Système protéique nécessaire et suffisant pour l’assemblage de réseaux branchés d’actine

Câbles : fibres de stress, arcs transverses, filopodes

Les câbles d’actine sont formés de multiples filaments d’actine alignés et empaquetés suivant des orientations parallèle ou antiparallèle. Ces différences d’orientation sont cruciales puisqu’en donnant des propriétés distinctes aux câbles, elles permettent la sélectivité de l’interaction avec d’autres protéines et dont l’action sera spécifique à ces structures.

Réseaux dendritiques : le lamellipode

C’est l’architecture à laquelle je me suis intéressée tout au long de ma thèse.
C’est un réseau d’actine constitué de l’enchevêtrement très compact de filaments arborescents (Svitkina & Borisy 1999a). Il est stabilisé par des protéines de pontage telles que l’α-actinine et la filamine mais dans une moindre mesure par rapport au cortex cellulaire.
Les branches sont nucléées grâce au complexe protéique Arp2/3 (Figure 14).
Ce complexe se fixe sur le côté d’un filament pré-existant (filament mère) et nuclée une nouvelle branche d’actine (filament fille). Le complexe Arp2/3 (Actin-Related Protein 2/3) est constitué de sept sous-unités, dont Arp2 et Arp3. Elles ont une structure proche du monomère d’actine, ce qui facilite la formation d’un filament d’actine (tel que décrit en détail dans la section suivante). Les réseaux branchés d’actine générés à partir de plusieurs filaments mères s’enchevêtrent et forment ainsi un gel d’actine de forte densité.

Les forces propulsives du réseau d’actine

Actuellement, deux approches complémentaires existent pour décrire la génération de force par le réseau d’actine.
 Premièrement, c’est l’approche du cliquet brownien (« brownian ratchet »). Il s’agit de considérer les extrémités barbées libres des filaments, donc encore capables d’élongation, et leur contact à la membrane en y intégrant le paramètre de mouvement brownien dû aux fluctuations thermiques.

LE CYTOSQUELETTE

Dans le premier modèle du cliquet brownien, le filament est considéré comme rigide et orthogonal à la charge à déplacer, soit la membrane plasmique dans le cas qui nous intéresse (Figure 18A). Ce sont les fluctuations thermiques de la membrane plasmique, qui permettent la création d’un espace entre extrémité barbée d’un filament et la membrane. Cet espace est suffisant pour l’incorporation d’un monomère dans ce filament (Peskin et al. 1993).
L’allongement du filament rigide empêcherait la membrane de revenir à sa position initiale, donc la pousserait en avant à chaque addition de monomère. Or ce modèle qui considère que les filaments sont othogonaux à la membrane s’est trouvé en contradiction avec les observations in vivo du réseau lamellipodial au bord avant des kératocytes où les filaments sont orientés à 45° de la membrane plasmique. (Small et al. 1995).

Les migrations cellulaires

Dès les stades précoces du développement des organismes pluricellulaires, les cellules acquièrent la capacité à répondre à leur microenvironnement (chimiotaxie pour les gradients de molécules de signalisation extracellulaires, durotaxie pour les gradients de rigidité du substrat, etc.) et à se mouvoir vers des sites spécifiques. Cette capacité persiste chez l’organisme adulte, pour le meilleur mais parfois pour le pire : alors qu’elle est indispensable dans le processus de cicatrisation par exemple, elle devient problématique lorsque des cellules cancéreuses acquièrent la possibilité de se disséminer dans l’organisme.
La motilité cellulaire nécessite un remodelage cellulaire et l’extension de plusieurs types de protrusions. La migration la plus archaïque est de type « amiboïde » ; elle concerne les amibes mais également certains leucocytes. Ce type de locomotion se fait grâce aux pseudopodes, qui sont des extensions membranaires longitudinales. Les invadopodes sont des protrusions longitudinales spécialisées dans la dégradation de la matrice extracellulaire, ce qui permet à ces cellules de devenir invasives.
Il existe un type particulier de migration cellulaire grâce à la formation de bourgeonnements (« blebs ») formés par la pression hydrostatique du cytoplasme à travers un rupture ponctuelle du cortex d’actine (Figure 13). C’est un type de migration où l’adhésion cellulaire est moindre, et caractéristique des environnements tissulaires en 3D (Friedl & Wolf 2009) (Figure 20).

