Systématique de Plasmodium et des Apicomplexes

Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études

Les antifolates

Les antifoliques

Les antifoliques (sulfadoxine, dapsone) sont des inhibiteurs compétitifs de l’activité dihydroptéroate synthétase (DHPS) de la protéine bifonctionnelle hydroxyméthylptérine pyrophosphokinase-DHPS qui catalyse la synthèse de l’acide folique (Triglia et al., 1997).

Les antifoliniques

Les antifoliniques (pyriméthamine, proguanil, cycloguanil) ciblent l’activité dihydrofolate réductase (DHFR) de la protéine bifonctionnelle DHFR-thymidylate synthétase. La DHFR a pour rôle de régénérer l’acide folique sous forme réduite, seule forme à céder un groupe méthyle lors de la synthèse de la base purique thymidine. C’est à ce titre que les inhibiteurs de la DHFR possèdent des activités antipaludiques. La DHFR existe chez l’homme mais l’affinité des antifoliniques pour celle-ci est moindre en comparaison de celle pour la DHFR parasitaire. Des mutations apparues dans cette dernière sont responsables de phénomènes de résistance.

Les naphtoquinones

L’atovaquone est un analogue structural du coenzyme Q (ubiquinone), qui agit comme un inhibiteur mitochondrial du cytochrome b de la chaîne de transport d’électrons chez les protozoaires. Indirectement, elle inhibe la dihydrorotate déshydrogénase, essentielle à la synthèse de novo des bases pyrimidiques. L’atovaquone est efficace en cas d’accès simples de paludisme mais un taux de 30% de recrudescence est observé suite au traitement, ce qui conduit à l’utiliser en association avec le proguanil. Son utilisation est courante en prophylaxie du voyageur en combinaison atovaquone/proguanil, efficace mais d’un coût élevé.

Les dérivés d’artémisinine

L’artémisinine (qinghaosu) est le principe actif extrait de l’armoise (Artemisia annua), utilisée en médecine chinoise traditionnelle depuis plus de 2000 ans. C’est une lactone sesquiterpénique qui possède deux atomes d’oxygène liés par un pont endopéroxyde dont le clivage est à l’origine de la production de radicaux libres. Son extraction demeure d’un coût élevé, mais l’absence actuelle de résistances avérées justifie son utilisation en bithérapie (ACT, Artemisinin-based Combination Therapy) en traitement de première intention ; elle est aussi utilisée dans les cas de paludisme sévère (recommandations de l’OMS).
Afin de diminuer les coûts de production, des molécules semi-synthétiques ont été développées : artéméther, artééther, artésunate (Meshnick et al., 1996). Ce dernier est notamment utilisé chez les enfants atteints d’accès graves de paludisme sous forme de suppositoires dans les zones endémiques multirésistantes. Malheureusement, si l’action des dérivés d’artémisinine est extrêmement rapide et efficace, sa demi-vie est très courte et n’est pas compatible avec une prescription en une unique dose.
Par ailleurs, l’apparition de résistances à l’artémisinine chez des parasites cultivés in vitro (Jambou et al., 2005) laisse craindre une apparition de résistance en particulier en cas de monothérapie (Duffy and Sibley, 2005).

Les antibiotiques

Les cyclines dont la doxycycline (utilisée en prophylaxie tant en mono que bithérapies) et la tétracycline, les lincosamides dont la clindamycine et les macrolides dont l’azithromycine sont des antibiotiques utilisés en traitement du paludisme. Ils inhibent les mécanismes de synthèse des protéines dans l’apicoplaste et la mitochondrie (Tableau 2).

