Système reproducteur femelle

La biologie de reproduction

Méthodes morphologiques

Les critères de sélection d’ovocytes compétents les plus utilisés dans l’industrie sont basés sur les différents aspects morphologiques du complexe ovocyte-cumulus une fois retiré du follicule. L’évaluation de la structure du cumulus, du nombre de couches et de son organisation et l’évaluation du cytoplasme de l’ovocyte furent proposée comme un système de classification efficace (Blondin and Sirard, 1995). Les COCs sont classifiés selon un système à six différentes classes en continu. Les classes 1 et 2 représentent les COCs ayant un cytoplasme homogène entouré de plusieurs couches de cellules du cumulus compactes.
Les classes 3 à 6 sont la portion du spectre où les COCs ont un cytoplasme de plus en plus granuleux avec un cumulus incomplet ou en expansion progressive, la classe 6 étant une expansion de 100%. Les ovocytes de la classe 3, c’est-à-dire ceux qui présente un début d’expansion dans les cellules du cumulus et du début de granulation dans le cytoplasme de l’ovocyte sont ceux qui réussissent le mieux à se développer jusqu’au stade 16 cellules par rapport aux autres classes (Blondin and Sirard, 1995). Ces travaux ont permis de démontrer que le début de l’atrésie, observé dans la classe 3, a un effet bénéfique sur la compétence de l’ovocyte.

Méthodes moléculaires

Au cours des dernières années, les scientifiques ont accordé beaucoup d’importance à la recherche de critères moléculaires fiables pour définir le niveau de qualité de l’ovocyte et permettre la sélection du ou des meilleurs ovocytes afin d’augmenter le taux de succès en reproduction assistée.L’acquisition de la compétence au développement de l’ovocyte est associée avec le développement du follicule. Il est connu que l’ovocyte communique avec les cellules environnantes, en autre les cellules du cumulus et les cellules de granulosa et que la destinée de l’ovocyte repose sur l’intégrité des signaux du follicule et de sa dynamique de développement. Il fut démontré que les ovocytes récupérés cinq jours après l’émergence d’une vague folliculaire, durant la phase de plateau (phase entre le pic de FSH et de LH) se développent significativement plus jusqu’au stade de blastocyste comparativement aux ovocytes récupérés durant la phase de croissance (phase sous l’effet de la FSH, deux jours après l’émergence d’une vague folliculaire) et aux ovocytes récupérés en phase d’atrésie avancée (phase où les follicules régressent dû à leurs persistances dans l’ovaire, sept jours après l’émergence d’une vague folliculaire (Vassena et al., 2003). De plus, la phase de plateau correspond au moment où les follicules sont soumis aux premiers signes d’atrésie.Grâce aux techniques moléculaires, il devient possible d’utiliser les cellules folliculaires telles que les cellules de la granulosa afin de caractériser le statut du follicule d’origine des ovocytes et de prédire la compétence des ovocytes. Plusieurs études récentes suggèrent que le niveau de transcrit de certains gènes candidats (biomarqueurs) chez les cellules de la granulosa sont associés à la compétence développementale et le taux de succès en ART (Hamel et al., 2010; Jiang et al., 2010; Nivet et al., 2013, 2016; Uyar et al., 2013; Kordus and LaVoie, 2017).

