SYNTHESE DE LA [18F]-FNM ET EVALUATION DE SON INTERET POUR L’ETUDE DE L’HYPERACTIVATION DES RECEPTEURS NMDA IN VIVO

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PRINCIPES DE L’IMAGERIE MOLECULAIRE

L’imagerie moléculaire regroupe des techniques d’imagerie ou des associations de différentes techniques permettant de visualiser, in vivo :
• le fonctionnement cellulaire (exemple: captation cellulaire de glucose avec le [18F]- FDG)
• des processus moléculaires (interaction ligand récepteur, présence de certaines protéines ….)
On utilise pour cela deux moyens complémentaires :
• Des marqueurs, sondes ou traceurs, de natures diverses (colorants, produit de contraste, marqueurs radioactifs, protéines fluorescentes éventuellement produites «in situ» par l’organisme. Ces produits (injectés, ingérés ou produits par un organisme génétiquement modifié) visent un organe, un type cellulaire, ou une molécule particulière qui sera ainsi mise en évidence par l’imagerie.
• Des appareils capables de repérer le signal émis par le marqueur au travers du corps (rayon X, ultra-sons, infrarouge, tomographie…). Un des avantages de la Tomographie par émission de positons est que l’épaisseur des tissus à traverser par l’élément émettant le signal n’est pas limitante, permettant ainsi l’utilisation chez l’homme à des fins diagnostiques.
Nous nous intéresserons ici uniquement à l’imagerie moléculaire par utilisation de marqueurs radioactifs émetteurs β+, ceux-ci émettent des rayonnements de 511 keV décelables par tomographie par émission de positons.