Molécules en développement

Devant l’apparition de résistances de Plasmodium falciparum à la quasi-totalité des familles thérapeutiques existantes, il apparaît nécessaire et urgent de prévoir régulièrement la mise sur le marché de nouveaux médicaments afin d’anticiper l’apparition de nouvelles résistances (Figure 6). Or la découverte de molécules innovantes est corrélée à la découverte de cibles potentielles, d’où la nécessité d’une compréhension de l’ensemble des voies métaboliques du parasite. Une vue d’ensemble des voies métaboliques du parasite est représentée ci-dessous, incluant les cibles des molécules couramment utilisées et des molécules en développement. Parmi celles-ci on peut citer de nombreuses molécules ciblant des voies métaboliques apicoplastiques : la fosmidomycine (inhibiteur de la synthèse des isoprénoïdes), la thiolactomycine (inhibiteur de la synthèse des acides gras par le système FAS2) et le triclosan (inhibiteur de la synthèse des acides gras par le système FAS2).

Spécificité du système endomembranaire chez Plasmodium falciparum

P. falciparum possède un système endomembranaire permettant entre autres l’adressage de protéines par un système vésiculaire vers l’ensemble des organites du parasite. Cette voie emprunte classiquement trois grands compartiments membranaires : l’enveloppe nucléaire, le réticulum endoplasmique, et l’appareil de Golgi.
• Le réticulum endoplasmique
Le réticulum endoplasmique est peu abondant ou indétectable dans le cytoplasme du mérozoïte. Mais il se re-déploie au cours du stade anneau pour atteindre son développement maximal  à la fin du stade trophozoïte, stade au cours duquel la synthèse protéique est intense. Chez les eucaryotes, le réticulum endoplasmique constitue la première étape de tri des protéines non cytoplasmiques : les protéines sécrétées sont synthétisées au niveau du réticulum endoplasmique puis entrent dans la voie sécrétoire via les citernes golgiennes par l’intermédiaire de vésicules recouvertes des protéines COP I pour les voies rétrogrades et COP II pour les voies antérogrades (Adisa et al., 2002), de la même manière que chez l’ensemble des eucaryotes. Il est ainsi considéré comme le compartiment initial du flux endomembranaire.
Le réticulum endoplasmique joue également un rôle central dans la néosynthèse des lipides (notamment de l’acide phosphatidique et des phospholipides à partir du diacylglycérol).
• L’enveloppe nucléaire
Le noyau est délimité par une enveloppe nucléaire classique. Celle-ci est constituée par la l’association de deux membranes. La membrane située en regard de la face cytoplasmique est tapissée de ribosomes et a valeur d’élément du réticulum endoplasmique. La membrane interne, séparée de la membrane externe par l’espace péri-nucléaire, est tapissée d’une lame dense fibreuse interne ou lamina. L’enveloppe nucléaire est interrompue par des pores qui constituent un lieu de passage obligatoire pour les éléments qui transitent entre le cytoplasme et le noyau.
• L’appareil de Golgi
Lieu des modifications post-traductionnelles, notamment de N-glycosylations (Kimura et al., 1996), l’appareil de Golgi est aussi un site de tri des protéines vers leur destination finale, ainsi qu’un lieu de synthèse et de remaniements lipidiques importants (céramides, sphingomyéline, et glycosphingolipides). Il est subdivisé en trois compartiments distincts (cis, intermédiaire et trans) qui ne possèdent pas la même composition lipidique. C’est un organite en constante instabilité dynamique du fait de son bourgeonnement et de la continuelle arrivée de vésicules tant au niveau cis- (en provenance du réticulum endoplasmique) que trans-golgien (en provenance de la membrane plasmique). Bien décrit chez Toxoplasma gondi (Joiner and Roos, 2002), l’appareil de Golgi est nettement moins bien caractérisé chez Plasmodium. Le complexe golgien y diffère des structures habituelles (y compris de celles de Toxoplasma gondii). Notamment, on n’observe pas d’empilements de citernes golgiennes chez Plasmodium comme le montre l’utilisation de marqueurs des