Système rénine-angiotensine et système endothéline

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Mécanisme daction de aldostérone

Dans les cellules épithéliales polarisées, l’aldostérone diffuse de manière passive à travers la membrane plasmique puis vient se fixer sur un récepteur cytosolique, le récepteur minéralocorticoïde (RM), qui appartient à la superfamille des récepteurs nucléaires. Ce dernier est inactif lorsqu’il est lié à des protéines chaperones (telles que Hsp90, Hsp70 et les immunophyllines) qui le maintiennent dans une conformation réceptive pour son ligand. Une fois l’aldostérone fixée au domaine de liaison du ligand du RM, ce dernier change de conformation pour aller se transloquer dans le noyau de la cellule où il agit comme un facteur de transcription (Couette et al, 1996 ; Rogerson et al, 2004). Le RM se fixe ainsi sur l’ADN à des éléments de réponses qui sont des séquences consensus appelées HRE (Hormone Responsive Elements). Le RM recrute alors différents cofacteurs transcriptionnels afin de mettre en marche la machinerie transcriptionnelle (ARN polymerase) pour induire ou réprimer l’expression des gènes cibles de l’aldostérone (Pascual-Le Tallec et Lombes, 2005) (Figure I.2).
D’autres études ont pu montrer des effets rapides non génomiques de l’aldostérone, dont l’importance physiologique n’a pas encore été clairement définie (Mihailidou et Funder, 2005).

Physiopathologie

Des mutations inactivatrices du gène codant le RM sont responsables d’une forme autosomique dominante de pseudohypoaldostéronisme de type 1 (PHA1), caractérisée par des pertes de sels importantes chez le nouveau-né, conduisant à une hyponatrémie, une hyperkaliémie, associées à une résistance aux minéralocorticoïdes (Pujo et al, 2007). Cette pathologie souvent mortelle si elle n’est pas rapidement diagnostiquée, est traitée par simple compensation en sodium (plusieurs grammes par jour). La maladie deviendra alors asymptomatique chez l’adulte, qui toutefois gardera une forte appétence pour le sel (Pujo et al, 2007).
Il existe aussi une autre pathologie humaine fréquente appelée ‘’syndrome d’excès apparent de minéralocorticoïdes’’ (AME pour Apparent Mineralocorticoid Excess) (voir plus loin paragraphe I.5.2 ) chez laquelle le RM va être en permanence activé par le cortisol, au lieu de l’aldostérone. Ce syndrome peut être dû à deux causes :
– soit des mutations inactivatrices de l’enzyme, la 11β-hydroxystéroïde déshydrogénase de type 2 (11β-HSD2), qui est chargée normalement de métaboliser le cortisol en forme inactive, la cortisone.
– soit une intoxication par la liquorice, provenant de la racine de la réglisse. Cette dernière inhibe l’action de l’enzyme 11β-HSD2.
Ces situations vont conduire à une rétention sodée excessive, provoquant une hypertension et une hypokaliémie forte, pouvant entraîner des problèmes cardiaques graves (tachycardie et fibrillation ventriculaire).

Les glucocorticoïdes et le r écepteur des glucocorticoïdes (RG)

Les glucocorticoïdes (GCs) sont des hormones stéroïdiennes synthétisées à partir du cholestérol dans les zones fasciculée et réticulée des glandes surrénales (voir
paragraphe I.1 ).

Rôles des glucocorticoïdes

Les récepteurs aux glucocorticoïdes sont retrouvés dans presque tous les types cellulaires et permettent aux GCs de jouer plusieurs rôles dans I’organisme, notamment au niveau du métabolisme, dans les systèmes immunitaire et cardiovasculaire ainsi que dans le rein (Greenspan et Strewler, 1997). C’est au niveau de ce dernier que nos travaux de recherche se sont précisément portés.

Métabolisme intermédiaire

Les GCs augmentent la néoglucogenèse, à savoir la formation de glycogène et la disponibilité de substrats dérivés de protéines et de lipides. Au niveau du foie, ils stimulent certaines enzymes impliquées dans la néoglucogenèse et augmentent la réactivité aux hormones néoglucogénétiques. Dans les muscles, ils diminuent le recaptage des acides aminés et la synthèse protéique. Ils augmentent la lipolyse dans les cellules adipeuses. Toutes ces actions ont pour but de maintenir les taux de glucose dans le sang (Binkley, 1995).

Système immunitaire

Les GCs ont une action anti-inflammatoire bien décrite dans la littérature et sont à cet effet souvent utilisés en milieu médical. Ils agissent notamment sur le mouvement et la fonction des leucocytes. Ils diminuent le nombre de lymphocytes, de monocytes et d’éosinophiles en circulation. De plus, ils diminuent aussi la migration des cellules immunitaires vers les sites d’inflammation (Greenspan et Strewler, 1997).