La motilité cellulaire : le lamellipode

Le lamellipode est l’organe moteur de la cellule ; c’est un feuillet cellulaire épais de 200 à 300 nm et s’étend généralement sur 1 µm au bord avant de la cellule.
Il est constitué d’un réseau d’actine branché fin, de l’ordre de 200 nm, mais extrêmement dense. Les branches générées par le complexe Arp2/3 sont courtes et rigides du fait de l’action de Capping Protein. Dans son ensemble ce réseau se comporte alors comme un matériau rigide capable de déformer et propulser la membrane plasmique dans le sens de la migration.
Dans un organisme pluricellulaire, la motilité cellulaire débute dès l’embryogenèse. Lors d’une phase appelée gastrulation, l’émission de pseudopodes par les blastocystes permet la migration et la différenciation en différents feuillets embryonnaires (épi-, méso- et endoderme). Dans le système nerveux, les neurites en développement présentent des cônes de croissance avec des filopodes et lamellipodes dynamiques leur permettant le guidage axonal vers leur cible.
L’établissement d’un système vasculaire nécessite également une migration des cellules endothéliales. Durant la réponse immunitaire, les globules blancs sont capables d’une extraordinaire réorganisation et déformation : ils passent de cellules libres du sang à des cellules adhérentes capables de migrer à travers les capillaires jusqu’aux tissus infectés ou endommagés. Enfin, lors de la cicatrisation, les cellules épithéliales migrent en cohorte vers le site endommagé afin de reformer une couche cellulaire.
En plus de ces cas physiologiques d’établissement de la motilité cellulaire, il existe des contextes pathologiques. L’exemple le plus souvent retenu est celui de l’établissement de métastases : les cellules cancéreuses jusqu’ici quiescentes acquièrent la capacité à migrer à travers la tumeur jusqu’aux capillaires sanguins et à se disséminer dans la circulation sanguine.
Dans le système nerveux, il semblerait qu’une mutation du gène de la
Profiline1 soit impliquée dans la sclérose latérale amyotrophique. Cette mutation entraînerait des défauts dans les cônes de croissance, avec un ratio actine F/ actine G diminué (Wu et al. 2012b)
Ainsi, la compréhension des mécanismes de formation et de fonctionnement du lamellipode dans la motilité est d’une importance cruciale.
Enfin, il existe des organismes pathogènes intracellulaires, responsables de pathologies humaines sévères, capables de migrer à travers leurs cellules hôtes en détournant la machinerie de polymérisation de leur cytosquelette par un mécanisme qui sera décrit dans le paragraphe suivant.

Le détournement ou « hijacking » du système de motilité cellulaire par des pathogènes : réseaux propulsifs viraux et bactériens

Plusieurs pathogènes intracellulaires ont comme stratégie le détournement de la machinerie de polymérisation de l’actine de leur cellule-hôte afin de se propulser dans le cytoplasme. Avant de décrire comment cette capacité remarquable a été déterminante pour l’accélération du développement de systèmes de motilité reconstituée in vitro, je souhaite mettre l’accent sur les microorganismes ayant été décrits comme de formidables « hijackers » de la motilité de leur hôte.
 Le virus de la Vaccine est proche cousin du virus de la variole. Après son entrée et sa réplication dans la cellule-hôte, il se propage dans les cellules voisines grâce à la formation d’une comète d’actine (Cudmore et al. 1995). En fait, le virus de la vaccine va mimer la signalisation d’un récepteur Tyrosine-kinase. Le mécanisme est le suivant : le virus possède à sa surface une protéine, A36R, qui est phosphorylée dans la cellule et interagit avec la protéine adaptatrice Nck. Nck recrute alors la protéine N-WASP et entraîne la polymérisation d’une comète d’actine à la surface du virus (Frischknecht et al. 1999).
Cependant, il a été démontré que ce détournement du système de motilité n’est nécessaire qu’au moment où les virions doivent entrer dans une cellule voisine, au contact de la membrane de la cellule-hôte. Le virus de la vaccine est répliqué au centre de la cellule, où il s’enveloppe d’une double-membrane dérivée du Golgi. Le transport du virus depuis le centre de la cellule à la périphérie est se fait alors sur les microtubules, via les kinésines et indépendamment de l’actine (Ward & Moss 2001; Rietdorf et al. 2001).