sous-compartiments de l’appareil de Golgi. Ces marqueurs, tels PfERD2 (récepteur à motif XDEL) et GRASP, marqueurs du réseau cis-golgien, ou Rab6 du réseau trans-golgien, permettent de suivre l’évolution de l’organite (Struck et al., 2005; Struck et al., 2008). Apparemment absent du mérozoïte infectieux, l’appareil de Golgi se reforme au cours du développement du stade anneau par rapprochement de vésicules mantelées issues de l’enveloppe nucléaire et apparaît sous forme d’un tubule unique apposé à l’enveloppe nucléaire chez l’anneau plus avancé. Sa structure se complexifie en stade trophozoïte, au cours duquel il apparaît constitué d’un ensemble de vésicules mantelées et non mantelées. Puis, au cours du stade schizonte, l’appareil de Golgi se développe de telle sorte que plusieurs compartiments golgiens sont visibles, qui équiperont chacun des mérozoïtes en formation (Struck et al., 2005).
• La membrane plasmique du parasite
La membrane plasmique la plus étudiée est celle du mérozoïte. Elle est doublée d’un manteau (15 nm d’épaisseur) formant des projections filamenteuses. La membrane plasmique parasitaire est contenue dans un complexe pelliculaire constitué de la membrane plasmique et de deux membranes du complexe interne membranaire connecté à cette dernière par de fins filaments. On peut noter que le complexe est inexistant à l’extrémité apicale du parasite et que l’intégrité des microtubules sous pelliculaires est nécessaire à l’invasion du globule rouge par le mérozoïtes (Pinder et al., 2000).
• Le complexe membranaire interne
Le complexe membranaire interne (CMI) est constitué de deux membranes apposées, qui sous-tendent la membrane plasmique parasitaire. Les deux membranes du CMI et la membrane plasmique forment la pellicule. A l’échelle de la cellule entière, le CMI consiste en un arrangement longitudinal d’une couche unique de vésicules aplaties. Le CMI des Alvéolés dérive du réticulum endoplasmique. Il en résulte l’appartenance de cette structure au système endomembranaire. Sous le CMI, s’étendent des microtubules appelés microtubules sous-pelliculaires.
• Le complexe apical
Le système endomembranaire est, comme nous venons de le décrire, connecté dynamiquement par un intense trafic de vésicules. Une part de ce trafic aboutit à des processus spécialisés de sécrétions (le système sécrétoire est souvent considéré en aval du système endomembranaire). Chez P. falciparum, le système sécrétoire implique des organites spécialisés, fondamentaux pour le mode de vie parasitaire, à l’apex de la cellule, collectivement appelés complexe apical.
– Les rhoptries sont au nombre de deux chez le mérozoïte. Leur biogenèse résulte d’un trafic vésiculaire à partir de l’appareil de Golgi. Délimitée par une bicouche lipidique, en microscopie électronique, leur lumière apparaît constituée d’un fin matériel granulaire. Elles sont composées de deux sous-compartiments distincts : le col et le bulbe des rhoptries, dont les contenus sont distincts. Il semble qu’il existe des trafics vésiculaires sélectifs distincts vers les deux sous-compartiments des rhoptries en formation (Bannister et al., 2000). Parmi les éléments majoritaires des rhoptries, un complexe de protéines de hauts poids moléculaires comprend le complexe RhopH, composé principalement des protéines RhopH1, RhopH2 et RhopH3 (Kaneko, 2007) et un complexe de bas poids moléculaire, Rap, composé principalement des protéines Rap1, Rap2 et Rap3 (Kats et al., 2006). Ces protéines sont exprimées tardivement au cours du cycle érythrocytaire de Plasmodium falciparum, ce qui suggère une fonction des protéines des rhoptries exclusivement au cours de l’invasion et de la formation de la vacuole parasitophore (Kats et al., 2008).
