Soutenance mémoire
Synthèse des matériaux et caractérisations
Synthèses des matériaux
Pour évaluer le potentiel de la luminescence persistante dans des études biologiques, notre étude a principalement porté sur la synthèse de nanoparticules de silicates, la synthèse se faisant par voie sol-gel. Pour obtenir ces composés, plusieurs méthodes de synthèse, dont notamment celle développée par Douy [114] pour l’enstatite ont été testées. La synthèse développée par Douy se fait par précipitation à l’aide d’une base (triethylamine) d’un mélange constitué de sels et de TEOS hydrolysé puis reprécipitation dans de l’ammoniaque. Cette méthode qui a été testée au début de ce travail n’a finalement pas été retenue à cause des problèmes de reproductibilité de synthèse avec l’obtention après chauffage de composés complètement noirs. Deux raisons peuvent être évoquées pour expliquer cet échec dans la synthèse du matériau que nous souhaitions synthétiser. La première raison viendrait d’un problème d’évacuation des déchets organiques lors du chauffage, ce qui engendrerait un matériau de type Si-O-N (les composés ont une couleur du jaune au gris). La première raison pourrait venir de l’utilisation d’un milieu réducteur trop important (gaz réducteur en présence d’ammoniac) qui permettrait la ségrégation du manganèse et sa réduction en métal. Ceci nous a conduit à préférer la voie « gélification » qui nous a donné rapidement des résultats. Il serait toutefois intéressant de chercher à analyser plus profondément les causes de cet échec. L’avantage de cette voie, par rapport à la précipitation, est la certitude que l’ensemble des constituants introduits se retrouvera dans le matériau final. Par précipitation, il est en effet difficile de s’assurer que tous les ions métalliques vont être piégés dans la matrice ou être répartis de façon homogène.
Protocole expérimental
Nous allons décrire ici la méthode de synthèse développée durant ce travail permettant l’obtention de nanomatériaux à luminescence persistante. Les quantités des différents composés chimiques utilisées pour la synthèse des matériaux seront détaillées dans la partie expérimentale . La synthèse comporte quatre grandes étapes : la dissolution et l’hydrolyse des constituants du matériau (en l’occurrence les sels minéraux et du tétraéthoxysilane), la gélification, le séchage et le chauffage à haute température.
Comme précurseur de silice nous avons utilisé le tétraéthoxysilane (ou TEOS) qui se présente sous forme liquide non miscible à l’eau. Les ions métalliques utilisés sont, selon la composition du matériau désiré, du magnésium, du calcium, du strontium et du zinc sous forme de nitrate ou de chlorure. Certains essais ont également incorporés des ions aluminium (afin de former des aluminosilicates) et du barium. Ces essais n’ayant pas engendré d’études ne seront pas décrits ici. Le choix du pH de réaction fixe la voie choisie. A pH basique, on se trouve dans des conditions de Sol. À pH basique, le TEOS s’hydrolyse lentement et se condense rapidement menant à la formation de petites particules. De plus, certains ions précipitent sous forme d’hydroxyde. À pH acide, le TEOS s’hydrolyse rapidement et se condense lentement, les ions restant sous forme de cations hydratés. La première étape de la synthèse Sol-Gel est donc l’hydrolyse du tétraéthoxysilane. Pour réaliser cette hydrolyse, l’ensemble des sels est dissous dans de l’eau à pH 2 (acidifiée par addition d’acide nitrique concentré). A cette solution est ajoutée le TEOS. On obtient alors un mélange biphasique eau-TEOS. Pour accélérer l’hydrolyse, il est nécessaire d’avoir une forte agitation (pour augmenter la surface de contact entre la phase hydrophobe et l’eau). En outre, un vortex est utilisé régulièrement pendant l’hydrolyse pour homogénéiser le mélange. L’hydrolyse dure environ une heure à température ambiante. La fin de l’hydrolyse se caractérise par l’obtention d’un mélange homogène monophasique, contenant des silanols, des ions et de l’éthanol (issu de l’hydrolyse du TEOS).