Système protéique nécessaire et suffisant pour l’assemblage de réseaux branchés d’actine

La découverte du détournement du système de motilité actine-dépendante pour la propulsion des micro-organismes a été un tournant majeur dans l’élaboration de systèmes de motilité reconstituée. En effet, les travaux de Loisel et al en 1999 ont démontré qu’il était possible de reconstituer un système de motilité fonctionnel à l’aide de 5 molécules essentielles (Loisel et al. 1999): ActA (exprimé à la surface des L.
Monocytogenes), l’actine (à l’équilibre entre actine F et G), le complexe Arp2/3, la Capping Protein et l’ADF/Cofiline.
Depuis, ces investigations ont été développées et appliquées à l’étude des mécanismes biochimiques de contrôle de la motilité actine-dépendante selon une approche « bottom-up » : partir de constituants minimaux pour recréer des systèmes simplifiés et éventuellement monter en complexité.
Dans le cadre de cette thèse, j’ai utilisé un système similaire pour former des réseaux dendritiques d’actine à partir de protéines minimales purifiées. Grâce à la manipulation de la nature et de la concentration de ces protéines, il est possible d’altérer la dynamique de ces réseaux afin d’en comprendre la régulation. Dans la partie suivante, je reviens sur les facteurs régulant la dynamique de l’actine.

Contrôle moléculaire de la dynamique des réseaux d’actine

Assemblage et élongation

Comme nous l’avons vu dans un paragraphe précédent, les branches d’actine dans les réseaux de type lamellipodiaux sont formées grâce à l’action de Arp2/3, qui est un nucléateur d’actine. Ce nucléateur est activé par diverses protéines regroupées sous le nom de NPFs, pour « nucleation promoting factors ». Chez les mammifères il s’agit des protéines de la famille WASP/Scar, comme abordé précédemment. Qu’il s’agisse du réseau branché ou des autres architectures de l’actine, une protéine-clé de régulation de l’actine est la profiline.

Désassemblage et recyclage des monomères

Une protéine centrale du recyclage des filaments en monomères est l’ADF/Cofiline. Cette protéine, décrite en détail dans la partie 3, est recrutée par l’actine-ADP des filaments. L’accumulation d’ADF/Cofiline sur des portions de filaments âgés change les propriétés mécaniques du filament en créant des zones de fragilité à l’interface de portions décorées ou non par ADF/Cofiline. La fragmentation a lieu à cette interface. Les monomères-ADP des fragments de filaments se dissocient et retournent dans le réservoir d’actine monomérique, où ils pourront être pris en charge par la profiline pour l’échange ADP-ATP, et redevenir polymérisables. Cependant, une partie des fragments de filaments se réarrangent par coalescence à l’arrière du lamellipode, dans le lamellum. Cette réorganisation n’a pas de polarité définie (polarité mixte) mais permet la contraction des structures par les myosines. L’action contractile de ces myosines participe à la fragmentation des filaments et au recyclage de l’actine.
Au cours de ma thèse, j’ai étudié le désassemblage macroscopique par l’ADF/Cofiline des réseaux d’actine. En effet, bien que les actions biochimiques et mécaniques d’ADF/Cofiline soient bien décrites dans la littérature à l’échelle du filament d’actine, on ne sait que peu de choses sur son action à l’échelle d’un réseau d’actine dendritique (Reymann et al. 2011). Or cette protéine a un rôle fondamental dans le recyclage de l’actine et le turnover du lamellipode, donc dans la motilité cellulaire.
Dans la partie suivante, j’exposerai les propriétés de cette molécule et son action à l’échelle du filament qui mène in fine à la fragmentation du réseau dendritique d’actine.

Désassemblage des filaments par ADF/Cofiline

Actuellement, deux modèles sont proposés pour décrire le désassemblage des filaments d’actine sous l’action de l’ADF/Cofiline. Mais d’ores et déjà, les récentes données expérimentales valident le modèle basé sur la fragmentation mécanique et invalident le premier modèle basé sur la dépolymérisation. Modèle de Fragmentation au détriment du Modèle de Dépolymérisation: Le groupe de M.-F. Carlier proposa en 1997 que l’ADF/Cofiline catalyse la dépolymérisation des filaments par leur extrémité pointue en augmentant la constante de vitesse de dépolymérisation de l’actine à cette extrémité (Carlier et al. 1997). Des mesures de la variation de la turbidimétrie d’une solution de filaments d’actine, bloqués à leur extrémité barbée par les protéines de coiffe CP, avaient confirmé l’hypothèse de l’accélération du désassemblage par l’extrémité pointue et invalidé celle d’une fragmentation du filament (Carlier et al. 1997).
Par ailleurs, l’hypothèse de la fragmentation a été exclue grâce à une expérience avec de la DNase1, qui accélère la dépolymérisation des extrémités barbées, et une concentration saturante en ADF/Cofiline. L’hypothèse était que s’il y avait fragmentation des filaments par ADF/Cofiline, cela aurait généré de nouvelles extrémités barbées libres, ce qui aurait augmenté la vitesse de dépolymérisation induite par la DNase1 (Carlier et al. 1997).
Or, dans leurs conditions expérimentales, cette vitesse de dépolymérisation reste inchangée en présence ou en absence d’ADF/Cofiline. Il a donc été proposé qu’ADF/Cofiline ne fragmente pas les filaments, mais induit une accélération de la vitesse de dépolymérisation à l’extrémité pointue.
Toutefois, cette interprétation n’est pas compatible avec les observations réalisées in vitro et in vivo (Staiger et al. 2009) .
Actuellement, le modèle retenu et accepté est celui de la fragmentation de filaments par ADF/Cofiline. Dans ce modèle, l’ADF/Cofiline se fixe entre deux sousunité d’actine, rompt des interaction entre celles-ci, déstabilise la structure et modifie localement les propriétés mécaniques du filament d’actine (Pfaendtner et al. 2010; McCullough et al. 2008). Cela provoque la fragmentation du filament par une rupture des interactions entre sous-unités adjacentes (Andrianantoandro & Pollard 2006; Blanchoin & Pollard 1999; De La Cruz 2005; Pavlov et al. 2007).