– Les micronèmes, plus petits et plus nombreux que les rhoptries, sont issus d’un bourgeonnement de l’appareil de Golgi et sont transportés le long des microtubules sous-pelliculaires vers l’apex du mérozoïte. Chez Plasmodium falciparum, parmi les protéines de micronèmes, plusieurs protéines impliquées dans l’invasion des globules rouges par le parasite ont été étudiées. D’une part, EBA175 (Healer et al., 2002), se lie aux résidus d’acide sialique présents sur la protéine glycophorine A, particulièrement abondante à la surface de l’érythrocyte. D’autre part, PfAMA1 (Apical Membrane Antigen 1) est une protéine intégrale de membrane de type I qui possède un propeptide en région N-terminale, excisé au moment de sa translocation à la surface du mérozoïte (Healer et al., 2002). La mise en contact de cultures de parasites avec des anticorps dirigés contre PfAMA1 interfère avec l’invasion. Elle semble interagir avec la protéine PfRON4, elle même localisée dans le col des rhoptries (Alexander et al., 2006), soulignant ainsi la collaboration entre micronèmes et rhoptries au cours du processus d’invasion. (Bannister et al., 2003). Enfin, MTRAP (Merozoite Thrombospondin Related Anonymous Protein) est une protéine micronémale homologue de la protéine TRAP retrouvée chez le sporozoïte. Elle est impliquée dans la mobilité par glissement. Elle est localisée à l’extrémité apicale des mérozoïtes libérés dans le sang, et colocalise avec PfAMA1 (Baum et al., 2006). C’est une protéine de surface (domaines thrombospondines répétés) qui semble secrétée au même moment que PfAMA1. MTRAP jouerait un rôle dans la reconnaissance par le mérozoïte de la membrane globule rouge à infecter.
– Les granules denses sont, comme les micronèmes, issus d’un bourgeonnement de l’appareil de Golgi. Cependant, à la différence des micronèmes, les granules denses ne sont pas transportés vers l’apex du mérozoïte. Ils possèdent un contenu finement granulaire. Chez Plasmodium knowlesi, leur décharge a pu être observée en microscopie électronique : leur contenu est relargué dans la vacuole parasitophore suite à leur exocytose à travers la pellicule (Torii et al., 1989).
– Les exonèmes sont des organites sécrétoires du complexe apical récemment décrits (Yeoh et al., 2007). De nature vésiculaire, ils sont clairement distingués des rhoptries par leur taille réduite et des granules denses (auxquels ils ressemblent fortement) par leur forme allongée. Contrairement aux organites du complexe apical décrits précédemment, le contenu des exonèmes n’est pas secrété au cours de l’invasion mais avant même la rupture du schizonte dans la vacuole parasitophore. A l’heure actuelle, la seule protéine caractérisée des exonèmes est PfSUB1.
• La vacuole digestive
La vacuole digestive est un organite important pour le parasite. Elle est d’une part, le lieu d’import et de digestion d’hémoglobine détournée de l’érythrocyte (grâce à des protéases résidentes de la vacuole digestive). De plus, un flux de vésicules endocytées depuis le cytostome fusionne régulièrement avec la membrane de la vacuole digestive. Il existe des cytostomes qui alimentent la vacuole digestive par internalisation de vésicules contenant du cytoplasme érythrocytaire chargé en hémoglobine. La digestion de l’hémoglobine, essentiellement au cours du stade trophozoïte, provoque l’accumulation d’un produit de dégradation : l’hème, molécule toxique pour le parasite de par ses actions oxydantes, les ruptures de membranes ainsi que de par les processus d’inhibition enzymatique qu’il entraîne. La vacuole digestive est d’autre part le site de détoxication de l’hème par sa conversion en un pigment insoluble : l’hémozoïne (Jackson et al., 2004). Son pH est de l’ordre de 5,2 pour un pH cytoplasmique qui est de l’ordre de 7,2 (Kuhn et al., 2007).
La vacuole digestive semble se mettre en place dès l’emprisonnement initial de cytoplasme érythrocytaire par le parasite (voir plus loin partie I C 2) qui constitue la première « gorgée d’hémoglobine » (Elliott et al., 2008). Elle peut aisément être visualisée par immunodétection dirigée contre une de ses protéines de membrane, la protéine PfCRT (Chloroquine Resistant Transporter) (Martin and Kirk, 2004).
Des corps lipidiques (lipides neutres) ont été révélés au sein de la vacuole digestive par coloration au rouge de Nil. Ils paraissent particulièrement enrichis en diacylglycérol et triacylglycérol (Jackson et al., 2004).