Dès la formation de groupes silanols par hydrolyse, le phénomène de condensation de silanols intervient. Celle-ci correspond à la formation de ponts siloxane (Si-O-Si). Ces ponts sont soit formés à partir de la condensation de deux groupements silanols ce qui libère une molécule d’eau ou par condensation entre un groupement éthoxy et un groupement silanol, libérant ainsi une molécule d’éthanol. Cette condensation progressive provoque à terme le phénomène de gélification (qui correspond à un point de percolation du système). La gélification est relativement lente à température ambiante (environ 2-3 jours). Pour accélérer cette réaction, on place notre échantillon dans une étuve à 70℃, en évitant toutefois le séchage du gel. Pour cela, le récipient est gardé bouché. Au début de cette étape, le récipient est régulièrement ouvert pour relâcher la pression engendrée par la hausse de température. Le liquide se solidifie au bout d’une heure pour donner un gel translucide . Ce gel contient donc un réseau de silice, des cations, des anions (chlorure ou nitrate) de l’eau et de l’éthanol (provenant de l’hydrolyse du TEOS). Des expériences préliminaires nous ont permis de montrer qu’il était nécessaire de sécher l’échantillon avant le chauffage haute température. Une partie de l’eau présente dans le gel est ainsi évaporée par chauffage à l’étuve à 110℃. Cette étape améliore la cristallisation du matériau après chauffage haute température. Le flacon y est laissé pendant une nuit. Après 12 h, le produit ressemble à des morceaux de gélatine dont l’opacité dépend de la composition du gel.
Avant chauffage, le gel est constitué d’un réseau amorphe (voir Figure 3.4 p. 78) dans le chapitre suivant) dans lequel sont piégés les sels. Aucun pic de diffraction n’est observable par analyse aux rayons X. Le gel ne possède pas encore de propriétés de luminescence persistante. Seul le chauffage et la cristallisation du matériau peuvent engendrer une structure cristalline capable d’accueillir les défauts donnant les propriétés de luminescence persistante. La cristallisation du matériau nécessite un chauffage à haute température. Cette étape est réalisée dans un four, les échantillons étant déposés dans des petits creusets en alumine (résistant aux hautes températures). Le chauffage est contrôlé par la température à laquelle le matériau est porté et le temps de maintien dans le four. Dans notre cas, le four est programmé pour chauffer rapidement (+20℃/min) jusqu’à la température choisie (de 1000℃ à 1200℃) pendant 10 heures sous une atmosphère réductrice formée de 90% d’argon et 10% d’hydrogène, ce qui permet la réduction de l’Eu3+ en Eu2+, nécessaire à la luminescence . Ensuite, la redescente à température ambiante se fait plus doucement (-10℃/min). On obtient des cristaux blancs friables comme de la craie. Il est alors facile de les broyer à l’aide d’un mortier et d’un pilon en agate. On peut ensuite analyser leur luminescence et étudier leurs spectres d’émission. La synthèse de ces matériaux est donc facile et peu coûteuse. La composition des matériaux choisis (silicates) offre également la possibilité de travailler sur l’état de surface des particules afin d’y associer différentes molécules.
Caractérisations de la luminescence
Spectres d’excitation et d’émission
Les spectres d’émission sont caractéristiques des transitions énergétiques qui se produisent après excitation. Dans ce mode, la longueur d’onde du faisceau incident est fixée (λex). Elle est sélectionnée par un monochromateur dont l’élément dispersif est un réseau, dans le large spectre d’une lampe xénon, qui est continu et stable dans l’UV-visible et proche IR. Le rayonnement monochromatique est alors envoyé sur l’échantillon. Dans le cas où l’énergie reçue est capable de faire passer des électrons de l’échantillon dans un état excité, il y aura désactivation selon les phénomènes décrits précédemment et donc émissions de photons de longueur d’onde λem qui seront traduits sous forme de signal électrique par le détecteur. L’intensité de ces photons est faible et est donc amplifiée à l’aide d’un photomultiplicateur. Avant le détecteur, est positionné un autre monochromateur à réseau qui va permettre de balayer l’ensemble des longueurs d’onde d’émission choisies, en fonction de la position du réseau. Les spectres d’émission nous permettent de savoir à quelles longueurs d’onde émettent les échantillons. Dans le mode « spectre d’excitation », c’est cette fois-ci la longueur d’onde d’émission qui est fixée et le monochromateur situé juste après la source balaie l’ensemble des longueurs d’onde d’excitation d’un intervalle choisi. L’intensité détectée sera plus ou moins importante selon la longueur d’onde d’excitation. Pour réaliser les spectres d’émission et d’excitation des matériaux synthétisés, nous avons travaillé en mode « phosphorescence ». Le principe d’acquisition des données reste identique , à l’exception du fait que l’acquisition ne démarre que quelques µs à quelques ms après la fin de l’excitation . Ce mode d’acquisition se caractérise par plusieurs temps caractéristiques de l’expérience à savoir :
– le « delay time » (DLT) qui correspond à la durée entre le pulse de lumière excitatrice et le début de l’acquisition.
