Soutenance mémoire
La morphogenèse cellulaire est la coordination de chacun des éléments constituant la cellule afin de lui donner une architecture qui va permettre sa fonction dans l’organisme. Les cellules eucaryotes utilisent le cytosquelette et ses propriétés dynamiques, comme acteur majeur de la morphogenese. Dans les cellules animales, le cytosquelette est composé de microtubules (MTs), de filaments intermédiaires et de microfilaments d’actine. Dans les cellules de plantes, la présence de filaments intermédiaires n’a pas été observée. Les éléments du cytosquelette sont présents sous forme de polymères qui résultent de l’assemblage de briques élémentaires. Ces éléments sont distribués comme éléments isolés et associés à des protéines ou associés entre eux par un maillage de protéines impliquant la formation de réseaux. Le cytosquelette est, contrairement à ce que le nom suggère, une structure hautement dynamique où ses composants se réorganisent au cours de la vie de la cellule. Les fonctions du cytosquelette sont multiples, il soutient des fonctions vitales telles que la mobilité cellulaire, le trafic intracellulaire tel que le déplacement d’organites, la division cellulaire ou encore le maintien de la structure cellulaire. La construction et la régulation du cytosquelette sont assurées par une grande variété de protéines qui lui sont associées. Dans ce contexte, le but de mon travail de thèse a été d’étudier chez la plante modèle Arabidopsis thaliana, le rôle d’une protéine associée au cytosquelette de microtubules, AtMAP65-4 dans l’organisation et les fonctions de réseaux de MTs au cours du cycle cellulaire.
Les microtubules
Présents dans les cellules eucaryotes, les microtubules sont des cylindres creux de 25 nm de diamètre issus de l’arrangement bidimensionnel de la tubuline qui génére une pseudohélice. Les propriétés mécaniques remarquables des MTs sont mises à profit par la cellule afin d’assurer des fonctions vitales. Des études in vitro permettent de mieux définir les caractéristiques de ce polymère capable de s’auto-assembler.
Synthèse et modifications du dimère α / β de tubuline
Sept tubulines ont été identifiées jusqu’ici: les tubulines α, β, γ, δ, ε, ζ et η dont les fonctions pour certaines restent encore mal définies. Ainsi, la tubuline δ pourrait être impliquée dans la mise en place du flagelle chez l’algue unicellulaire Chlamidomonas reinhardti. La tubuline η est indispensable à la duplication des corps basaux (équivalent des centrioles) chez la paramécie et les tubulines ε et ζ ont été identifiées dans des banques de données de séquences mais ne possèdent pas de fonctions connues (pour revue :(Dutcher, 2001). Les fonctions des tubulines α, β et γ sont mieux connues. La tubuline γ est impliquée lors de la phase de nucléation des MTs, l’étape initiatrice d’assemblage (Oakley et al., 1990). Les tubulines α et β ne sont jamais présentes individuellement dans le cytoplasme des cellules, mais s’associent exclusivement en hétérodimères de tubuline α – tubuline β qui constituent les briques élémentaires qui s’assemblent pour former le MT. Les tubulines α et β sont des protéines globulaires, d’un poids moléculaire de 55kDa. Elles présentent un point isoélectrique (pI) proche de 5,5 leur conférant des propriétés acides.
