Système de production de l’antigène viral : culture cellulaire et virale

Épidémiologie descriptive

La NHEO apparaît au mois d’avril avec un pic d’incidence de cas déclarés entre mi-mai et mijuin (Sans, 1992). On ne rencontre cette maladie que chez l’oie ; aucun cas n’a été décrit chez les autres palmipèdes. On admet que le virus de la NHEO peut présenter une longue persistance chez les animaux infectés, des animaux apparemment sains pouvant être porteurs de la maladie. Sévissant tout d’abord sous forme sporadique, la NHEO se répand ensuite de manière épizootique (Sans, 1992). Elle frappe classiquement les animaux entre 5 et 10 semaines, avec un taux de mortalité de 20 à 80 % sur les lots atteints. Au delà de la 12 ème semaine, les oies semblent réfractaires à la maladie.

Les épisodes récents sont caractérisés par des manifestations cliniques tardives : il n’est pas rare d’observer des cas en gavage, ce qui était exceptionnel dans les cas apparus entre 1988 et 1991. Aucune thérapeutique n’est efficace. Il n’y a pas de corrélation entre la taille des bandes ou l’état sanitaire des élevages avec les épisodes de NHEO, bien que les pourcentages de mortalités sont plus importants dans les élevages où la pression parasitaire est élevée. Les résultats techniques en gavage des animaux rescapés de la NHEO sont comparables à ceux obtenus avec une bande saine (Sans, 1992).

Épidémiologique analytique

Le virus, étroitement spécifique de l’oie, semble être faiblement contagieux. La période d’incubation constatée sur le terrain est longue (de 3 semaines à 2 mois); elle est beaucoup plus courte par inoculation expérimentale (5 à 10 jours). Les voies de transmission de l’agent sont encore mal connues ; la résistance du virus favorise vraisemblablement la contamination des animaux démarrés dans un bâtiment contaminé. Il apparaît qu’expérimentalement, la sensibilité des animaux à l’infection se limite aux 3 à 4 premières semaines de vie, ce qui met en exergue l’importance de la maîtrise sanitaire au démarrage. Les données les plus récentes résultent de l’étude épidémiologique entreprise par Léon (Léon, 2002).

Grâce à un test de diagnostic fondé sur la détection du génome viral, la prévalence d’infection des parquets d’un groupement producteur d’oisons d’un jour du SudOuest a été estimée : il a été montré l’existence de porteurs sains cloacaux, et ce même dans des parquets constitués d’oies n’ayant jamais présenté de NHEO clinique pendant leur élevage. A l’abattoir, une proportion significative de porteurs sains virémiques a été détectée. Le portage à long terme est en tout cas clairement montré chez l’oie infectée ; il est cohérent avec la biologie des autres polyomavirus (Ritchie, 1991 ; Shah, 1996) et avec les observations de terrain concernant la NHEO (Kisary, 1993 ; Sans, 1992 ; Schettler, 1977). En élevage d’oies « prêtes-à-gaver », on note une saisonnalité marquée, ainsi qu’un pic d’occurrence clinique sur les individus de plus de six semaines. Enfin, la présence du virus dans les populations d’oies cendrées sauvages semble possible.

Lorsqu’un élevage est infecté, il semble que le nombre d’individus porteurs sains et excréteurs soit peu élevé. La question de la transmission verticale du virus n’en prend que plus d’importance ; cependant, à ce jour nous n’avons pas pu détecter de séquence virale chez les oisons d’un jour issus d’oies infectées. La détection de virus chez des oies sauvages migratrices devra quant à elle se prolonger par des travaux de caractérisation virale avant de tirer des conclusions quant aux interactions épidémiologiques avec les oies d’élevage.

La découverte du virus

Depuis la première description de la maladie, la plupart des auteurs suspectaient la nature virale de l’agent étiologique de la NHEO (Bernath and Szalai, 1970 ; Sans, 1992 ; Schettler, 1977 ; Vuillaume, 1993). Guérin et coll. (2000) ont reproduit la maladie expérimentalement en inoculant à des oisons d’un jour un broyat de foie et de rate prélevés sur des animaux morts de NHEO en élevage. L’inoculation de fractions purifiées sur gradient de saccharose a permis elle aussi de reproduire la maladie. Les auteurs ont adapté le virus à la culture cellulaire sur cellules épithéliales de rein d’oison, permettant ainsi d’obtenir une solution de virus purifié à partir de lysats de ces cultures.

La présence d’antigènes viraux a été détectée par immunofluorescence, en utilisant du sérum d’oies reproductrices ayant subit un épisode de NHEO dans leur phase d’élevage. Le virus a été observé en microscopie électronique soit à partir des fractions purifiées à partir d’organes infectés, soit directement dans les cellules infectées. Des particules sphériques de 45 à 50 nm de diamètre, peu denses et non enveloppées, évoquant un virus de type « papova-like », ont ainsi été observées (Figure 5).

Les particules sont localisées dans le noyau des cellules infectées, ce qui est compatible avec la biologie de nombreux virus à ADN. L’analyse génétique par amplification aléatoire (PCR à faible stringence, ie à faible température d’hybridation) a permis de séquencer un fragment de 1175 paires de bases (pb), présentant une similarité (homologie de séquence) avec le fragment codant pour la protéine VP1 de plusieurs polyomavirus. L’élaboration d’amorces spécifiques de ce fragment (VP1F et VP1R) a permis, par PCR à haute stringence, la visualisation d’un produit de 144 pb. Ce même produit se retrouve lorsque l’on teste différents tissus issus soit de cas cliniques de NHEO en élevage ou lors d’infection expérimentale, soit d’extraits de culture cellulaire.