Qualités requises pour être un bon radiotraceur

Les données d’affinités in vitro pour sa cible ne suffisent pas à affirmer que la molécule sera un bon radiotraceur TEP. Il faut tenir compte du fait qu’un radiotraceur est injecté à des doses « traceuses », c’est-à-dire des concentrations infra-pharmacologiques (quelques dizaines de µg) au lieu des quelques mg fréquemment utilisés dans des approches pharmacologiques classiques). En effet, on ne cherche qu’à « tracer » le cheminement et le marquage de la cible par la molécule radioactive et non à provoquer une activation ou encore un blocage de cette cible (par exemple un recepteur) en occupant un pourcentage important de ce dernier. Ainsi, plusieurs conditions spécifiques doivent être réunies pour faire d’une molécule candidate un bon radiotraceur TEP.
Quelques revues ont résumé les caractéristiques physicochimiques importantes à respecter pour avoir un bon marqueur notamment cérébral (Henriksen et al., 2008 ; Pike, 2009). Ces caractéristiques sont mentionnées ci-dessous :
• Haute spécificité et affinité pour sa cible:
Le traceur doit présenter une affinité suffisante pour sa cible (bonne affinité) et une faible liaison non-spécifique (bonne spécificité). Il est nécessaire d’évaluer in vitro l’affinité de la molécule pour sa cible en faisant des études de binding. On définit alors le coefficient de dissociation (Kd) du traceur qui correspond à la quantité de ligand exprimée en moles se liant à 50 % de la cible. Il est déterminé par étude de saturation en utilisant le ligand étudié qui doit être radiomarqué avec un isotope à demi-vie longue (car il est nécessaire d’attendre le temps au bout duquel l’équilibre de la fixation du ligand sur son récepteur est atteint). Plus le Kd est petit ; plus l’affinité pour la cible est grande.
L’affinité peut être aussi associée à une concentration inhibitrice (CI50), c’est-à-dire la concentration en ligand qui inhibe 50% de la liaison spécifique et qui correspond à la quantité de ligand nécessaire pour déloger et occuper 50 % de cibles occupées précédemment par un ligand connu radiomarqué. Cette technique utilise un ligand de référence marqué et n’oblige pas à marquer le ligand à étudier. On peut également caractériser sa constante d’inhibition (Ki) qui est une valeur calculée en fonction de la CI 50, du ligand de référence utilisé et du type d’inhibition.
La bonne affinité pour la cible est une caractéristique que doit avoir tout radiotraceur mais c’est particulièrement important en neurologie notamment lorsqu’on étudie des récepteurs.
o Passage de la BHE :
Le passage de la BHE par diffusion passive dépend du poids moléculaire et de la lipophilie du radiotraceur. Un bon radiotraceur cérébral aura un poids moléculaire de 400-600 daltons. Sa lipophilie doit être suffisante pour passer la BHE mais, malgré tout, limitée, afin de ne pas se lier aux protéines plasmatiques ou à toute autre structure lipophile non-spécifique.
Afin d’évaluer la lipophilie du radiotraceur, on calcule son Log P (coefficient de partition dans un mélange octanol-eau ; Équation 1) en injectant un échantillon de radioligand dans un mélange contenant de l’octanol et de l’eau. Après agitation, et décantation, les phases sont séparées et les cpm (coups par minutes) correspondants à chaque phase sont comptés. Il existe une variante au log P qui est le log D ; dans ce cas la phase aqueuse est un tampon à pH=7.4. ℎ − = ( ℎ − ) (1) Équation 1 : Calcul du Log P ou Log D : coefficient de partition entre une phase organique et une phase aqueuse représentant la lipophilie d’un composé
Un Log P compris entre 2 et 3 est approprié (Waterhouse, 2003a) mais non indispensable car il existe des mécanismes de transport facilité pour certaines molécules comme le glucose qui permettent de faire passer la BHE à des molécules non lipophiles (Haberkorn et al., 1994).
Pour avoir une mesure expérimentale du passage de la BHE, des études chez l’animal permettent de calculer le pourcentage d’activité mesurée au niveau du cerveau par rapport à la dose injectée par gramme de tissu cérébral. Pour un marqueur cérébral, il est nécessaire que le passage soit rapide : 4 % de la Dose Injectée par gramme (ID/g) doivent être retrouvées dans le cerveau dans les 5 premières minutes, puis un phénomène de « wash out » doit aboutir à une ID/g supérieure à 0,3 % dans un cerveau de rat au bout d’une heure. Par exemple pour un des traceurs de la plaque amyloïde le % ID/g est de 7 % à 5 min puis de 2 % à 60 min (Sundaram et al., 2015).
• Possibilité de marquer au [18F] et au [11C]
Le radiomarquage par un émetteur de positons doit être chimiquement possible et ce, avec un petit nombre d’étapes. Il doit être chimiquement stable (résistance aux réactions chimiques et biochimiques, au moins pendant 2 heures) et ne doit pas modifier le site actif de la molécule (permettant la liaison à la cible).
• Paramètres pharmacocinétiques
Du fait de la demi-vie courte des émetteurs de positons (demi-vie du [11C] = 20,4 min; [18F] = 109,8 min), la pharmacocinétique doit être adaptée. Ainsi, le passage cérébral du radiotraceur doit être rapide pour atteindre son maximum de fixation spécifique au moment où la composante non spécifique commence à être évacuée du cerveau selon une cinétique supérieure ou égale à la période de décroissance du radioélément utilisé.
L’optimisation de ces critères se fait dans le but d’obtenir des images interprétables, quantifiables, avec un rapport signal spécifique/signal non-spécifique le plus élevé possible.
Le traceur ne doit pas avoir une cinétique de dégradation trop rapide. Les éventuels métabolites radioactifs ne doivent pas (ou peu) passer la BHE.
La toxicité de la molécule doit être très faible, malgré le fait qu’elle soit injectée à «dose traceuse ». L’activité spécifique est importante, plus elle est élevée et moins avec il y aura de quantité (µmol) de composé organique pharmacologiquement actif pour une même actvité injectée. De manière générale, les quantités injectées en termes de masse (µg) sont très inférieures à celles qui provoquent une toxicité. Comme exemple, nous pouvons citer la [18F]-FLT qui lorsqu’elle est injectée une fois pour une imagerie TEP chez l’humain, correspond en µmol à une dose 3000 fois inférieure à la dose minimale retrouvée toxique chez l’animal (Turcotte et al., 2007).