– le « gate time » (GT) correspondant à la durée d’intégration du signal,
– le « decay time » (DCT) qui correspond au temps laissé entre deux pulses d’excitation.
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Table des matières
Introduction
I Luminescence persistante: vers un nouvel outil en imagerie optique
1 Présentation de différentes techniques d’imagerie
1.1 Imageries aux rayons X, spectroscopique, nucléaire et ultrasonore
1.1.1 Radiologie et scanner
1.1.2 Imagerie par Résonance Magnétique (IRM)
1.1.3 Imagerie nucléaire
1.1.4 Échographie
1.2 Imagerie optique
1.2.1 Mécanisme de luminescence mis en jeu
1.2.2 Utilisation des sondes optiques en imagerie
1.2.3 Instrumentation et acquisition des données en imagerie optique
1.3 Contraintes en imagerie optique
1.3.1 Contraintes liées aux sondes optiques
1.3.2 Contraintes liées aux milieux biologiques
1.4 Récapitulatif sur les techniques d’imagerie
2 Luminescence persistante et nanoparticules
2.1 Matériaux à luminescence persistante
2.1.1 Matériaux à luminescence persistante et applications
2.1.2 Mécanismes de la luminescence persistante
2.2 Silicates et luminescence persistante
2.2.1 Exemple de silicate à luminescence persistante
2.2.2 Polymorphisme de l’enstatite (MgSiO3)
2.3 Colloïdes et procédé sol-gel
2.3.1 Caractérisation de colloïdes
2.3.2 Procédé Sol-Gel
II Synthèse et détection in vivo de nanoparticules à luminescence persistante
3 Composés à luminescence persistante synthétisés
3.1 Synthèse des matériaux et caractérisations
3.1.1 Synthèses des matériaux
3.1.2 Caractérisations de la luminescence
3.2 Composés à luminescence persistante rouge/infrarouge
3.2.1 MgSiO3
3.2.2 ZnMgSi2O6
3.2.3 Ca0,2Zn0,9Mg0,9Si2O6
4 Détection in vivo de particules non modifiées
4.1 Injections locales
4.1.1 Injection sous-cutanée
4.1.2 Injection intramusculaire
4.2 Injection par voie intraveineuse
4.2.1 Biodistribution des particules non modifiées
4.2.2 Effet de la taille sur la biodistribution des particules
4.3 Expériences sur des animaux de taille plus importante
III Fonctionnalisation et applications biologiques
5 Modification de la surface des nanoparticules
5.1 Stratégie de fonctionnalisation et méthodes
5.1.1 Fonctionnalisation
5.1.2 Exemples de fonctionnalisation
5.2 Couplage de molécules à la surface des nanoparticules
5.3 Greffage de fluorophores en surface
6 Expériences in vivo
6.1 Biodistribution des nanoparticules selon leur charge de surface
6.1.1 Particules positives
6.1.2 Particules négatives
6.1.3 Particules neutres
6.1.4 Analyse ex vivo et microscopie
6.1.5 Effet de l’injection de compétiteurs du système réticulo-endothélial sur la biodistribution
6.1.6 Temps de circulation des nanoparticules dans le sang
6.2 Détection de tumeurs
6.2.1 Tumeurs 3LL
6.2.2 Tumeurs B16
6.3 Évaluation de la reperfusion du foie après ischémie partielle
6.3.1 Expériences de visualisation de la reperfusion avec les nanoparticules
6.3.2 Évaluation de la toxicité hépatique des nanoparticules
6.4 Tolérance des nanoparticules: études toxicologiques préliminaires
6.4.1 Expériences in vitro
6.4.2 Expériences de suivi des particules au long terme
6.4.3 Évolution du poids des souris après injection intraveineuse de
nanoparticules non fonctionnalisées
IV Imagerie bimodale et imagerie 3D en luminescence
7 Imagerie bimodale
7.1 Intérêt des agents bimodaux
7.2 Fonctionnalisation pour l’obtention d’agents bimodaux
7.2.1 Agents bimodaux optique-scintigraphie
Conclusion
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