Les auteurs, suite à la synthèse des caractéristiques génétiques, physico-chimiques et biologiques du virus, ont conclu à la présence d’un virus de la famille des Polyomaviridae. L’analyse phylogénétique du fragment de 1175 pb (Guérin et al., 2000) montre une similarité nucléotidique variant de 50 à 72% avec d’autres polyomavirus (Tableau 1).

L’arbre phylogénétique (Figure 6) déduit de l’analyse de la séquence de VP1 montre que le polyomavirus impliqué est original, et il est donc nommé Goose hemorrhagic polyomavirus (GHPV) par les auteurs. Il nous paraît nécessaire de faire un bref rappel sur les polyomavirus, en développant rapidement leurs principales caractéristiques morphologiques, puis en insistant sur leur biologie.

Cycle de réplication virale

Une infection est productive lorsque l’ADN viral est transcrit, répliqué, et aboutit à la formation de virions dont l’exocytose aboutit à la mort cellulaire. L’infection productive d’une cellule par un polyomavirus se divise en phase précoce et phase tardive. La phase précoce débute dès l’attachement du virus à la cellule, via l’interaction VP1- récepteur cellulaire. Elle se poursuit par l’endocytose puis la migration jusqu’au noyau où l’ADN viral est libéré et disponible pour la transcription.

La phase précoce permet la production du LTA et du STA, à l’origine d’une stimulation de la réplication cellulaire, préparant de facto la réplication virale. Ces antigènes précoces sont également capables de « réveiller » les cellules en phase de repos. La phase tardive débute dès le début de la réplication du génome viral, et se poursuit jusqu’à la fin de l’infection de la cellule, matérialisée par la sortie des virions dans le milieu extracellulaire. C’est pendant la phase tardive que les gènes tardifs, à l’origine de la synthèse des protéines structurales, sont exprimés. Pour les polyomavirus de mammifères, SV40 et MPV, le cycle est d’autant plus rapide que la quantité de virus est importante et que la cellule est active.

Au sein d’une même espèce, il apparaît aussi que la variation génétique entre les différents isolats est très faible. Dix-huit isolats du BFDV (Budgerigar fledgling disease virus) ont été recueillis à divers endroits, à des dates différentes, sur plusieurs espèces aviaires. Pour chacun, des séquences partielles d’ADN ont été déterminées et comparées à 3 séquences du BFDV déjà connues et publiées. Les résultats montrent une faible variabilité des isolats, puisque l’ensemble des génotypes présentent plus de 99% d’identité nucléotidique (Phalen et al., 1999).

Table des matières

1ÈRE PARTIE : Synthese bibliographique
I.LE CONTEXTE DE LA PRODUCTION D’OIES A GAVER
I.1. Contexte économique
I.2. Organisation de la filière et itinéraires techniques
II.LA NHEO : DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES
II.1. Historique et répartition de la maladie
II.2. Symptômes et lésions
II.2.1. Symptomatologie
II.2.2. Tableau lésionnel
II.3. Epidémiologie
II.3.1. Épidémiologie descriptive
II.3.2. Epidémiologie analytique
II.4. Etiologie : le Goose hemorrhagic polyomavirus (GHPV
II.4.1 La découverte du virus.
II.4.2. Les polyomavirus
II.4.3. Génétique virale
II.4.4. Cycle de réplication virale
II.4.5. Particularités des deux polyomavirus aviaires, le BFDV et le GHPV
III. BASES RATIONNELLES DE LA VACCINATION CONTRE LA NHEO
III.1. Principes en immunologie et vaccinologie aviaires
III .1.1. L’immunologie des palmipèdes, cette inconnue
III.1.2. Les types de vaccins utilisables en aviculture
III.1.3. Modes d’administration des vaccins aviaires
III.2. Vaccins et polyomavirus
III.2.1. Polyomavirus et immunité
III.2.2. Le vaccin BFDV, premier vaccin contre un polyomavirus
III.2.3. Le candidat-vaccin et son évaluation
2ÈME PARTIE : Etude expérimentale
I.MATERIELS ET METHODES
I.1. Système de production de l’antigène viral : culture cellulaire et virale
I.1.1. Les conditions de milieu
I.1.2. Les conditions de température d’incubation après infection
I.1.3. Le délai post-infection (PI) avant récolte du virus
I.1.4. Les conditions de récupération du virus
I.2. Méthodes de quantification de l’antigène viral
I.2.1. PCR quantitative en temps réel
I.2.2. Mesure de la densité optique
I.3. Obtention du virus et purification
I.3.1. Antigène viral pour le vaccin
I.3.2. Antigène viral pour le test ELISA
I.4. Protocole d’inactivation
I.5. Mélange de l’adjuvant
I.6. Méthode d’évaluation : le test ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
I.6.1. Principe
I.6.2. Réalisation
II.RESULTATS
II.1. Production de l’antigène viral
II.1.1. Méthodes de quantification de l’antigène viral
II.1.2. Optimisation des conditions de production
II.2. Préparation du candidat-vaccin
II.2.1. Inactivation à la b-propiolactone
II.2.2. Ajout de l’adjuvant
II.2.3. Doses vaccinales
II.3. Mise au point d’un test sérologique ELISA
II.4. Validation du test ELISA
III. DISCUSSION.
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
TABLE DES ILLUSTRATIONS
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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