Synthèse par thermo polymérisation d’un MIP pour la S1P

Propriétés des cellules cancéreuses

Le terme cancer englobe un groupe de maladies qui se caractérisent par une prolifération et une propagation incontrôlées de cellules anormales. Soumise à des agressions externes de différentes natures, la cellule saine peut subir des altérations de son ADN qui peuvent conduire au cours du temps à l’apparition de mutations génétiques. Pour protéger l’organisme, il existe plusieurs systèmes cellulaires permettant de repérer puis de réparer ces altérations ou bien de déclencher l’autodestruction de la cellule anormale par apoptose lorsque celles-ci sont trop importantes pour être réparées. Cependant, il peut arriver que ces systèmes de protection fonctionnent mal ou ne fonctionnent plus. La cellule anormale peut alors continuer à se diviser malgré la présence d’altérations génétiques. Si les gènes altérés sont impliqués dans la régulation de la prolifération cellulaire ou de l’apoptose, la cellule peut se multiplier de façon anarchique, ce qui conduit à la formation d’une tumeur cancéreuse. Avec le temps, les cellules cancéreuses continuent d’accumuler des mutations génétiques et acquièrent ainsi des nouvelles propriétés qui vont permettre à la tumeur de se développer localement en détruisant les cellules saines. Les propriétés principales des cellules cancéreuses sont leur nature immortelle, la perte de leur fonction biologique d’origine, leur capacité à détourner les ressources locales à leur bénéfice (oxygène, énergie et facteurs de croissance) et enfin, leur faculté à empêcher les défenses immunitaires de l’organisme à les combattre.

Les cellules cancéreuses finissent par envahir tous les tissus de l’organe d’origine de la tumeur mettant en péril son fonctionnement, puis par atteindre les tissus des organes voisins. On parle alors de cancer invasif. Dans ce cas, certaines cellules cancéreuses de la tumeur primaire deviennent mobiles et circulent à travers les systèmes sanguin et lymphatique pour former des métastases. Les décès par cancer sont en grande majorité causés par les métastases, d’où la nécessité de dépister et diagnostiquer au plus tôt la maladie, avant sa dissémination dans l’organisme, afin d’augmenter les chances de guérison.

Le mélanome cutané

Généralités sur la peau humaine

Définition et rôles de la peau humaine
Essentielle à la vie, la peau est l’organe le plus lourd et le plus étendu du corps humain. A titre d’exemple, pour une personne adulte de soixante-dix kilogrammes environ, le poids de la peau est de près de quatre kilogrammes et elle s’étend sur une surface de près de deux mètres carrés, tandis que son épaisseur varie en moyenne de 0,5 à 3 millimètres selon les parties du corps. Elle recouvre la totalité du corps humain et forme une barrière protectrice contre les agressions extérieures telles que le soleil, les virus et bactéries ou encore les agents chimiques. La présence de cellules immunitaires en son sein lui permet de s’adapter continuellement aux agressions extérieures. Cependant, le pouvoir de protection de la peau est limité. Par exemple, suite à une exposition trop importante aux rayons ultraviolets, les cellules de la peau peuvent subir des altérations génétiques qui entraînent l’apparition de cancers de la peau, dont le plus agressif est le mélanome.

Structures de la peau humaine
La peau est constituée de trois couches principales: l’épiderme, le derme et l’hypoderme .

L’épiderme qui est l’enveloppe externe de la peau s’organise en quatre couches successives qui sont de l’extérieur vers l’intérieur, la couche cornée, la couche granuleuse, la couche épineuse et la couche basale. Il est constitué de quatre types de cellules qui sont les kératinocytes, les mélanocytes, les cellules de Langerhans et les cellules de Merkel . Les mélanocytes sont des cellules d’origine neuro ectodermique qui se situent au niveau de la couche basale de l’épiderme. Ils synthétisent dans les mélanosomes la mélanine, un pigment brun foncé, responsable de la pigmentation de la peau et qui joue un rôle de protection vis-à-vis des rayons ultraviolets. Lorsque la peau est exposée aux rayons ultraviolets, les mélanocytes qui sont des cellules en forme d’étoile, présentant des prolongements cytoplasmiques, appelés dendrites, entrent en contact avec les kératinocytes pour leur transférer leur mélanosomes . L’épiderme n’étant pas vascularisé il est dépendant du derme pour se nourrir .