Système cardiovasculaire

Les GCs agissent aussi au niveau du cœur et des vaisseaux. Ils jouent un rôle important dans le contrôle de la réactivité vasculaire en potentialisant les réponses vasoactives aux catécholamines (Yang et Zhang, 2004) On observe une augmentation de l’artériosclérose chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde et qui reçoivent un traitement aux corticostéroïdes prolongé (Kalbak, 1972). De plus, des rats soumis à des exercices et recevant un traitement aux glucocorticoïdes développent une hypertrophie cardiaque (Kurowski et al, 1984).
D’autre part, en excès, les glucocorticoïdes augmentent la pression artérielle. Cet excès peut survenir dans le cas de la maladie de Cushing, ou comme c’est le cas plus fréquemment, après corticothérapie (Whitworth, 1994). Les conséquences sont entre autres: I’obésité prédominante au niveau du tronc et des membres, l’ostéoporose, l’intolérance au glucose, le diabète, les cataractes, les calculs rénaux et l’hypertrophie du ventricule gauche (Binkley, 1995). 80% des patients atteints de la maladie de Cushing et 20% des sujets sous corticothérapie sont hypertendus (Grünfeld et Eloy, 1987 ; Whitworth, 1994 ; Walker et al, 1996).
L’hypertension induite par les GCs se caractérise par une augmentation rapide de la pression artérielle (en 24 heures) et cette augmentation est indépendante de la teneur en sel de la diète (Clarke et al, 1968 ; Elijovich et Krakoff, 1980 ; Okuno et al, 1981 ; Whitworth et al, 1979, 1994). Chez ces sujets hypertendus, bien que l’on observe une légère rétention en sodium, il a été démontré que le mécanisme par lequel les glucocorticoïdes agissent, est en majeure partie indépendant de l’activation du récepteur RM (Whitworth et al, 1979, 1989 ; Yagil et al, 1986). L’hypertension induite par les GCs serait plutôt due à une augmentation des résistances vasculaires périphériques (Okuno et al, 1981 ; Yagil et al, 1986 ; Grünfeld et Eloy, 1987 ; Whitworth et al, 1997).
Inversement, l’hypotension est associée à une déficience en glucocorticoïdes comme dans le cas de la maladie d’Addison (Binkley, 1995 ; Greenspan et Strewler, 1997).
Les GCs jouent donc un rôle important dans le maintien de l’homéostasie du système cardiovasculaire.

Le tube contourné proximal (PCT)

Il récupère 60% du sodium et de l’eau filtrés par le glomérule ainsi qu’une grande partie du glucose, du potassium, des phosphates, des acides aminés et des protéines.
Il réabsorbe une partie de l’urée et de la créatine. Il rejette par un système d’antiport le H+ et le K+. En cas d’acidose, il produit du NH4+ et il participe à la néoglucogenèse (Grantham et Wallace, 2002).

Lanse de Henlé (TAL)

Sur le plan fonctionnel, l’anse de Henlé joue un rôle important dans la concentration finale de l’urine en électrolytes. 30% du sodium filtré est réabsorbé à ce niveau. La partie descendante laisse librement diffuser l’eau mais peu d’électrolytes, le filtrat y devient donc hypertonique. Au niveau des anses de Henlé larges et ascendantes, il y a passage de Cl-, Na+ et K+ mais pas de passage d’eau (Grantham et Wallace, 2002). L’interstitium devient hyperosmotique et le filtrat hypoosmotique.

Le tube contourné distal (DCT)

Le tube contourné distal fait directement suite à l’anse de Henlé à l’endroit où celle-ci remonte vers le glomérule. Les cellules du tube distal sont capables, sous l’action de l’aldostérone, de réabsorber activement le sodium (7%) et d’excréter du potassium, l’eau suivant passivement le sodium. Enfin le tube distal joue un rôle important dans le maintien de l’équilibre acide-base du sang, en sécrétant dans l’urine tubulaire des ions hydrogène et ammonium (Grantham et Wallace, 2002).

Les tubes collecteurs (CD)

Quittant les tubes distaux, l’urine pénètre dans des tubes collecteurs qui confluent les uns avec les autres pour devenir de plus en plus larges et finalement aboutir dans des tubes papillaires (ou de Bellini), dont les extrémités aboutissent à l’area cribrosa. Les tubes collecteurs occupent la plus grande partie de la région médullaire. Essentiellement rectilignes, les CD confluent vers le sommet des papilles rénales. Les plus petits ont un diamètre d’environ 40 µm et sont bordés d’une couche de cellules épithéliales principales et des cellules intercalaires. Les cellules intercalaires sont riches en anhydrase carbonique et jouent un rôle important dans le contrôle acido-basique. Au fur et à mesure que les tubes s’élargissent, pour atteindre un calibre maximum de 300 µm, les cellules bordantes deviennent de plus en plus hautes.
Les 2% de sodium restant sont réabsorbés au niveau du tubule connecteur (CNT) et du canal collecteur (CD). Ainsi, le rein filtre environ 25 moles de sel par jour et moins de 1% sera finalement excrété dans les urines (Grantham et Wallace, 2002).
L’aldostérone agit à ce niveau sur les tubules rénaux pour diminuer l’excrétion de sodium et d’eau, et ainsi augmenter le volume sanguin, et contrôle la sécrétion de H+ et K+.

Action génomique de aldos térone dans le néphron distal

L’aldostérone régule la réabsorption de sodium de l’urine vers le plasma dans le tubule collecteur cortical (CCD pour Cortical Collecting Duct) en induisant, en quelques heures, une augmentation de la réabsorption de Na+ par les cellules épithéliales principales (Bonvalet et al, 1995). Le canal épithélial à sodium sensible à l’amiloride, ENaC (Epithelial sodium channel), situé au niveau de la membrane apicale, ainsi que la pompe Na/K-ATPase, exclusivement basolatérale, représentent les principales cibles moléculaires du RM impliquées dans ce processus. Le canal apical ENaC permet l’entrée du sodium luminal dans la cellule, et la pompe Na/K-ATPase basolatérale permet l’extrusion du sodium vers les espaces extracellulaires.
L’ensemble de ces processus induit un gradient transépithélial de la réabsorption de sodium depuis la lumière tubulaire vers le milieu intérieur. L’aldostérone joue ainsi un rôle essentiel dans l’homéostasie sodique, et par conséquent dans le contrôle de la volémie et de la pression artérielle (Bonvalet, 1998).
En parallèle, l’aldostérone favorise aussi l’excrétion de potassium par les cellules principales du CCD en stimulant le canal potassique ROMK (Kir1.1 pour Inward rectifying K channel), situé du côté apical de la cellule (Yoo et al, 2003).
Des travaux réalisés in vitro sur des cultures primaires de tubules collecteurs de lapins, des lignées A6 de cellules distales d’amphibien et des lignées de cellules de tubules collecteurs de rat RCCD2 (pour Rat Cortical Collecting Duct 2) ont permis de décrire précisément l’action de l’aldostérone sur le transport de sodium (Fejes-Toth et Naray- Fejes Toth, 1987 ; Horisberger et Rossier, 1992 ; Djelidi et al, 2001). L’action de l’aldostérone s’articule en trois phases:
1) une phase de latence d’environ 1h sans modification du transport de Na+.
2) une phase précoce, deux heures après stimulation par l’aldostérone, marquée par une augmentation du transport de sodium et une diminution rapide de la résistance transépithéliale. Des protéines précocément induites ou des modifications de protéines préexistantes pourraient avoir lieu au cours de cette période sous l’action de l’aldostérone.
3) une phase tardive, caractérisée par un transport de sodium toujours élevé sans nouvelle modification de la résistance transépithéliale. La stimulation par l’aldostérone de la transcription de certaines sous-unités du canal ENaC et de la pompe Na/K-ATPase intervient au cours de cette phase augmentant ainsi leur synthèse protéique dans le CCD (Escoubet et al, 1997).