Les membranes des organites semi-autonomes

P. falciparum possède des organites semi-autonomes : une mitochondrie qui contient un génome de 6 kb et un apicoplaste, qui contient un génome de 35 kb.

L’enveloppe mitochondriale

Chez Plasmodium falciparum, on trouve une unique mitochondrie allongée, tubulaire située directement sous la pellicule, classiquement entourée de deux membranes mitochondriales (une membrane interne et une membrane externe). La taille de la mitochondrie augmente au cours de l‘évolution de l’anneau et du trophozoïte. L’enveloppe mitochondriale ne montre pas de connexion vésiculaire avec les compartiments endomembranaires.

Les membranes limitant l’apicoplaste

L’apicoplaste est un organite de petite taille qui se présente sous forme de tubulures vésiculaires. Son aspect est assez proche de celui de la mitochondrie, à laquelle l’apicoplaste reste intimement lié (van Dooren et al., 2005). De fait, ces deux organites subissent un développement parallèle. L’apicoplaste est aussi lié aux microtubules sous-pelliculaires. La nature lipidique exacte des membranes de l’apicoplaste reste à définir. Le nombre exact de membranes entourant l’apicoplaste est l’objet de polémiques. Si un consensus porte le nombre de membranes apicoplastiques à quatre chez le parasite Apicomplexe Toxoplasma gondii (Kohler et al., 1997), il semble, en revanche, que l’apicoplaste de Plasmodium falciparum ne soit limité que par trois membranes (Hopkins et al., 1999). La membrane la plus externe de l’apicoplaste est vraisemblablement de type endomembranaire (van Dooren et al., 2000) connectée au système vésicuaire (voir plus haut). Les deux membranes les plus internes de l’apicoplaste sont supposées similaires aux deux membranes entourant le chloroplaste des algues et des plantes (l’enveloppe plastidiale).
À l’instar du plaste végétal, le stroma de l’apicoplaste contient une machinerie de synthèse des acides gras (Fatty Acid Synthase de type II ou FAS II) et produit des acyl-ACP (pour Acyl Carrier Protein). Des acyltransférases ayant les séquences d’adressage apicoplastidiales, sont détectées dans le génome, et permettent de générer du monoacyl et du diacylglycérol-phosphate (ou acide phosphatidique). L’apicoplaste est aussi impliqué dans la synthèse de lipides ne dérivant pas des acides gras tels que des isoprénoïdes (Figure 11). L’apicoplaste apparaît donc comme un site alternatif et/ou complémentaire du réticulum endoplasmique pour la néosynthèse de glycérolipides.

Le globule rouge infecté : une compartimentation membranaire induite

Le globule rouge infecté se distingue du globule rouge non infecté par une organisation membranaire particulière, caractérisée d’une part par une modification de la membrane plasmique érythrocytaire, et d’autre part par la présence de divers compartiments délimités par des membranes dont la production est directement gouvernée par le parasite (Figure 9) (Deitsch and Wellems, 1996).

La membrane plasmique érythrocytaire

La membrane érythrocytaire comporte des microdomaines résistants aux détergents (ou radeaux lipidiques). Ces radeaux ont une composition particulière (ils sont notamment riches en cholestérol et en sphingolipides et s’associent à des protéines à ancrage GPI). Il semble que ces radeaux soient recrutés par le parasite, ce qui permet de fournir la vacuole parasitophore en cholestérol et protéines de surface érythrocytaires (Lauer et al., 2000; Haldar et al., 2002).
La membrane plasmique de l’érythrocyte infecté présente des protubérances (knobs) à sa surface. Les knobs sont visibles aux stades trophozoïte et schizonte (leur développement maximal intervenant au stade schizonte). Ces protubérances de 30 à 40 nm (Tilley et al., 2008) constituent des plateformes contenant des protéines impliquées dans la cytoadhésion comme PfEMP1 et sont associées au cytosquelette membranaire.