Le derme qui se situe directement sous l’épiderme est composé de deux couches : le derme papillaire qui est le plus superficiel et le derme réticulaire, le plus profond. Les principales cellules du derme sont les fibroblastes, responsables de la production de fibres de collagène et de fibres élastiques, à l’origine de la souplesse et de l’élasticité de la peau. Le derme est le principal tissu de soutien de la peau, responsable de sa solidité. C’est au niveau du derme que l’on retrouve les principales structures spécialisées de la peau comme les vaisseaux sanguins, les vaisseaux lymphatiques et les terminaisons nerveuses [8].

L’hypoderme est situé sous le derme. Il est constitué de cellules graisseuses, les adipocytes. Cette couche de graisse stocke l’énergie, assure l’isolation pour conserver la chaleur du corps et protège les organes recouverts [8].

Le mélanome : le cancer cutané le plus agressif 

Définition

Le mélanome cutané est une tumeur maligne qui se développe à partir des mélanocytes. Il représente une minorité des cancers de la peau mais il est le plus grave du fait d’un risque important de métastases. En effet, il se développe au niveau des couches les plus profondes de l’épiderme, à proximité du derme, riche en vaisseaux sanguins, ce qui facilite la dissémination des cellules vers d’autres organes, par le biais de la circulation sanguine, et donc la formation de métastases. Cependant, lorsqu’il est détecté assez tôt, au tout début de son développement, le mélanome peut être éliminé par exérèse, d’où l’importance d’un dépistage et d’un diagnostic précoce [8].

Occurrence, facteurs de risque et types de mélanomes cutanés 

Le mélanome cutané survient à tout âge chez les adultes mais est très rare chez l’enfant. Il apparaît sur n’importe quelle partie du corps, le plus souvent sur le tronc chez l’homme et sur les jambes chez la femme. Ilse manifeste essentiellement de deux façons : soit par l’apparition d’une tâche pigmentée sur la peau saine qui ressemble à un grain de beauté (cas le plus fréquent), soit par la modification de couleur et de forme d’un grain de beauté préexistant . Dans plus de 90 % des cas, le mélanome se situe au niveau de la peau (il apparait plus rarement sur d’autres organes comme la bouche, le nez, les sinus, le rectum, ainsi que sur les organes génitaux). Comme tous les cancers, le mélanome cutané est le résultat de différentes causes qui interagissent entre elles. Toutes ne sont pas connues et tous les mécanismes sous-jacents à l’apparition du mélanome cutané ne sont pas encore établis. Cependant, on peut lister certains facteurs de risque internes et externes qui augmenteraient le risque de développer le mélanome cutané. Il s’agit de l’exposition au soleil et aux UVs artificiels, d’un certain type de peau (on parle de phototype), d’un nombre élevé de grains de beauté et des antécédents personnels ou familiaux de mélanome. On distingue quatre types principaux de mélanome cutané : le mélanome superficiel extensif, le mélanome de Dubreuilh, le mélanome acrolentigineux et le mélanome nodulaire [8].