Le canal sodique apical sensible à amiloride (ENaC)

Dans le CNT et le CCD, le sodium du fluide tubulaire entre dans les cellules via le canal épithélial à sodium ENaC. Ce canal présente la spécificité d’être inhibé par l’amiloride. L’activité et l’expression du canal sont principalement régulées par deux hormones : la vasopressine et l’aldostérone. Dans le tubule distal, ENaC constitue l’étape limitante de la réabsorption du sodium qui est ensuite dirigé vers les espaces extracellulaires par la pompe Na/K-ATPase.
Le canal ENaC est composé de trois sous-unités (s.u) homologues α, β et γ qui s’organisent en un complexe hétéro-tétramérique 2α/1β/1γ et qui ont été clonées à partir du colon de rat (Lingueglia et al, 1993 ; Canessa et al, 1994 ; Firsov et al, 1998 ; Rossier et al, 2002). Chaque sous-unité est constituée de:
– deux domaines transmembranaires.
– une large boucle extracellulaire, comportant des sites de glycosylation.
– deux régions conservées, riches en cystéine, lesquelles seraient impliquées dans l’adressage membranaire du canal (Firsov et al, 1999).
– et une partie intracellulaire formée par les extrémités N- et C- terminales, comportant des sites de régulation (Firsov et al, 1998). L’extrémité N-terminale contient des sites potentiels de phosphorylation, d’ubiquitination, et des résidus conservés par les trois sous-unités, importants dans le maintien de la probabilité d’ouverture du canal (Grunder et al, 1999). L’extrémité C-terminale possède deux domaines P1 et P2, riches en proline, dont la reconnaissance spécifique par des protéines régulatrices participerait à l’adressage et à la régulation du canal (Rotin et al, 1994 ; Staub et al, 1996) Seule la s.u α peut former des canaux fonctionnels.
L’aldostérone régule le canal ENaC de façon tissu-spécifique en stimulant soit la transcription de la s.u α du canal dans le CCD, soit la transcription des s.u β et γ dans le colon distal (Escoubet et al, 1997). Cette régulation différentielle pourrait s’expliquer par la coopération du RM avec des co-activateurs transcriptionnels exprimés de manière tissu-spécifique. L’aldostérone peut également agir de manière indirecte sur l’activité du canal ENaC, en stimulant la transcription de la kinase Sgk1 (Serum- glucocorticoid-regulated kinase 1) qui active le canal ENaC par phosphorylation (Naray-Fejes-Toth et al, 1999).
Les mutations perte de fonction retrouvées dans chacune des sous-unités du canal sont à l’origine de la forme récessive et sévère de pseudohypoaldostéronisme de type 1 (PHA1) caractérisée par une perte de sel et une déshydratation chez le nouveau-né (Chang et al, 1996 ; Strautniek et al, 1996). Des mutations gain de fonction ont été retrouvées sur le dernier exon des gènes des s.u β et γ et provoquent une activation constitutive du canal. Elles sont à l’origine du syndrome de Liddle, caractérisé par une hypertension précoce, une hypokaliémie associée à une alcalose métabolique et des taux bas de rénine et d’aldostérone (Hansson et al, 1995 ; Abriel et al, 1999). Ces mutations perturbent l’interaction du canal ENaC avec la protéine Nedd4.2, protéine qui, lorsqu’elle est active, entraîne l’ubiquitination et la dégradation du canal ENaC (Staub et al, 2000).

La pompe Na/K TPase basolatérale

L’entrée apicale de sodium dans les cellules principales en réponse à une stimulation par l’aldostérone induit une augmentation de l’activité de la pompe Na/K-ATPase basolatérale (Blot-Chabaud et al, 1996). La pompe est composée de deux sous-unités α et β et permet la sortie de 3 ions Na+, contre l’entrée de 2 ions K+ en hydrolysant une molécule d’ATP (Horisberger et al, 1991). Elle possède une expression ubiquitaire et chacune de ses sous-unités présente plusieurs isoformes réparties dans différents tissus. Les isoformes α1 et β1 sont exprimées dans la quasi-totalité des cellules alors que les isoformes α2, α3 et β2 sont spécifiques des cellules excitables (neurones, cellules musculaires) (Sweadner, 1989). La s.u α assure la fonction enzymatique de la pompe alors que la s.u β assure le contrôle de sa durée de vie et son ancrage membranaire (Lingrel et Kuntzweiler, 1994). En plus de créer un gradient pour la réabsorption vectorielle de sodium dans certains épithélia de transport, le rôle fondamental de la pompe Na/K-ATPase est de maintenir de faibles concentrations intracellulaires de sodium (10-15M) ainsi que de fortes concentrations de potassium (100mM). La concentration intracellulaire de sodium régule instantanément l’activité de la pompe.
D’autre part, plusieurs équipes ont montré que l’aldostérone régulait au niveau du CCD l’expression des sous-unités de la pompe Na/K-ATPase. Dans la lignée de cellules d’amphibien A6, issues de la partie distale du néphron, l’aldostérone induit en quelques heures l’augmentation d’un facteur 2 à 4 la transcription des gènes des s.u α et β de la pompe (Verrey et al, 1989). Farman et ses collaborateurs ont montré que la quantité des messagers de la s.u α1 diminue dans le CCD de rats surrénalectomisés (sans modification de la s.u β1) et que cette baisse est compensée par l’apport exogène d’aldostérone (Farman et al, 1992, 1999). D’autre part, dans le CCD des mammifères l’aldostérone induit une augmentation de l’ARNm et de l’expression de la protéine α1, qui conduit à une augmentation du nombre de pompes Na/K-ATPase au niveau de la membrane basolatérale permettant ainsi de constituer un pool de réserve (Tumlin et al, 1994 ; Blot-Chabaud et al, 1990).