Il existe plusieurs gènes codant pour les tubulines α et β et leur nombre est variable selon les espèces (6 gènes variants codant pour les tubulines α et 9 pour les tubulines β chez Arabidopsis, 6 à 8 gènes variants codant pour chaque tubuline chez les vertébrés) et leur conservation à travers l’arbre phylogénétique est remarquable (plus de 75% des résidus sont identiques entre une isoforme de tubuline de plante et son homologue humaine). La plupart de ces gènes ont une expression ubiquitaire mais certains sont exprimés dans un organe spécifique (Raff, 1994), ou leur expression est régulée au cours du développement : chez les plantes supérieures les différentes copies des gènes codants pour les tubulines α et β sont exprimés séquentielles au cours du développement (Hussey et al., 1988);(Carpenter et al., 1992). De plus, des études génétiques ont permis de montrer, notamment, chez la levure et la drosophile, que certains gènes de tubuline sont interchangeables alors que pour d’autres, une compensation est impossible (Schatz et al., 1986),(Raff et al., 1997). Plusieurs paramètres influencent l’expression des gènes des tubulines α et β. La microinjection de dimères de tubuline dans le cytoplasme de cellules de mammifères induit un rétrocontrôle de la quantité d’ARNm de tubulines α et β (Cleveland and Havercroft, 1983). Ces données indiquent que la quantité de tubuline présente dans le cytosol des cellules influence l’expression des gènes codant pour les tubulines α et β. De plus, la quantité de tubuline présente dans le cytosol est tributaire de l’architecture du cytosquelette microtubulaire qui, en se réarrangeant, modifie la quantité de tubuline disponible (Cleveland, 1989). Par ailleurs, la synthèse des deux sous unités est coordonnée. Si le nombre de copies du gène de la tubuline β est augmenté, un contrôle post-traductionnel se met en place, induisant la dégradation de la protéine (Whitfield et al., 1986). Enfin, il existe un contrôle transcriptionnel qui coordonne les niveaux d’expression des gènes : si l’expression du gène de la tubuline α est augmentée de manière artificielle, alors l’expression du gène de la tubuline β sera augmentée (Gonzalez-Garay and Cabral, 1995). Dans la cellule, ces différents contrôles permettent de conserver une stœchiométrie équivalente entre tubulines α et β. Après traduction, la structure de la tubuline doit être repliée pour lui conférer sa forme globulaire. Cette étape nécessite de l’ATP, du GTP, la présence d’un complexe chaperon et de 6 « tubulin folding » cofacteurs (TFC-A, TFC-B, TFC-C, TFC-D, TFC-E et ARL2). Ces protéines régulent à la fois la synthèse des sous-unités, la formation de l’hétérodimère et aussi la stabilité du MT. Des travaux de génétique ont mis en évidence l’importance des cofacteurs lors du développement d’Arabidopsis, particulièrement lors des étapes du développement du zygote et des trichomes (pour revue :(Szymanski, 2002).
Lors de l’assemblage des MTs, l’extrémité C-terminale de la tubuline devient exposée à la surface du MT. C’est ainsi un site privilégié de liaison pour de nombreuses protéines associées aux MTs ou MAPs (« Microtubule associated proteins ») et des moteurs moléculaires. L’extrémité C-terminale de la tubuline peut être le siège d’un grand nombre de modifications post-traductionnelles : polyglutamylation, polyglycylation et tyrosination. En dehors de son extrémité C terminale, la tubuline est sujette à d’autres modifications post traductionnelles comme la phosphorylation ou l’acétylation. Ces modifications sont conservées au cours de l’évolution et on pense qu’elles agissent de manière individuelle ou en combinaison afin de contrôler les mécanismes cellulaires médiés par les MTs, par exemple en altérant le recrutement de moteurs moléculaires ou d’autres protéines se liant à la tubuline. Les enzymes responsables de ces modifications sont pour certaines encore mal connues.
Les réactions de glutamylation et de glycylation génèrent respectivement des chaines latérales de résidus glutamate et glycine de longueurs variables, au niveau de glutamates présents dans l’extrémité C- terminale des tubulines α et β (pour revue :(Verhey and Gaertig, 2007). La glycylation est majoritairement rencontrée sur la tubuline d’axonème (cil et flagelle) tandis que la glutamylation est présente dans les cellules neurales, les centrioles, les axonèmes et avec des MTs du fuseau mitotique (Hammond et al., 2008). Dans des cellules humaines, les travaux de Lacroix et al,, (2010) ont démontré récemment un lien direct entre la présence de longues chaines latérales de glutamate sur des MTs, et la stimulation de leur fragmentation par une protéine de fragmentation des MTs, la spastine.