Dissémination des cellules du mélanome

Lorsque les cellules cancéreuses apparaissent, elles sont d’abord peu nombreuses et limitées à la surface de la peau. La plupart des mélanomes cutanés se développent d’abord horizontalement dans l’épiderme (sauf le mélanome nodulaire qui peut directement se développer vers les couches profondes de la peau). Tant que la tumeur se situe au sein de l’épiderme, on parle de mélanome cutané in situ. Si elle est retirée par acte chirurgical à ce stade, il n’y a pas de risque d’évolution métastatique. Avec le temps et si aucun traitement n’est effectué, la tumeur progresse en profondeur à travers le derme et l’hypoderme. A partir du moment où la tumeur franchit la couche basale et atteint le derme, le cancer devient invasif. Des cellules cancéreuses peuvent alors se détacher de la tumeur primaire et rejoindre les vaisseaux sanguins ou les vaisseaux lymphatiques pour aller envahir d’autres parties du corps. Des cellules cancéreuses peuvent ainsi s’échapper de la tumeur primaire et envahir les ganglions proches. Les ganglions atteints dépendent de la localisation de la tumeur. Les cellules cancéreuses peuvent aussi s’installer dans les canaux lymphatiques situés entre la tumeur primitive et les ganglions les plus proches et former des tumeurs cutanées ou sous cutanées que l’on appelle alors métastases en transit. Enfin, les cellules cancéreuses peuvent se propager à d’autres tissus ou organes. On parle de métastases à distance et le mélanome cutané sera dit métastatique. Les métastases à distance sont le plus fréquemment localisées sur la peau, dans les ganglions lymphatiques, les poumons, le foie et le cerveau, mais quasiment tous les organes peuvent être atteints .

Diagnostic et traitement du mélanome cutané 

Le diagnostic clinique consiste en l’analyse par le dermatologue de la taille, de la forme, de la couleur et de l’évolution de la lésion cutanée .

Quand un cas de mélanome cutané est suspecté, une exérèse de la lésion est effectuée afin de l’analyser en laboratoire. Un examen anatomopathologique des tissus prélevés permettra de confirmer le diagnostic .

Malheureusement, cette procédure n’est enclenchée que suite à la découverte d’une lésion suspecte de la peau par l’individu lui-même, une personne de son entourage ou par un professionnel de santé (médecins généralistes, dermatologues). Or, lorsque la lésion parvient à être repérée, le mélanome cutané a souvent déjà évolué vers des stades plus agressifs. Le traitement du cancer est adapté à chaque situation particulière et le choix d’un traitement ou d’une combinaison de traitements dépend de plusieurs facteurs tels que le type de cancer, son degré d’extension, la présence d’autres maladies, l’âge et l’état général de la personne. Parmi les traitements classiques on retrouve la chirurgie, la chimiothérapie, la radiothérapie, la curiethérapie et l’hormonothérapie. Des nouveaux traitements contre le cancer sont en cours de développement, on pourra citer les thérapies ciblées, les immunothérapies, les antiangiogenèses et les thérapies géniques [13]. Compte tenu du fait que le mélanome cutané peut évoluer rapidement vers un stade métastatique, l’accès à un moyen de dépistage plus précoce, avant même l’apparition d’une lésion de la peau ou d’autres symptômes, constituerait un avantage et un gain de temps considérables pour la prise en charge de cette maladie. Dans ce contexte, l’identification puis la quantification de biomarqueurs du mélanome cutané constituent un enjeu majeur.