Physiopathologie : Syndrôme dexcès apparent de minéralocorticoïdes (AME pour Apparent Mineralocorticoid Excess)

Les patients souffrant du syndrome AME présentent une HTA associée à de faibles taux plasmatiques du système rénine-angiotensine-aldostérone, malgré la persistance d’une activité minéralocorticoïde rénale (Ulick et al, 1979). Le syndrome AME est de plus associé à une faible excrétion urinaire de cortisone (et de ses dérivés) tandis que la concentration de cortisol reste normale. Une étude réalisée par l’équipe de Stewart a révélé que l’ingestion chronique de réglisse donnait un tableau clinique similaire (Stewart et al, 1987) or les principes actifs de la réglisse, les acides glycyrrhizique et glycyrrhétinique, inhibent la 11β-HSD2. Chez tous ces patients, des mutations inactivatrices de l’enzyme ont pu être identifiées (Mune et al, 1995 ; Wilson et al, 1995 ; Draper et Stewart, 2005). Le lien de cause à effet a pu être établi à l’aide d’un modèle de souris où le gène codant pour la 11β-HSD2 est délété, et qui reproduit le tableau clinique de ce syndrome (Kotelevtsev et al, 1999).
Le mécanisme pathologique consiste en l’activation constante et inappropriée du RM par les GCs, ce qui conduit à une diminution importante du rapport sodium sur potassium urinaire. L’implication du RM dans ce syndrome a été mise en évidence par l’effet bénéfique du traitement des patients par la spironolactone (antagoniste du RM) (Draper et Stewart, 2005). De façon similaire, chez des rats surrénalectomisés traités par de la corticostérone et de la carbenexolone (inhibiteur de la 11β-HSD2), un antagoniste du RM corrige les excrétions sodées et potassiques (Souness et Morris, 1991).
En condition physiologique, l’activité de la 11β-HSD2 soulève la question de l’accès des GCs à leur récepteur RG. Une autre enzyme, la 11β-HSD1 (exprimée surtout dans le foie) catalyse la réaction inverse de la 11β-HSD2 et régénère des GCs actifs à partir de leurs formes inactives (Draper et Stewart, 2005). La co-localisation subcellulaire des deux enzymes et des récepteurs corticostéroïdes pourrait suggérer une possible coexistence des deux signalisations induites par le RM ou le RG. Ainsi, la 11β-HSD2 apparaît comme un facteur de régulation important du maintien de l’homéostasie du sodium et du potassium, complémentaire à l’action minéralocorticoïde de l’aldostérone (Yukinori et al, 2006).

Modèle de surexp ression globale du RM (P1RM)

Ce modèle a été obtenu par l’équipe de Marc Lombes, par surexpression du RM grâce à l’utilisation de l’un de ses promoteurs proximaux endogènes (P1) qui avait été préalablement caractérisé (Zennaro et al, 1996 ; Le Menuet et al, 2000). Les auteurs présentent les résultats obtenus dans deux lignées transgéniques indépendantes qui expriment le transgène RM notamment dans les testicules, les poumons, le cœur, le rein, le colon et le cerveau (Le Menuet et al, 2001). La surexpression globale du RM conduit à une atteinte rénale. L’analyse histologique des reins révèle une dilatation tubulaire avec la présence de cellules vacuolisées ou nécrotiques. Il n’apparaît pas de différence de filtration glomérulaire et du débit urinaire de sodium par rapport aux contrôles. En revanche, l’excrétion urinaire de potassium et de chlore est diminuée de 30%. Comme la kaliémie est normale, ce résultat suggère une augmentation de la réabsorption de potassium pour palier une déplétion chronique. Pour des raisons inexpliquées, l’aldostéronémie augmente de 30% chez les souris transgéniques, participant probablement à l’activation du RM et à un déséquilibre de la balance Na/K. Ce phénotype rénal serait compatible avec les modifications morphologiques rénales observées chez des patients présentant un adénome surrénalien associé à une élévation des taux sériques et de l’excrétion urinaire d’aldostérone (Torres et al, 1990).
Aucune fibrose n’est mise en évidence dans le myocarde des souris P1-hRM qui ne développent pas d’hypertension artérielle mais qui ont une fréquence cardiaque augmentée. Dans 15% des cas, les souris transgéniques ont des troubles du rythme: soit des arythmies, soit des salves de tachycardie. Ces observations vont dans le sens des effets bénéfiques du blocage du RM en clinique humaine (études RALES et EPHESUS) qui permettrait notamment une diminution des morts subites par trouble du rythme. L’étude échographique des souris transgéniques montre une cardiomyopathie dilatée modérée d’origine inconnue. Il est possible que le phénotype cardiaque soit davantage la conséquence du phénotype rénal que le reflet d’une action directe du RM dans le cœur. Les troubles du rythme cardiaque pourraient être secondaires aux possibles modifications de la balance potassique. L’absence de fibrose souligne que l’action du RM seul n’est pas suffisante pour induire ce remodelage.