Le cycle de tyrosination – détyrosination de la tubuline α est le mieux documenté (pour revues,(Lafanechere and Job, 2000),(Westermann and Weber, 2003)et(Hammond et al., 2008). La détyronisation implique le détachement de la tyrosine C-terminale de la tubuline α par une carboxypeptidase qui reste inconnue jusqu’ici. L’acide aminé terminal est alors un glutamate. La tubuline tyrosine ligase (TTL) est responsable de la réaction d’ajout de tyrosine, ou tyrosination. Cette réaction s’effectue lorsque le dimère de tubuline est individualisé. Ce cycle de tyrosination – détyrosination permet de recruter de manière différentielle des moteurs moléculaires et des protéines de bout (+). Par exemple, les travaux de(Dunn et al., (2008) réalisés dans des cellules de mammifères suggèrent que la kinésine 1 se lie et se déplace préférentiellement le long de MTs détyrosinés. Par ailleurs, la tyrosination de MTs peut participer au recrutement de protéines de bout (+) notamment la protéine CLIP170 comme cela a été démontré par(Bieling et al., (2008). En ce qui concerne la détyrosination des MTs, (Peris et al., (2009) ont montré qu’elle diminue l’activité de dépolymérisation de MTs par des kinésines de la famille 13, dont MCAK. Les MTs sont alors stabilisés de manière indirecte. De plus, l’importance du cycle de tyrosination-détyrosination a été montré dans les processus de tumorigenèse et de croissance neuronale (pour revue :(Lafanechere and Job, 2000).
Structure des microtubules
Des observations de MTs en microscopie électronique à transmission ont révélé que les MTs sont généralement composés de 13 protofilaments linéaires et assemblés en parallèle. Les protofilaments s’organisent autour d’une lumière et confèrent la structure en tube creux du MT . Chaque protofilament correspond à l’alternance de dimères de tubuline α – β. Des observations en cryomicroscopie de la structure de MTs (Mandelkow and Mandelkow, 1985),(Chretien et al., 1992) ont permis de montrer que les dimères s’agencent côte à côte sous forme d’hélice qui parcourt la totalité du MT avec un pas de 12 nm (Metoz et al., 1997). Un micromètre de MT est constitué de 1625 hétérodimères de tubuline. Du fait du nombre de protofilaments, l’arrangement des sous-unités ne peut pas être décrit par une hélice continue. En effet, on observe des discontinuités qui s’alignent selon un axe appelé ligne de suture parallèle à l’axe du MT (Mandelkow and Mandelkow, 1985),(Kikkawa et al., 1994). Cette suture constitue une zone particulière du MT car elle met en contact de la tubuline α avec de la tubuline β.
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Table des matières
Introduction
1. Les microtubules
1.1 Synthèse et modifications du dimère α / β de tubuline
1.2 Structure des microtubules
1.3 Propriétés et structure de l’hétérodimère de tubulines
1.4 Cinétique d’assemblage de la tubuline in vitro
1.5 Dynamique des MTs à l’état stationnaire
2. Distribution des réseaux de microtubules au cours du cycle cellulaire de plantes
2.1 L’interphase
2.2 La transition vers la mitose
2.3 L’entrée en mitose
2.4 La transition métaphase / anaphase
2.5 L’anaphase
2.6 La sortie de mitose
3. Les protéines associées aux microtubules (MAPs)
3.1 Les protéines nucléatrices de MTs
3.2 Les protéines impliquées dans l’assemblage/l’organisation des MTs
3.3 Protéines responsables de la déstabilisation des MTs
3.4 Protéines impliquées dans la formation de faisceaux de MTs
3.5 Le cas particulier des kinésines
4. L’étude des AtMAP65s
4.1 Caractérisation des MAP65s chez Arabidopsis
4.2 AtMAP65-4 une MAP à part
Objectifs de la thèse
I Etude des propriétés moléculaires et fonctionnelles d’AtMAP65-4
1. Introduction
2. Résumé de l’article de recherche
3. Article de recherche
4. Conclusion et perspectives
II Etude de la phosphorylation d’AtMAP65-4 par les kinases Auroras
1. Introduction
2. Résultats
2.1 Tests de phosphorylation in vitro
2.2 Etude de l’effet de la phosphorylation d’AtMAP65-4 in vivo
3. Discussion
III Modélisation de l’activité d’AtMAP65-4
1. Introduction
2. Résumé de l’article de recherche
3. Article de recherche
4. Conclusion et perspectives
Conclusions et perspectives
Matériels et méthodes
1. Production d’AtMAP65-4 recombinante et sa purification
2. Tests d’activité d’AtMAP65-4 in vitro
3. Suivi de cinétique de polymérisation de la tubuline en présence de MAP par TIRFm
4. Test de phosphorylation d’AtMAP65-4 par les kinases AtAuroras
5. Etude de la phosphorylation d’AtMAP65-4 par les kinases AtAuroras
Références bibliographiques
Annexes