Table des matières

Introduction
Chapitre 1 : Contexte et objectifs de la thèse
1.1 Cancer, mélanome et sphingosine 1-phosphate
1.1.1 Propriétés des cellules cancéreuses
1.1.2 Le mélanome cutané
1.1.2.1 Généralités sur la peau humaine
1.1.2.1.1 Définition et rôles de la peau humaine
1.1.2.1.2 Structures de la peau humaine
1.1.2.2 Le mélanome : le cancer cutané le plus agressif
1.1.2.2.1 Définition
1.1.2.2.2 Occurrence, facteurs de risque et types de mélanomes cutanés
1.1.2.2.3 Dissémination des cellules du mélanome
1.1.2.2.4 Diagnostic et traitement du mélanome cutané
1.1.2.2.5 Les biomarqueurs du mélanome cutané
1.1.2.2.5.1 Définition d’un biomarqueur
1.1.2.2.5.2 Cas du mélanome cutané
1.2 La sphingosine 1-phosphate (S1P) comme biomarqueur du mélanome cutané
1.2.1 Les sphingolipides
1.2.2 Métabolisme des sphingolipides et de la S1P
1.2.3 Rôles biologiques de la S1P
1.2.3.1 Action extracellulaire : les récepteurs de la S1P
1.2.3.2 Action intracellulaire : S1P, second messager dans la cellule
1.2.4 Rôle de la sphingosine 1-phosphate dans le cancer
1.2.5 Rôle de la sphingosine 1-phosphate dans le mélanome cutané
1.2.6 Localisation et transport de la S1P
1.2.7 Méthodes usuelles de quantification de la S1P
1.2.7.1 La LC-MS
1.2.7.2 Les immunoessais
1.3 Objectif général de la thèse
1.4 Description d’un capteur et choix du type de biorécepteur
1.4.1 Définition d’un capteur
1.4.2 Types de biorécepteurs
1.4.2.1 Récepteur d’affinité
1.4.2.2 Récepteurs catalytiques
1.4.2.3 Récepteurs biomimétiques : les polymères à empreintes moléculaires
1.5 Les polymères à empreintes moléculaires
1.5.1 Historique
1.5.2 Principe général des MIPs
1.5.2.1 L’approche non-covalente
1.5.2.2 L’approche covalente
1.5.2.3 L’approche semi-covalente
1.5.3 Rôle des différents constituants
1.5.3.1 Les monomères fonctionnels
1.5.3.2 L’agent réticulant
1.5.3.4 L’initiateur de polymérisation
1.5.3.5 Le solvant
1.5.4 Types de polymérisation
1.5.5 Méthodes de polymérisation et formes physiques des MIPs
1.5.6 Avantages des MIPs
1.6 Objectifs spécifiques
Chapitre 2 : Synthèse par thermopolymérisation d’un MIP pour la S1P
2.1 Introduction
2.2 Matériels et méthodes
2.2.1 Réactifs et matériels
2.2.2 Formulations des MIPs
2.2.3 Méthode de polymérisation
2.2.3.1 Préparation de la solution de pré-polymérisation
2.2.3.2 Méthode de thermopolymérisation en masse
2.2.3.3 Méthode d’extraction de la molécule template
2.2.3.3 Méthode de préparation du polymère contrôle NIP (Non Imprinted Polymer)
2.2.4 Tests de liaison des MIPs
2.2.4.1 Protocole des tests de liaison
2.2.4.2 Techniques d’analyse
2.2.4.2.1 Chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse
2.2.4.2.1.1 Principe général
2.2.4.2.1.2 Technique et appareils utilisés
2.2.4.2.1.2.1 Protocole d’extraction lipidique
2.2.4.2.1.2.2 Protocole d’analyse HPLC-MS/MS
2.2.4.2.1.2.3 Méthode de calibration par standard interne
2.2.4.2.2 Spectroscopie de fluorescence
2.2.4.2.2.1 Principe général
2.2.4.2.2.2 Technique et appareils utilisé
2.2.4.2.2.2.1 Protocole d’analyse avec le spectrofluorimètre Fluorolog®
2.2.4.2.2.2.2 Protocole d’analyse avec le Varioskan® Flash
2.2.4.2.2.2.3 Courbes de calibration
2.2.5 Préparation des solutions lipidiques
2.2.5.1 Solutions de S1P dans le méthanol ou le mélange méthanol/eau
2.2.5.2 Solutions de S1P fluorescéine dans le méthanol et le mélange méthanol/eau
2.2.5.3 Solutions de C1P TopFluor® dans le méthanol et le mélange méthanol/eau
2.2.6 Synthèse du monomère (4-acrylamidophenyl)(amino)methaniminium acetate (AB acétate)
2.2.7 Etudes par spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire
2.3 Résultats et discussion
2.3.1 Synthèse et optimisation d’un MIP pour la S1P