Analyse des cellules de la granulosa

Il est bien connu que les cellules de granulosa communiquent de façon bidirectionnelle avec l’ovocyte lors de la folliculogenèse. Les cellules de granulosa jouent un rôle essentiel dans la différenciation du follicule menant aux conditions optimales pour la croissance de l’ovocyte, la maturation de l’ovocyte et l’ovulation (D’Aurora et al., 2016). La qualité des ovocytes peut être reliée à l’étape finale de maturation du follicule menant ainsi à un ovocyte de première qualité permettant une gestation saine. Dès le début des années 2000, une étude de Robert et al., 2001 a démontré la présence de gènes qui seraient associés avec la compétence au développement de l’ovocyte, ce qui supporte l’idée que le transcriptome des cellules de granulosa pourrait prédire la qualité de l’ovocyte et du succès en ART. Les cellules de granulosa sont habituellement jetées lors de la récolte des ovocytes, ainsi l’étude de l’expression des gènes associés à la compétence au développement de l’ovocyte dans les cellules de granulosa pourrait potentiellement devenir une méthode non invasive de routine pour déterminer la qualité folliculaire.Une étude préliminaire de Nivet et al., 2013 a démontré le rôle de la différenciation folliculaire en association avec la compétence des ovocytes dans un contexte de coasting.
Tout d’abord, il fut établi que le meilleur temps de coasting chez la vache sexuellement mature se retrouve entre 44 h et 68 h qui est la période de coasting optimale. Le temps de coasting de 20 h est associé avec une différentiation folliculaire tôt (Early differentiation) et le temps de coasting de 92 h est associé avec une différentiation folliculaire tardive (Late differentiation), ce qui représente les fenêtres maximales de récolte des ovocytes (voir figure 1-5). L’expérience de type micropuce de Nivet et al (2012) a permis l’analyse du transcriptome des cellules de granulosa des follicules des différents stades de compétence associés au coasting ; tôt, optimal et tard. Pour ce faire, la technologie des micropuces fut utilisée afin de comparer l’expression des gènes entre différents contrastes pour les temps de coasting, entre 20, 44, 68 et 92 h. Cette analyse a permis de découvrir les différentes fonctions cellulaires et les voies de signalisation associées avec le statut des follicules d’origine des ovocytes compétents et moins compétents, figure 1-5.
Deux autres études similaires ont aussi permis d’identifier les fonctions biologiques et les voies de signalisation associer avec le statut des follicules de tailles différentes dans les stades de croissance, de plateau et d’atrésie (Douville and Sirard, 2014; Girard et al., 2015b). Dans les deux cas, les études ont découvert plusieurs gènes candidats spécifiques au différents stades du follicule afin de distinguer la dynamique des follicules d’origines.
Les différentes études qui portent sur les biomarqueurs des cellules de granulosa démontrent que les cellules de granulosa obtenues lors de l’aspiration transvaginale des ovocytes ont le potentiel de donner l’information sur la qualité du follicule et de l’ovocyte. La récolte des cellules de granulosa à la suite de l’aspiration, au lieu de les jeter, permettrait de diagnostiquer la qualité de la stimulation ovarienne et le statut du follicule aspiré en lien avec la compétence au développement de l’ovocyte.