La vacuole parasitophore

La vacuole parasitophore se constitue au cours de l’invasion du globule rouge par invagination de la membrane érythrocytaire (Haldar, 1996). Elle contient donc du matériel dérivé de l’érythrocyte, la cellule hôte et du matériel provenant de la sécrétion des organites du complexe apical (notamment des rhoptries). La vacuole parasitophore s’étend considérablement au cours du développement du parasite et montre une richesse en cholestérol (recruté depuis les radeaux vers la membrane de la vacuole parasitophore).
La vacuole parasitophore constitue une zone de transit incontournable pour les protéines exportées depuis le parasite vers le globule rouge (Cooke et al., 2004). Cet export suit une voie de sécrétion classique via des vésicules recouvertes qui fusionnent avec la membrane plasmique. Le passage de la membrane de la vacuole parasitophore pourrait quant à lui être assuré par un transporteur de type ABC.

Le réseau tubulo-vésiculaire

Le réseau tubulo-vésiculaire (RTV) émane de la membrane de la vacuole parasitophore. Il est élaboré suite à un export de matériels lipidique et protéique par le parasite dans le cytoplasme du globule rouge. Il est impliqué dans l’import de divers nutriments (dont les nucléosides et les acides aminés) ainsi que de protéines et dans le recrutement de cholestérol. La sphingomyéline synthase, une protéine d’origine golgienne, semble notamment synthétisée au cours de la schizogonie puis exportée lors de remaniements golgiens entre les stades mérozoïte et anneau, qui apparaît essentielle à la mise en place du RTV (Elmendorf and Haldar, 1994).

Les structures de Maurer

Ces structures vésiculaires portent le nom de Georg Maurer, qui les a observées pour la première fois en microscopie photonique en 1902. Elles prennent la forme d’empilement de citernes membranaires (de 0,2 à 0,4 µm de long) présents dans le cytoplasme des érythrocytes infectés. Les structures de Maurer sont notamment visibles au stade trophozoïte. D’architecture complexe, elles sont délimitées par une simple bicouche lipidique, elle-même doublée d’un manteau protéique. Les structures de Maurer jouent un rôle essentiel en tant que compartiment intermédiaire dans le trafic des protéines parasitaires exportées vers la membrane plasmique du globule rouge (Lanzer et al., 2006) et pourraient représenter l’équivalent d’un appareil de Golgi extra-parasitaire (Tilley et al., 2008).
Certaines sont connectées au feuillet interne de la bicouche lipidique de la membrane érythrocytaire, tandis que d’autres semblent connectées à la membrane de la vacuole parasitophore (Frischknecht and Lanzer, 2008).