2.3.1.1 Synthèse d’un nouveau MIP pour la S1P
2.3.1.2 Test de liaison du MIP-S1P 1
2.3.1.3 Evaluation RMN de la stœchiométrie et de la force des interactions
2.3.1.4 Optimisation du MIP-S1P 1 à l’aide d’une molécule « dummy template »
2.3.2 Evaluation et optimisation de la sélectivité du MIP pour la S1P
2.3.2.1 Evaluation de la sélectivité du MIP-S1P 1
2.3.2.2 Optimisation de la sélectivité du MIP par différentes stratégies
2.3.2.2.1 Optimisation de la sélectivité par l’utilisation d’un nouveau monomère fonctionnel
2.3.2.2.2 Optimisation de la sélectivité par la combinaison de plusieurs monomères fonctionnels
2.3.2.2.3 Optimisation de la sélectivité par la modification du solvant du test de liaison
2.4 Conclusions et perspectives
Chapitre 3 Méthodes de photopolymérisation d’un MIP en surface pour le développement d’un capteur permettant la quantification de la S1P dans un fluide biologique
3.1 Introduction
3.2 Méthode de photopolymérisation du MIP en surface et validation par des techniques avec et sans marquage
3.2.1 Matériels et méthodes
3.2.1.1 Réactifs et matériels
3.2.1.2 Formulation du polymère à empreintes moléculaires
3.2.1.3 Méthode de polymérisation
3.2.1.3.1 Préparation de la solution de pré-polymérisation
3.2.1.3.2 Méthode de photopolymérisation en surface
3.2.1.3.2.1 Préparation des substrats
3.2.1.3.2.2 Protocoles de photopolymérisation en surface
3.2.1.3.3 Procédure d’extraction de la molécule template
3.2.1.4 Méthodes de caractérisation des dépôts de polymère à la surface des substrats
3.2.1.4.1 Echantillons de silicium
3.2.1.4.2 Capteurs de QCM
3.2.1.5 Protocoles des tests de liaison
3.2.1.5.1 Test de liaison par microscopie optique de fluorescence
3.2.1.5.2 Test de liaison par Microbalance à Cristal de Quartz
3.2.1.5.2.1 Présentation de la Microbalance à Cristal de Quartz
3.2.1.5.2.1.1 Principe de mesure
3.2.1.5.2.1.2 Mise en équation du phénomène et modèles physiques
3.2.1.5.2.2 Protocole expérimental du test de liaison par QCM
3.2.1.6 Préparation des solutions lipidiques
3.2.1.6.1 Solutions de S1P
3.2.1.6.1.1 Dans le méthanol
3.2.1.6.1.2 Dans une solution eau/albumine de sérum bovin (BSA)
3.2.1.6.2 Solutions de S1P fluorescéine dans le méthanol
3.2.1.7 Méthodes de polymérisation radicalaire contrôlée
3.2.1.7.1 Synthèse in situ de l’iniferter dithiocarbamate
3.2.1.7.2 Greffage de l’iniferter BDC
3.2.2 Résultats et discussion
3.2.2.1 Echantillons de silicium
3.2.2.1.1 Caractérisation des spots de MIP par microscopie optique
3.2.2.1.2 Test de liaison par microscopie optique de fluorescence
3.2.2.1.3 Conclusions et perspectives
3.2.2.2 Capteurs de microbalance à cristal de quartz
3.2.2.2.1 Caractérisation des couches de MIP par microscopie à force atomique
3.2.2.2.2 Test de liaison par microbalance à cristal de quartz
3.2.2.2.3 Conclusions et perspectives
3.2.2.3 Utilisation de la polymérisation radicalaire contrôlée pour l’optimisation de l’homogénéité de la couche de MIP
3.3 Développement d’un capteur pour la quantification de la S1P dans un fluide biologique
3.3.1 Spectroscopie infrarouge par onde évanescente à la surface d’une fibre optique (FEWS)
3.3.1.1 Spectroscopie dans l’infrarouge moyen
3.3.1.2 Spectroscopie par réflexion totale atténuée
3.3.1.3 Spectroscopie par onde evanescente à la surface d’une fibre optique
3.3.1.3.1 Exemple d’applications dans le domaine médical et choix du type de fibre
3.3.1.3.2 Augmentation des perfromances – Couplage avec les MIPs
3.3.2 Premières étapes dans le développement du capteur
3.3.2.1 Choix du matériel
3.3.2.2 Résultats préliminaires de spectroscopie infrarouge en mode ATR
3.4 Conclusions et perspectives
Conclusion générale

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