamellaire de la bicouche est maintenue même à de hautes températures (Figure 9A) (Luzzati, Tardieu, and Gulik-Krzywicki 1968). L’épaisseur de la couche d’eau diminue si la concentration en lipide augmente encore et dépasse 50%. Dès lors, les contacts entre les bicouches sont plus étroits puisqu’il il y a un rapprochement des lamelles. En déshydratant les bicouches, on observe alors un enroulement des monocouches autour de la faible quantité d’eau qui est alors emprisonnée. Des cylindres pleins d’eau sont ainsi formés et leur surface est tapissée des têtes polaires des lipides tandis que les chaînes hydrocarbonées sont renvoyées vers l’extérieur. Ces cylindres s’organisent alors en une phase hexagonale appelée HII(Figure 9B). En particulier, il a été remarqué que la phosphatidyléthanolamine (PE) insaturée, avec sa forme conique, induit des structures hexagonales inverses. Ce type de structure rappelle l’organisation des lipides dans certains modèles de mécanismes cellulaires nécessitant une forte courbure négative comme lors de la fusion de vésicules. Le passage d’une phase Lα à une phase hexagonale est favorisé par la diminution de la concentration en eau. Cette transition peut également s’effectuer suite à une augmentation de la température dans le cas où le contact entre les lamelles de la phase Lα est déjà assez étroit. La transition de Lα vers une phase hexagonale demande de franchir une barrière énergétique qui peut l’être grâce à l’agitation thermique. La nature des lipides joue sur les domaines de température et de quantité d’eau pour lesquelles a lieu le passage Lα → HII. Plus un lipide à tendance à adopter une organisation de type HII, plus la température de transition (température au dessus de laquelle le lipide se trouve en phase hexagonale inverse) est basse et plus la quantité d’eau à laquelle la transition se produit est élevée. Soumis à des conditions de concentration et de température différentes, certains lipides s’organisent différemment. Ils peuvent notamment adopter une structure hexagonale HI. Dans ce cas, ils forment des cylindres ordonnés suivant une symétrie hexagonale, mais avec les chaînes hydrocarbonées à l’intérieur des cylindres, l’eau séparant les cylindres (Figure 9C).
D’un point de vue énergétique, les phases cubiques se situent à un niveau intermédiaire entre la structure hexagonale et la structure lamellaire. Les courbures moyennes interfaciales des phases hexagonales et cubiques ont des valeurs assez proches. Les phases cubiques sont aussi des précurseurs des phases hexagonales. Il est possible de déterminer les différentes phases par diffraction des rayons X aux petits angles. A forte résolution, il est possible d’avoir accès aux caractéristiques structurales : l’épaisseur de la lamelle lipidique et de la couche aqueuse dans une organisation lamellaire, la distance entre cylindres et le diamètre de ces derniers dans le cas de l’organisation hexagonale.
C’est la balance entre les géométries des parties polaires et hydrophobes des lipides qui détermine les différentes organisations lipidiques. Lorsque la conformation moyenne du lipide s’inscrit dans un cylindre, on a une organisation à courbure moyenne nulle comme la phase lamellaire (Figure 11 A). Si l’aire de la surface projetée de la partie polaire est plus faible que celle de la partie apolaire, le lipide s’inscrit dans un cône et on a alors affaire à une organisation hexagonale HII (Figure 11 B). L’organisation HII provient d’un changement de courbure, qui est alors non nulle et négative. Enfin, une surface de la partie polaire supérieure à celle de la partie apolaire implique que le lipide s’inscrit dans un cône inversé et l’organisation à courbure positive obtenue est alors de type HI (Figure 11 C).
|
Table des matières
Introduction générale
Introduction
Membranes cellulaires
1. Les lipides membranaires
1.1 Diacylphosphoglycérides (phospholipides)
1.2 Diacylglycoglycérides (glycolipides)
1.3 Sphingolipides
Sphingophospholipides
Sphingoglycolipides
1.4 Stérols
1.5 Composition lipidique des membranes : l’asymétrie
1.6 L’Hétérogénéité membranaire
2. Systèmes modèle des membranes biologiques
2.1 Liposomes
2.1.1 Vésicules multilamellaires (MLV)
2.1.2 Vésicules unilamellaires de petite taille (SUV)
2.1.3 Vésicules unilamellaires de taille moyenne (LUV)
2.1.4 Vésicules géantes unilamellaires (GUV)
3. Les géométries membranaires possibles
4. Fluidité membranaire
4.1 Fluidité et conformation des chaînes hydrocarbonées
5. Les phases lamellaires dans les membranes : gel, liquide et gel-ondulée
5.1 Phase lamellaire gel Lβ
5.2 Phases lamellaires liquides
5.3 Passage d’une phase gel à la phase liquide
5.4 Phase ondulée
6. Cholestérol
6.1 Cholestérol : influence sur l’organisation des phospholipides
6.2 Rôle du cholestérol dans la formation de phase liquide ordonnée au sein des membranes lipidiques
7. Nanodomaines des membranes
7.1 Les domaines radeaux
7.2 Radeaux et pathologies
Conclusion générale
Références
Télécharger le rapport complet