Table des matières

1. Introduction 
1.1. La biologie de reproduction
1.2. Système reproducteur femelle
1.3. Puberté 
1.3.1. Hormones sexuelles
1.4. Le cycle ovarien
1.4.1. Phase folliculaire
1.4.2. Ovulation
1.4.3. Phase lutéale
1.5. Folliculogenèse
1.6. Formation des gamètes femelles : Stade embryonnaire
1.6.1. Cellules germinales embryonnaires (PGCs)
1.6.2. Follicule primordial
1.7. Développement des follicules : Phase indépendante des gonadotrophines
1.7.1. Transition des follicules primordiaux aux follicules primaires
1.7.2. Transition des follicules primaires en follicules secondaires
1.7.2.1. Zona Pellucida
1.7.2.2. Jonctions communicantes
1.8. Développement des follicules : Phase dépendante des gonadotrophines 
1.8.1. Gonadotrophines et leurs récepteurs
1.8.2. Transition du follicule préantral au follicule antral
1.8.3. Recrutement, sélection et dominance du follicule
1.8.3.1. Stéroïdogénèse
1.9. Phase pré-ovulatoire : Pic pré-ovulatoire et ovulation 
1.9.1. Pic de LH
1.9.2. Production de progestérone
1.9.3. Expansion du cumulus
1.9.4. Rupture de la paroi folliculaire et ovulation
1.9.5. Réaction inflammatoire
1.10. Phase lutéale 
1.10.1. Formation du corps jaune
1.10.2. Lutéolyse
1.11. Concept de qualité des ovocytes 
1.12. Maturation de l’ovocyte
1.12.1. Maturation nucléaire
1.12.2. Maturation cytoplasmique
1.12.3. Maturation moléculaire
1.13. Techniques de reproduction assistée
1.13.1. Production animale et élevage sélectif
1.13.2. Manipulation hormonale et transfert d’embryon
1.13.3. Stimulation ovarienne chez la vache
1.13.4. Coasting
1.13.5. Stimulation ovarienne chez la génisse
1.14. Évaluation de la compétence des ovocytes 
1.14.1. Méthodes morphologiques
1.14.2. Méthodes moléculaires
1.14.2.1. Analyse des cellules de la granulosa
1.15. Hypothèse et objectifs 
2. Effect of cow age on the in vitro developmental competence of oocytes obtained following FSH stimulation/coasting treatments
2.1. Résumé 
2.2. Abstract 
2.3. Introduction
2.4. Material and methods 
2.4.1. Experimental design
2.4.2. Chemicals
2.4.3. Ovarian stimulation treatment and oocyte recovery
2.4.4. In vitro maturation
2.4.5. IVF
2.4.6. In vitro culture
2.4.7. Statistical analysis
2.5. Results
2.5.1. Effect of donor age on the number and size of follicles recovered
2.5.2. Effect of donor age on oocyte developmental competence
2.5.3. Effect of donor age on morula and blastocyst formation
2.5.4. Variability of individual responses to ovarian stimulation in terms of total number of aspirated follicles and blastocyst yield
2.6. Discussion 
2.7. Acknowledgements
2.8. Disclosure 
2.9. References
2.10. Figures
3. Granulosa cell gene expression, oocyte competence and embryo production in FSH-stimulated Holstein cows 
3.1. Résumé 
3.2. Abstract 
3.3. Introduction 
3.4. Materials and methods
3.4.1. Ethics statement
3.4.2. Experimental design
3.4.3. Chemicals
3.4.4. Ovarian stimulation treatment and granulosa cell collection
3.4.5. In vitro maturation
3.4.6. In vitro fertilisation
3.4.7. In vitro culture
3.4.8. RNA extraction and amplification
3.4.9. Sample labelling and microarray hybridisation
3.4.10. Microarray data analysis
3.4.11. Complementary DNA preparation and real-time PCR
3.4.12. Statistical analysis of real-time qPCR results
3.4.13. Ingenuity pathway analysis
3.5. Results
3.5.1. In vitro embryo production
3.5.2. Microarray analysis
3.5.3. Real-time qPCR
3.5.4. Ingenuity pathway analysis
3.6. Discussion
3.7. Declaration of interest
3.8. Funding 
3.9. References
3.10. Figures
3.11. Tables
3.12. Supplemental data
4. Effect of heifer age on the granulosa cell transcriptome after ovarian stimulation
4.1. Résumé
4.2. Abstract
4.3. Introduction
4.4. Materials and methods
4.4.1. Ethics statement
4.4.2. Chemicals
4.4.3. Animals
4.4.4. Ovarian stimulation and gamete collection .
4.4.5. IVM
4.4.6. IVF
4.4.7. In vitro culture
4.4.8. RNA extraction and amplification
4.4.9. Sample labelling and microarray hybridisation
4.4.10. Microarray data analysis
4.4.11. Functional analysis
4.4.12. Preparation of cDNA and quantitative real-time polymerase chain reaction
4.4.13. Statistical analysis of real-time qPCR results
4.5. Results
4.5.1. Reproductive performance of animals
4.5.2. Microarray analysis
4.5.3. Real-time qPCR validation
4.5.4. Functional analysis (IPA) and NetworkAnalyst
4.6. Discussion 
4.6.1. Conclusion and remarks
4.7. Acknowledgements and funding 
4.8. Declaration of interest
4.9. References
4.10. Figures
4.11. Supplemental data
5. Expression of atresia biomarkers in granulosa cells after ovarian stimulation in heifers
5.1. Résumé 
5.2. Abstract 
5.3. Introduction
5.4. Materials and methods
5.4.1. Ethics statement
5.4.2. Data retrieval
5.4.3. Meta-analysis of biomarkers of atresia
5.4.4. Analysis of biological functions and upstream regulators
5.4.5. Ovarian stimulation treatment and granulosa cell collection
5.4.6. RNA extraction
5.4.7. Complementary DNA preparation and quantitative real-time polymerase chain reaction
5.5. Results 
5.5.1. Meta-Analysis
5.5.2. Functional Analysis
5.5.3. Validation of Meta-analysis Gene Expression
5.6. Discussion 
5.6.1. Gene analysis
5.6.2. Functional Analysis
5.6.3. Conclusion
5.7. Acknowledgement
5.8. Funding 
5.9. Declaration of interest 
5.10. References
5.11. Figures
5.12. Tables
5.13. Supplemental data
6. Follicle capacitation: A meta-analysis to investigate the transcriptome dynamics following FSH decline in bovine granulosa cells
6.1. Résumé
6.2. Abstract 
6.3. Introduction
6.4. Materials and Methods
6.4.1. Data retrieval
6.4.2. Microarray meta-analysis association with FSH decline
6.4.3. Network-based meta-analysis
6.4.4. Analysis of biological functions and upstream regulators
6.4.5. Animals, ovarian stimulation and granulosa cells collection
6.4.6. Reverse transcriptase quantitative PCR
6.5. Results
6.5.1. Network-based meta-analysis of genes associated with oocyte competence
6.5.2. Functional Analysis
6.5.3. Validation of Meta-analysis Gene Expression
6.6. Discussion 
6.6.1. Effect of FSH decline on oocyte developmental competence
6.6.2. Conclusion
6.7. Acknowledgement 
6.8. Grant support
6.9. Declaration of interest 
6.10. References 
6.11. Figures
6.12. Table
6.13. Supplemental data
7. Conclusion générale
8. Bibliographie

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