Dynamique membranaire au cours du cycle parasitaire érythrocytaire

Au cours de l’invasion

Le processus d’invasion du globule rouge par le parasite commence par la reconnaissance et l’identification de la cellule hôte et son attachement irréversible par des molécules du manteau du mérozoïte. Il se poursuit par la réorientation du mérozoïte qui aligne son pôle apical avec la membrane érythrocytaire, l’adhésion irréversible des membranes par jonction serrée (Figure 9) et l’extrusion des organites apicaux du mérozoïte.
C’est alors que commence la phase d’entrée du parasite, au cours de laquelle le mérozoïte (de façon similaire au sporozoïte lors de l’invasion des cellules hépatiques) transfère du matériel sécrétoire de son complexe apical vers le globule rouge. Cette étape consiste en la décharge séquentielle de vésicules situées dans la région de la proéminence apicale du parasite : les micronèmes, les rhoptries puis les granules denses. Elle se poursuit par l’évolution de la jonction serrée en jonction mobile (Figure 12). Cette jonction mobile forme un anneau en circonférence du parasite, qui se déplace par un mouvement antéro-postérieur depuis le pôle apical vers le pôle basal le long de la membrane plasmique du mérozoïte (Figure 12) (Aikawa et al., 1978). Conjointement au mouvement de la jonction, l’invagination de la membrane de la cellule hôte a lieu et se poursuit au fur et à mesure de l’avancée du parasite, autorisant son entrée dans le globule rouge (Figure 12 et ). Cette invagination épouse la forme du mérozoïte et résulte dans la formation progressive de lavacuole parasitophore, qui est délimitée par la jonction mobile, en regard du pôle apical de celui-ci. Il est à noter qu’au cours de l’invasion, le mérozoïte perd son manteau de surface (partie I A 1).
Suite à l’entrée du mérozoïte dans le globule rouge, la jonction avance (Figure 12) jusqu’à ne laisser qu’un orifice correspondant au point d’entrée du parasite (Figure 12). Lorsque le parasite est complètement entré au sein du globule rouge, la jonction semble fusionner à l’extrémité postérieure de celui-ci, scellant l’orifice en une jonction serrée unique (Figure 12). À ce stade, la membrane parasitaire est encore en relation étroite avec la membrane érythrocytaire. La continuité de la vacuole parasitophore, au sein de laquelle va se développer le parasite, est ensuite assurée. Au long de l’invasion, le pôle apical du parasite reste apposé à la membrane du globule rouge, en continuité avec un canal, formant une embouchure commune à l’extrémité des rhoptries, facilitant leur extrusion.
La membrane parasitophore relève donc à la fois de la membrane plasmique globulaire et des membranes ou éléments membranaires apicaux du parasite (Haldar, 1996). Les lipides de la cellule hôte sont incorporés dans la membrane de la vacuole parasitophore (et dans la membrane plasmique du parasite). Il en résulte une différence de composition de ces membranes par rapport aux membranes internes du parasite (Dluzewski et al., 1995).