Modèle invalidation du gène RM

Les souris inactivées de manière constitutive pour le gène du RM (souris RM-/-) développent, au cours de leur première semaine de vie, les symptômes du pseudohypoaldostéronisme et meurent autour de J10 post-partum (Berger et al, 1998). Des mesures réalisées à J8 post-partum montrent que les souris RM-/- sont hyponatrémiques, hyperkaliémiques, et hypovolémiques, comme en témoigne l’augmentation de l’hématocrite. L’hypovolémie et l’hyponatrémie ont pour conséquence d’activer considérablement le système rénine-angiotensine-aldostérone afin de restaurer le volume sanguin. Normale à la naissance, la concentration de rénine plasmatique devient, à J8 post-partum, 440 fois plus élevée chez les souris RM-/-. La concentration d’Ang II augmente de 50 fois, et l’aldostéronémie suit en augmentant de 65 fois. L’analyse histologique révèle une hyperplasie des cellules productrices de rénine de l’appareil juxtaglomérulaire. La filtration glomérulaire ne diffère pas entre les souris contrôles et les souris RM-/-, mais une fuite rénale de sodium, non compensée, est responsable de la mortalité.
L’équipe du Pr Pierre Corvol (Inserm U36, Collège de France) a exploré plus précisément le niveau d’expression des différents composants du SRAA dans ces souris RM-/- âgées de 8 jours. L’expression de la rénine est fortement stimulée dans la surrénale et dans le rein. De la même façon, l’expression de l’angiotensinogène et du récepteur AT1 est augmentée dans le foie. Les autres éléments du SRAA ne seraient pas affectés (Hubert et al, 1999).
L’étude de ce modèle montre que l’expression du RM est indispensable à la survie dans des conditions normales. L’administration d’un excès de sel aux souris RM-/- leur permet de survivre au-delà de 10 jours et d’atteindre l’âge adulte.
Récemment, l’équipe de G. Schütz à Heidelberg (Allemagne) a développé un modèle conditionnel (utilisation du système Cre/LoxP) d’inactivation du gène du RM dans le rein, à l’aide du promoteur du gène de l’aquaporine 2 (AQP2) (Ronzaud et al, 2007). Le gène AQP2 code pour un canal responsable du transport de l’eau, coexprimé avec le canal apical sodique ENaC au niveau des cellules principales du canal collecteur (CD) et du tubule connecteur (CNT).
Contrairement aux souris RM-/- décrites précédemment, les souris invalidées pour le gène du RM spécifiquement dans les cellules principales rénales (MRAQP2Cre), survivent et se développent normalement. En conditions basales, les souris MRAQP2Cre ne présentent pas d’altération de l’excrétion sodée. Toutefois, sous régime hyposodé, les souris MRAQP2Cre ont une excrétion urinaire de sodium et d’eau plus élevée de 70% par rapport aux souris contrôles, soumises au même régime, avec une prise de nourriture et de boisson comparable. Cette perte massive d’eau et de sel est associée à une perte de poids continue et une hyperkaliémie. D’autre part, sous régime standard et hyposodé (pendant 10 jours), les souris MRAQP2Cre montrent une aldostéronémie dix fois plus élevée par rapport aux souris contrôles.
De manière surprenante, l’activité du canal ENaC est conservée chez les souris MRAQP2Cre. Les auteurs montrent, par immunohistochimie, que les 3 sous-unités du canal ENaC sont présentes dans la partie terminale du tubule distal et la partie initiale du CNT, ce qui permettrait d’assurer la réabsorption de sodium chez les souris MRAQP2Cre. Ils émettent l’hypothèse de l’existence de mécanismes de compensation au niveau de la partie terminale du DCT et de la partie initiale du CNT. Sous régime hyposodé, les souris MRAQP2Cre n’arrivent plus à compenser la perte spécifique du RM dans la partie terminale du CNT et du CD.
L’étude de ce modèle montre pour la première fois, in vivo, le rôle crucial du RM dans la régulation de la réabsorption de sodium via le canal ENaC.

Modèles transgéni ques conditionnels ciblés

Les effets multiples de l’aldostérone ainsi que la distribution tissulaire large du RM compliquent l’analyse de leur contribution spécifique à la physiopathologie cellulaire et/ou tissulaire. Les modèles transgéniques conditionnels et/ou inductibles permettent un contrôle spatio-temporel de l’expression du gène d’intérêt spécifiquement dans des cibles sélectionnées, mais également un contrôle précis de l’expression au cours du temps. L’approche ciblée évite la possibilité de phénomènes secondaires dus aux altérations de l’homéostasie ionique ou aux perturbations globales induites par l’aldostérone, et se focalise sur le rôle spécifique du RM dans les cardiomyocytes.