Synergie avec d’autres protéines

Aip1 (« Actin interacting protein 1 ») et la coronine sont des protéines agissant en synergie avec l’ADF/cofiline afin d’augmenter l’efficacité du désassemblage des filaments.
 Aip1 est une protéine qui coiffe exclusivement l’extrémité barbée des fragments et ainsi conduit à leur dépolymérisation totale (Okada et al. 2002; Okreglak & Drubin 2010) . Aip1 est réputé augmenter l’efficacité de la fragmentation des filaments d’actine (Rodal et al. 1999; Okreglak & Drubin 2010), et une étude récente montre qu’Aip1 est nécessaire pour désassembler les câbles d’actine en présence d’ADF/Cofiline (Gressin et al. 2015).
 La coronine quand à elle se fixe aux filaments d’actine avec une forte affinité pour les sous-unités ADP-Pi. La coronine peut fragmenter les sous-unités ADP des filaments d’actine (Gandhi et al. 2009). Sur filaments individuels (in vitro), la présence simultanée d’ADF/cofiline et de coronine induit fragmentation très efficace des filaments d’actine. De plus, la coronine interagit directement avec le complexe Arp2/3 et permet sa dissociation d’avec le filament-mère (Humphries et al. 2002) .
La collaboration entre ADF/Cofiline, coronine et Aip1, conduit à une perte brusque (ou « burst ») d’une partie du filament d’actine (Kueh et al. 2008). Cette synergie d’actions est cohérente avec les observations in vivo où un lamellipode peut être désassemblé à l’échelle de quelques secondes, alors qu’in vitro ADF/Cofiline seule ne produirait, chaque seconde, qu’une fragmentation tous les 7 µm (Suarez et al. 2011).