Table des matières

Introduction
I. Bref historique du paludisme
II.Plasmodium, parasite hématozoaire du paludisme
A. Systématique de Plasmodium et des Apicomplexes
B. Cycle parasitaire de Plasmodium falciparum
III. État du paludisme dans le monde
IV. Lutte contre le paludisme
A. Programmes intégrant divers niveaux d’interventions, de la recherche scientifique pour de nouveaux traitements, aux pratiques médicales et aux politiques de prévention
B. La recherche de nouvelles cibles biologiques, à l’aide des approches post-génomiques
C. La chimiothérapie du paludisme
1. Les quinoléines
a) Les 4-aminoquinolines
b) Les aryl-amino-alcools
c) Les 8-Aminoquinolines
2. Les antifolates
a) Les antifoliques
b) Les antifoliniques
3. Les naphtoquinones
4. Les dérivés d’artémisinine
5. Les antibiotiques
6. Molécules en développement
V. L’apicoplasteVI. La synthèse des galactolipides chloroplastiques, une cible pour des herbicides antipaludiques ?
Données bibliographiques
I.Plasmodium falciparum : une compartimentation membranaire à l’intérieur et à l’extérieur de la cellule parasitaire
A. Compartimentation subcellulaire de Plasmodium falciparum
1. Le système endomembranaire
a) Schéma général chez les eucaryotes
b) Spécificité du système endomembranaire chez Plasmodium falciparum
2. Les membranes des organites semi-autonomes
a) L’enveloppe mitochondriale
b) Les membranes limitant l’apicoplaste
B. Le globule rouge infecté : une compartimentation membranaire induite
1. La membrane plasmique érythrocytaire
2. La vacuole parasitophore
3. Le réseau tubulo-vésiculaire
4. Les structures de Maurer
C. Dynamique membranaire au cours du cycle parasitaire
érythrocytaire
1. Au cours de l’invasion
2. Au cours du développement en stade anneau
3. Au cours du développement en stade trophozoïte
4. Au cours du développement au stade schizonte
5. Au cours du développement au stade gamétocyte
D. Composition lipidique des membranes de Plasmodium falciparum
II. Synthèse et dynamique des acyl-lipides chez Plasmodium falciparum
A. Synthèse des acyls-lipides
1. Synthèse des acides gras
a) Définition et nomenclature
b) Biosynthèse des acides gras
2. Synthèse des glycérolipides
a) Définition et nomenclature
b) Les précurseurs des glycérolipides membranaires
c) Synthèse de triacylglycérol
d) Synthèse des phosphoglycérolipides
e) Synthèse des glycéroglycolipides
3. Synthèse des sphingolipides
B. Trafic des lipides chez Plasmodium falciparum
1. Trafic des acyl-lipides
2. Trafic des lipides, trafic des protéines et biogenèse des compartiments membranaires chez Plasmodium falciparum
C. Métabolisme et dynamique des lipides comme cible de traitements antipaludiques
Matériel et Méthodes
I. Matériels biologiques
A. Culture in vitro de modèles de parasites Apicomplexes
1. Culture in vitro de stades érythrocytaires asexués de Plasmodium falciparum
2. Préparation de cultures enrichies en gamétocytes de Plasmodium falciparum
3. Culture in vitro de Babesia divergens
4. Culture in vitro de Toxoplasma gondii
B. Culture in vitro de lignées cellulaires humaines
II. Méthodes d’observations par microscopie à épifluorescence
A. Traitement d’échantillons cellulaires pour une visualisation d’épitopes par immunofluorescence indirecte
B. Traitement d’échantillons cellulaires pour une visualisation de l’ADN par le réactif de Hoechst
C. Observation des structures cellulaires après traitements pour immunomarquage, marquage de l’ADN et/ou marquage des mitochondries
III. Méthodes de biologie moléculaire
A. Plasmides utilisés
B. Extraction d’ADN génomique de Plasmodium falciparum
C. Amplification de fragments d’ADN par PCR
D. Expression épisomale de vecteurs Multisite Gateway
1. Surexpression épisomale du transporteur d’UDP-galactose de Plasmodium falciparum
2. Expression épisomale de MGDG synthase exogène
E. Génération de Knock Out du transporteur d’UDP-Galactose de Plasmodium falciparum par interruption de cadres de lectures de gènes
F. Transfection chez Plasmodium falciparum
G. Cycles de sélection
H. Clonage en plaque 96 puits
I. Vérification de l’expression des protéines par technique d’immunomarquage (Western Blot)
IV. Méthodes de mesures de l’activité de molécules sur différents systèmes biologiques
A. Principe : la CI50, mesure de l’activité d’une molécule sur un système biologique
1. Définition de la bioactivité et de la CI50
2. Différentes CI50 mesurées dans cette étude
B. Mesures de l’inhibition de l’activité enzymatique des MGDG
synthases de plantes mesurée in vitro
C. Mesure de l’activité antimycobactérienne in vitro
D. Mesures de l’activité antipaludique in vitro
1. Détermination de l’activité antipaludique sur des cultures
asynchrones, suivant le test de Desjardins
2. Détermination de l’activité antipaludique en fonction du stade
parasitaire
E. Mesure de la cytotoxicité sur cellules humaines in vitro
V. Méthode de fractionnement de protéines sur matrice d’affinité
A. Principe général
B. Préparation de la matrice d’affinité
C. Préparation des échantillons biologiques
D. Chargement des échantillons sur la matrice d’affinité
VI. Méthode d’analyse des protéines par électrophorèse en
conditions dénaturantes
A. Préparation des échantillons de protéines
B. Électrophorèse sur gel de polyacrylamide
1. Séparation par électrophorèse en conditions dénaturantes
2. Coloration des protéines au bleu de Coomassie
VII. Méthode de microséquençage de protéines par spectrométrie
de masse
VIII. Méthodes d’analyse des lipides
A. Marquage de lipides à l’UDP-[14C]galactose
B. Extraction des lipides
C. Séparation des lipides par chromatographie sur couche mince
unidimensionnelle
IX. Méthodes chemoinformatiques de modélisation et de
comparaison structurales de petites molécules

Télécharger le rapport complet