Modèle de sousxpressi on conditionnelle du RM dans le cur

Le laboratoire du Dr Frédéric Jaisser a développé un modèle conditionnel (utilisation du système inductible tétracycline OFF) de sous-expression du RM spécifiquement dans les cardiomyocytes, par expression d’un ARN antisens du RM endogène de souris grâce au promoteur αMHC (Yu et al, 1996 ; Beggah et al, 2002). La diminution de moitié de l’expression du RM est associée au développement d’une cardiopathie hypertrophique dilatée sévère conduisant au décès des animaux. L’examen histologique révèle une désorganisation importante et un remodelage du tissu myocardique associé à une fibrose interstitielle majeure. L’analyse histologique indique qu’il n’y a pas de remodelage vasculaire (fibrose) ni de nécrose. L’analyse fonctionnelle par échocardiographie révèle des signes patents d’insuffisance cardiaque au niveau de la fraction d’éjection et de la vitesse de raccourcissement des fibres cardiaques qui sont diminuées. Il est important de noter que cette atteinte sévère du myocarde se développe en absence de modification de la pression artérielle et de la concentration circulante en hormones corticostéroïdes. De plus, le traitement des souris par la spironolactone (20mg/kg/j) aggrave le phénotype, en augmentant l’index cardiaque et la fibrose. L’administration de la Doxycycline (Dox), dès l’accouplement, puis au cours de la vie, prévient l’apparition du phénotype. La Dox administrée pendant 1 mois aux animaux malades permet une régression totale de la fibrose, de l’hypertrophie du myocarde et le recouvrement de la fonction cardiaque.
Dans le modèle du rat aldo/sel, l’hyperaldostéronisme provoque une fibrose interstitielle et périvasculaire réversible par le traitement des animaux par la spironolactone. Dans ce modèle, la forte stimulation du RM exprimé dans les cardiomyocytes favorise l’apparition d’une fibrose cardiaque. Dans le modèle de sous-expression du RM, l’expression d’un ARN antisens du RM induit une diminution de l’activité de ses voies de signalisation et également une fibrose. Ces données apparaissent contradictoires, mais ne le sont pas forcément, si l’on considère que dans le modèle aldo/sel, la concentration plasmatique de l’hormone ainsi que la teneur en sel sont modulées, alors que le modèle de sous-expression du RM concerne uniquement le récepteur, sans modification des taux plasmatiques de l’aldostérone.
D’autre part, dans les cardiomyocytes, aucune activité 11β-HSD2 n’a pu être démontrée, ainsi les glucocorticoïdes pourraient se lier au RM. Il est donc possible que la sous-expression du RM dans les cardiomyocytes entraîne un déséquilibre du ratio RM/RG, se traduisant par une hyperactivité RG. Cette hypothèse sera explorée dans le chapitre VII à l’aide d’une approche génétique de surexpression du RG dans les cardiomyocytes (permettant de s’affranchir de la toxicité des inhibiteurs du RG). J’ai participé à la caractérisation du phénotype moléculaire de ces dernières souris au cours d’un travail qui a fait l’objet d’une publication récente (Sainte-Marie et al, 2007, publication dans le Chapitre VII).

Modèle de surexpression conditionnelle du RM dans le cur

Un modèle en miroir a été développé par l’équipe de Frédéric Jaisser, permettant la surexpression inductible du RM dans les cardiomyocytes (souris αMHC-tTA/tetO-hRM) (Ouvrard-Pascaud et al, 2005). J’ai participé au début de ma thèse à la caractérisation moléculaire du modèle (publication dans le Chapitre VII). Les résultats montrent que les souris surexprimant le RM présentent une mortalité embryonnaire entre les jours E12.5 et E14.5 de développement. Cette mortalité disparaît après administration de Dox ou de spironolactone. L’histologie cardiaque des souris est normale (pas de fibrose, ni d’inflammation), ce qui suggère un défaut fonctionnel et non structural. L’analyse de l’électrocardiogramme (ECG) montre un trouble de la repolarisation (allongement de l’intervalle QT), ainsi que la présence d’extrasystoles ventriculaires responsables du phénotype de mortalité. En effet, la mortalité des souris peut également être prévenue par l’administration d’un β-bloquant agissant sur l’arythmie. Il faut noter que l’aldostéronémie et les ionogrammes sont normaux chez ces souris, indiquant que les troubles du rythme ne sont pas secondaires à une modification des balances ioniques. Des expériences réalisées sur des cardiomyocytes isolés de souris αMHC-tTA/tetO-hRM ont montré que les troubles de la conduction sont associés à des modifications électrophysiologiques par allongement de la durée du potentiel d’action. L’étude des courants ioniques responsables du potentiel d’action révèle une augmentation du courant calcique de type L et une diminution du courant potassique précoce (Ito). Ces modifications des courants ioniques peuvent être prévenues par la spironolactone, démontrant l’implication de l’activité du RM, in vivo, dans le développement du phénotype cardiaque. La surexpression du RM dans les cardiomyocytes conduit donc à un important remodelage ionique à l’origine des troubles du rythme.