Table des matières
LISTE DES ABREVIATIONS
CHAPITRE 1 : INTRODUCTION 
1- LE CYTOSQUELETTE
1.1 – Les cytosquelettes : entre rigidité et plasticité
1.1.1 – Les filaments intermédiaires
1.1.2 – Les microtubules
1.1.3 – Les microfilaments d’actine
1.2 – Architectures des filaments d’actine dans les cellules nonmusculaires
1.2.1 – Câbles : fibres de stress, arcs transverses, filopodes
1.2.2 – Réseaux réticulés : le cortex intracellulaire
1.2.3 – Réseaux dendritiques : le lamellipode
1.3 – Nucléation dendritique des filaments d’actine et génération de forces propulsives
1.3.1 – Les acteurs moléculaires de la formation d’un réseau dendritique
1.3.1.1 – Activation des protéines WASP/Scar
1.3.1.2 – Nucléation de branches d’actine par le complexe Arp2/3
1.3.1.3 – La coiffe des filaments par la Capping Protein et la formation d’un gel d’actine
1.3.2 – Les forces propulsives du réseau d’actine
1.4 – Les migrations cellulaires
1.4.1 – La motilité cellulaire : le lamellipode
1.4.2 – Le détournement ou « hijacking » du système de motilité cellulaire par des pathogènes : réseaux propulsifs viraux et bactériens
1.4.3 – Système protéique nécessaire et suffisant pour l’assemblage de réseaux branchés d’actine
2- DYNAMIQUES DES RESEAUX D’ACTINE
2.1 – Thermodynamique de l’assemblage d’un filament d’actine
2.1.1 – Structure et biochimie de l’actine monomérique et filamenteuse
2.1.2 – Thermodynamique et cinétique de la polymérisation de l’actine
2.1.2.1 – Etapes clés de la polymérsation de l’actine
2.1.2.2 – Cinétique de polymérisation de l’actine
2.2 – Contrôle moléculaire de la dynamique des réseaux d’actine
2.2.1 – Assemblage et élongation
2.2.2 – Désassemblage et recyclage des monomères
3- L’ADF/COFILINE DANS LE TURNOVER DE L’ACTINE
3.1 – Description biochimique de l’ADF/Cofiline
3.2 – Mécanisme d’action d’ADF/Cofiline dans le désassemblage
3.2.1 – L’état du nucléotide module l’affinité de l’ADF/Cofiline pour le filament d’actine
3.2.2 – Désassemblage des filaments par ADF/Cofiline
3.2.3 – Recyclage de l’actine, turnover et maintien de la motilité
3.3 – Régulation de l’activité de l’ADF/Cofiline
3.3.1 – Modifications biochimiques de l’ADF/cofiline
3.3.2 – Séquestration de l’ADF/Cofiline à la membrane
3.3.3 – Compétition avec d’autres protéines
3.3.4 – Synergie avec d’autres protéines
3.4 – Contrôle biophysique du désassemblage : diffusion et filtrage des molécules
3.4.1 – Existence de domaines intracellulaires d’exclusion de molécules
3.4.2 – Cas particulier : le Lamellipode
4- RESEAUX BIOMIMETIQUES D’ACTINE
4.1 – Auto-assemblage d’actine branchée en solution libre
4.2 – Introduction de contraintes pour diriger la polymérisation de l’actine
4.2.1 – Contraintes biochimiques
4.2.2 – Contraintes géométriques : surfaces fonctionnalisées avec un activateur de la nucléation
4.2.2.1 – Particules solides
4.2.2.2 – Surfaces microstructurées
CHAPITRE 2 : METHODES 
1- FONCTIONNALISATION DES SURFACES
1.1 – Préparation des billes de polystyrène
1.2 – Préparation des lamelles de verre
1.2.1 – Préparation d’une surface hydrophobe
1.2.1.1 – Lamelles avec PLL-PEG
1.2.1.2 – Lamelles avec Silane-PEG
1.2.2 – Microgravure UV
1.2.2.1 – Microgravure par masque de Chrome
1.2.2.2 – Microgravure par laser UV pulsé
1.2.3 – Fonctionnalisation avec le pWA
2- MILIEUX DE MOTILITE RECONSTITUES
2.1 – Milieu minimal de polymérisation de l’actine
2.2 – Milieu avec FITC-Dextran pour l’étude de la diffusion
3- METHODES D’ANALYSE DES RESULTATS
3.1 – Analyse d’images
3.1.1 – Mesure de la fluorescence
3.1.2 – Normalisation
3.2 – Analyse des résultats et modèles mathématiques
CHAPITRE 3 : RESULTATS 
POSITION DU SUJET 
RESULTATS 
1- ASSEMBLAGE DE RESEAUX BRANCHES D’ACTINE DE DIFFERENTES DENSITES A PARTIR DE MICROPATRONS
2- L’ARCHITECTURE DU RESEAU D’ACTINE CONTROLE SON DESASSEMBLAGE MACROSCOPIQUE PAR ADF/COFILINE
2.1 – Désassemblage des réseaux branchés d’actine
2.2 – Modélisation des dynamiques de l’ADF/Cofiline au sein d’un réseau branché d’actine
2.2.1 – Prédiction de la quantité d’ADF/Cofiline d’un réseau d’actine
2.2.2 – Modélisation de la longueur du réseau d’actine à l’équilibre
3- LA GEOMETRIE DU RESEAU D’ACTINE CONTROLE SON DESASSEMBLAGE MACROSCOPIQUE PAR ADF/COFILINE
3.1 – Données expérimentales
3.2 – Modélisation
4- L’HETEROGENEITE DES RESEAUX DENDRITIQUES CONTROLE LEUR DIRECTIONNALITE
5- COMMENT L’ARCHITECTURE ET LA GEOMETRIE MODULENT-ELLES LE DESASSEMBLAGE PAR ADF/COFILINE ?
5.1 – Utilisation de traceurs fluorescents, les Dextrans
5.2 – Evaluation de l’exclusion des Dextrans dans les réseaux d’actine
5.2.1 – Données expérimentales
5.2.2 – Modélisation
6- CONCLUSION ET DISCUSSION
PERSPECTIVES
1- TRANSITION LAMELLIPODE – ARCS TRANSVERSES
2- CONFINEMENT 3D
3- DENSITE ET OBSTACLES
ANNEXES 
1- DETAIL DES TAMPONS ET SOLUTIONS DU MILIEU DE MOTILITE
2- METHODOLOGIE DE MOLDELISATION
BIBLIOGRAPHIE
ABSTRACT 
RESUME

Lire le rapport complet