Table des matières

INTRODUCTION…
CHAPITRE I – RÔLE PHYSIOPATHOLOGIQUE DE L’ALDOSTERONE ET DU RECEPTEUR MINERALOCORTICOÏDE DANS LE REIN.
I-1 L’ALDOSTERONE ET LES RECEPTEURS NUCLEAIRES
I-1.1 Biosynthèse de l’aldostérone.
I-1.2 Mécanisme d’action de l’aldostérone.
I-1.3. Le récepteur minéralocorticoïde (RM).
I-1.3.1 Structure.
I-1.3.2 Physiopathologie.
I-1.4 Les glucocorticoïdes et le récepteur des glucocorticoïdes (RG).
I-1.4.1 Régulation
I-1.4.2 Transport et métabolisme.
I-1.4.3 Mécanismes d’action.
I-1.4.4 Rôles des glucocorticoïdes.
I-1.4.4.1 Métabolisme intermédiaire.
I-1.4.4.2 Système immunitaire
I-1.4.4.3 Système cardiovasculaire.
I-1.4.4.4 Autres effets.
I-1.4.4.5 Rein
I-2 LE NEPHRON DISTAL SENSIBLE A L’ALDOSTERONE (ASDN).
I-2.1 Généralités: Fonction et Régulation du rein.
I-2.2 La rénine.
I-2.3 Le tube rénal
I-2.3.1 Le tube contourné proximal (PCT).
I-2.3.2 L’anse de Henlé (TAL).
I-2.3.3 Le tube contourné distal (DCT)
I-2.3.4 Les tubes collecteurs (CD)
I-2.4 Action génomique de l’aldostérone dans le néphron distal.
I-2.4.1 Le canal sodique apical sensible à l’amiloride (ENaC).
I-2.4.2 La pompe Na/K-ATPase basolatérale
I-2.4.3 Le canal potassique apical ROMK
I-2.5 Mécanisme enzymatique de sélectivité : la 11?-hydroxystéroïde déshydrogénase de type 2.
I-2.5.1 Mécanisme
I-2.5.2 Physiopathologie : Syndrôme d’excès apparent de minéralocorticoïdes (AME pour Apparent Mineralocorticoid Excess).
I-2.5.3 Autres mécanismes.
I-2.5.4 Conclusion
I-3 LES PROTEINES INDUITES PAR L’ALDOSTERONE (AIPS)
I-3.1 Sgk1 (Serum- and glucocorticoid-induced kinase).
I-3.2 GILZ (Glucocorticoid induced leucine zipper).
I-3.3 Autres AIPs (K-Ras, CHIF, NDRG2).
CHAPITRE II – RÔLE PHYSIOPATHOLOGIQUE DE L’ALDOSTERONE ET DU RECEPTEUR MINERALOCORTICOÏDE DANS LE SYSTEME CARDIOVASCULAIRE
II-1 ALDOSTERONE ET CΠUR
II-1.1 La fonction cardiaque
II-1.2 Etudes cliniques : RALES et EPHESUS
II-1.2.1 Etude RALES.
II-1.2.2 Etude EPHESUS.
II-1.2.3 Conclusion
II-1.3 Modèles transgéniques.
II-1.3.1 Modèles transgéniques globaux.
II-1.3.1.1 Modèle de surexpression globale du RM (P1-hRM).
II-1.3.1.2 Modèle d’invalidation du gène RM.
II-1.3.2 Modèles transgéniques conditionnels ciblés
II-1.3.2.1 Modèle de sous-expression conditionnelle du RM dans le coeur
II-1.3.2.2 Modèle de surexpression conditionnelle du RM dans le coeur.
II-1.3.2.3 Modèle de surexpression de l’aldosynthase dans le coeur.
II-1.3.2.4 Modèle de surexpression de la 11?-HSD2 dans le coeur.
II-1.3.2.5 Conclusion.
II-2 ALDOSTERONE ET VAISSEAUX.
II-2.1 Les vaisseaux sanguins.
II-2.2 L’endothélium vasculaire.
II-2.2.1 Structure et fonction de l’endothélium.
II-2.2.2 Dysfonction endothéliale.
II-2.3 La cellule musculaire lisse vasculaire (CMLv).
II-2.3.1 Structure et fonction de la CMLv.
II-2.3.2 Mécanisme de la contraction/relaxation de la CMLv.
II-2.3.2.1 Homéostasie du calcium intracellulaire des CMLv
II-2.3.2.2 Mécanisme moléculaire de la contraction de la CMLv.
II-2.3.2.3 Relaxation de la CMLv.
II-2.3.3 Rôles des canaux potassiques (KCa).
II-2.3.3.1 La famille des canaux SKCa
II-2.3.3.2 Les canaux BKCa.
II-2.4 La communication endothélium – CMLv.
II-2.4.1 Les jonctions gap
II-2.4.2 Les ions potassium
II-2.4.3 Les dérivés de la cytochrome P450 monooxygénase.
II-2.4.4 Conclusion
II-2.5 Systèmes et facteurs impliqués dans le contrôle de la fonction vasculaire.
II-2.5.1 Le système rénine-angiotensine (SRA) classique et tissulaire.
II-2.5.1.1 Biosynthèse de l’angiotensine II
II-2.5.1.2 Effets vasculaires de l’angiotensine II.
II-2.5.2 L’endothéline-1 (ET-1).
II-2.5.2.1 Biosynthèse
II-2.5.2.2 Actions et implications vasculaires de l’ET-1.
II-2.5.3 Le Monoxyde d’azote (NO).
II-2.5.3.1 Biosynthèse du NO.
II-2.5.3.2 Action vasculaire du NO
II-2.5.4 Les eicosanoïdes.
II-2.5.5 Le facteur hyperpolarisant dérivé de l’endothélium, EDHF.
II-2.6 Effets physiopathologiques de l’aldostérone dans les vaisseaux.
II-2.6.1 Action délétère de l’aldostérone sur la structure des vaisseaux.
II-2.6.2 Action délétère de l’aldostérone sur la fonction vasculaire.
II-2.6.3 Aldostérone et stress oxydatif
II-2.6.4 Participation du rôle de l’enzyme HSD2 dans les effets vasculaires de l’aldostérone/RM.
II-2.6.5 Conclusion
CHAPITRE III – PERTINENCE ET OBJECTIFS DE LA THESE.
CHAPITRE IV – MATERIELS ET METHODES
IV- 1 SOURIS TRANSGENIQUES.
IV-1.1 Introduction
IV-1.2 La transgénèse ciblée conditionnelle
IV-1.2.1 Système Tétracycline
IV-1.2.2 Conclusion.
IV-1.3 Modèle cellulaire (ex vivo).
IV-1.3.1 La lignée cellulaire RCCD2: clone 9
IV-1.3.2 Culture cellulaire
IV-1.2.3 Transfection du clone 9 avec pBi3-hGR, pBi3-BS ou pGR-luciferase
IV-1.2.4 Mesure de l’activité luciférase
IV-1.2.5 Extraction protéiques et analyse par Western Blot
IV-1.4 Modèles animaux (in vivo).
IV-1.3.1 Intérêts de la stratégie d’étude
IV-1.3.2 Modèle de surexpression du RM et/ou du RG dans le CCD et dans l’endothélium.
IV-1.3.2.1 Choix du promoteur Hoxb7
IV-1.3.2.2 Choix du promoteur VECadhérine.
IV-1.3.2.3 Obtention des souris double-transgéniques (DT).
IV-1.3.2.4 Expression du gène rapporteur
IV-2 ETUDES FONCTIONNELLES
IV-2.1 Suivi des paramètres biologiques.
IV-2.1.1 Mesure de la pression artérielle.
IV-2.1.1.1 Mesure non invasive
IV-2.1.1.2 Mesure invasive
IV-2.1.2 Expériences en cages à métabolisme.
IV-2.1.3 Dosages biochimiques
IV-2.1.3.1 Concentrations ioniques.
IV-2.1.3.2 Concentrations plasmatiques et urinaires de l’aldostérone et de la corticostérone
IV-2.1.3.3 Concentration de la rénine plasmatique (PRC).
IV-2.1.4 Prélèvements des tissus
IV-2.1.4.1 Immunohistochimie: Hybridation in situ.
IV-2.1.4.2 Microdissection des tubules rénaux
IV-2.1.4.3 Immunolocalisation.
IV-2.2 Réactivité vasculaire.
IV-2.2.1 Ex vivo : artères mésentériques, artères coronaires et aortes.
IV-2.2.2 In vivo.
IV-2.3 Techniques d’exploration vasculaire
IV-2.3.1 Echotracking vasculaire.
IV-2.3.2 Histomorphométrie et immunohistochimie.
IV-2.4 Hémodynamique
IV-2.4.1 Sur l’organisme entier : microsphères fluorescentes
IV-2.4.2 Locale : écho-Doppler vasculaire.
IV-3 ETUDES MOLECULAIRES.
IV-3.1 Extraction des ARNs totaux à partir de tissus
IV-3.2 RT-PCR.
IV-3.3 RT-PCR en temps réel.
IV-4 ANALYSES STATISTIQUES.
CHAPITRE V – RESULTATS : MODELE DE SUREXPRESSION CONDITIONNELLE DU RG DANS LE CANAL COLLECTEUR RENAL.
V-1 MODELE CELLULAIRE : CELLULES RCCD2-TETON2
V-1.1 Etablissement de la lignée RCCD2
V-1.1.1 Le système tetON de deuxième génération.
V-1.1.2 Choix du clone RCCD2-tetON C9.
V-1.1.2 Expression et activité du récepteur des glucocorticoïdes (RG).
V-1.2 Conclusion
V-2 MODELE ANIMAL : SOURIS TRANSGENIQUE HOXB7-TETON2.
V-2.1 Utilisation du système tétracycline
V-2.1.1 Stratégie expérimentale.
V-2.1.2 Etude cinétique de l’expression du transgène.
V-2.1.3 Surexpression du RG dans le CD: Souris Hoxb7-tetON2 / tetO-hRG.
V-2.1.3.1 Génération des souris DT, exprimant le hRG dans le CD.
V-2.1.3.2 Caractérisation moléculaire de l’expression du transgène.
V-2.1.3.3 Etudes physiologiques
V-2.1.3.4 Etudes moléculaires.
V-2.2 Conclusion
CHAPITRE VI – RESULTATS : MODELE DE SUREXPRESSION DU RM DANS LES CELLULES ENDOTHELIALES
VI-1 MODELE ANIMAL : SOURIS TRANSGENIQUE VECADHERINE-TETOFF.
VI-1.1 Souris VECadhérine-tetOFF / tetO-hRM (DT), exprimant le RM dans l’endothélium.
VI-1.1.1 Caractérisation moléculaire du modèle transgénique.
VI-1.1.2 Paramètres biologiques.
VI-1.1.2.1 Aldostéronémie, natrémie et kaliémie
VI-1.1.2.2 Concentration plasmatique de la rénine.
VI-1.1.2.3 Homéostasie sodique et potassique
VI-1.1.2.4 Hématocrite et volumes plasmatique et extracellulaire.
VI-1.2 Explorations fonctionnelles
VI-1.2.1 Mesure de la pression artérielle.
VI-1.2.1.1 Chez la souris éveillée (méthode non invasive).
VI-1.2.1.2 Chez la souris anesthésiée (méthode invasive).
VI-1.2.2 Réactivité vasculaire.
VI-1.2.2.1 Ex vivo.
VI-1.2.2.2 In vivo.
VI-1.2.3 Etude de la fonction endothéliale coronaire.
VI-1.2.4 Etude de la compliance des vaisseaux et analyse morphologique.
VI-1.3 Etudes moléculaires
VI-1.3.1 Système rénine-angiotensine et système endothéline
VI-1.3.2 L’appareil contractile du muscle lisse
VI-1.3.3 Implication des canaux potassiques Ca2+-dépendants
VI-2 CONCLUSION
VI-3 EXPERIENCES SUPPLEMENTAIRES : DETERMINATION DES PARAMETRES HEMODYNAMIQUES.
VI-3.1 Mesure du débit cardiaque et des flux sanguins régionaux.
VI-3.2 Evaluation des résistances hémodynamiques locales (rein).
VI-3.3 Discussion des résultats.
CHAPITRE VII – RESULTATS : MODELE DE SUREXPRESSION DU RM/RG DANS LES CARDIOMYOCYTES
CHAPITRE VIII – DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES.
VIII-1 MODELE DE SUREXPRESSION CONDITIONNELLE DU RG DANS LE CANAL COLLECTEUR (CD).
VIII-1.1 Pourquoi étudier le rôle du RG dans le CD: intérêt du modèle conditionnel transgénique ciblé ?
VIII-1.2 Quelles sont les nouvelles données apportées par notre étude ?
VIII-1.3 Ces changements moléculaires précoces ont-il un impact physiologique sur l’organisme de la souris ?
VIII-1.4 Quels sont les mécanismes compensatoires et où se produisent-ils ?
VIII-2 MODELE DE SUREXPRESSION CONDITIONNELLE DU RM DANS L’ENDOTHELIUM.
VIII-2.1 Activation du RM dans l’endothélium et pression artérielle
VIII-2.2 Activation du RM et propriétés élastiques du vaisseau.
VIII-2.2 Activation du RM dans l’endothélium et fonction endothéliale.
VIII-2.3 Couplage aldostérone/Ang II/ET-1: implication de la voie de l’EGFR
VIII-2.4 Activation du RM dans l’endothélium et régulation des canaux ioniques
CHAPITRE IX – CONCLUSION GENERALE
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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