PRODUCTION D’UN RADIOTRACEUR FLUORE

Comme pour les autres examens scintigraphiques, la réalisation d’un examen TEP nécessite l’administration d’un Médicament Radiopharmaceutique (MRP). Celui-ci est constitué d’un vecteur moléculaire (substrat, ligand ou autre permettant de cibler une fonctionnalité ou une substance à étudier) et d’un isotope radioactif qui permet de localiser la distribution du vecteur au sein de l’organisme. L’intérêt du [18F] est double : il peut facilement être incorporé aux molécules sans altérer leurs propriétés biologiques et encombrer la molécule pour passer la BHE et il permet de réaliser des reconstructions d’image en trois dimensions avec une très bonne sensibilité et résolution.

Émetteurs de positons

Principes physiques

Les émetteurs de positons sont des atomes caractérisés par un excès de charges positives dans leurs noyaux. Ils se désintègrent vers un état stable par transformation d’un proton (p) en un neutron (n) qui conduit à l’émission d’un positon (e+) et d’un neutrino (Équation 2. → ++ν (2)
Le positon (pouvant être symbolisé par e+ ou+) est de masse égale à celle d’un électron mais de charge opposée.

Radiochimie dans un module de synthèse

Stratégie de marquage au [18F]

Etant donné l’intensité des activités mises en œuvre, l’automatisation des processus de synthèse est obligatoire. Ceci permet de garantir non seulement la sécurité du personnel en termes de radioprotection mais aussi la reproductibilité de la synthèse.
On peut définir un automate de synthèse comme un appareil qui réalise automatiquement toutes les étapes de synthèse d’un MRP, depuis la préparation et la purification de l’isotope jusqu’à la production d’une solution-mère, étape intermédiaire avant la mise en forme finale qui précède l’injection du MRP au patient. Différents modules ayant chacun des méthodologies de fluoration différentes existent sur le marché car plusieurs voies de synthèse et plusieurs possibilités de purification peuvent être envisagées. Il existe deux types d’utilisation du fluor suivant la forme dans laquelle le fluor est produit; s’il est produit sous forme F-; le fluor sera ajouté au composé d’intérêt par substitution nucléophile ; s’il est sous forme F+ ; il sera ajouté au composé d’intérêt par substitution électrophile. Nous n’aborderons ici que la voie nucléophile, qui est celle utilisée pour la production des deux composés fluorés décrits dans cette thèse.

La substitution nucléophile

Cette méthode permet de produire une grande variété de MRP, avec des rendements et des activités spécifiques élevés. Elle permet d’utiliser le [18F] sous forme fluorure (18F-), que l’on obtient tel quel lors d’une production cyclotron utilisant une réaction nucléaire de type 18O (p, n) 18F.
Le [18F-] est ensuite séparé de l’eau enrichie dans laquelle il est en solution par l’intermédiaire d’une résine échangeuse d’ions (ces résines sont sous formes de cartouches sep pack appelées QMA). Cette séparation a deux objectifs : récupérer l’eau enrichie non utilisée et obtenir le fluorure sous forme anhydre. En effet le fluorure n’étant réactif qu’en milieu organique, il est nécessaire d’éliminer l’eau afin qu’il y ait une substitution nucléophile.
Pour extraire le fluor de la résine on utilise du K2CO3 concentré qui déplace la liaison du fluorure sur la cartouche. Enfin pour le dissoudre dans un milieu organique, on utilise des sels de tétra-alkyl ammonium ou des aminopolyéthers (kryptofix 2.2.2). Ceux-ci jouent également le rôle de « catalyseur » car ils vont activer le fluor en encageant l’ion alcalin (ici K+), rendant le fluor disponible pour des réactions radiochimiques.
Le milieu organique le plus fréquemment utilisé est l’acétonitrile. Après ajout du précurseur, une réaction de substitution nucléophile se produit alors dans ce milieu en chauffant entre 80 °C et 160 °C pendant 10 à 30 min (les conditions expérimentales sont à redéfinir pour chaque précurseur). La Figure 9 illustre un exemple de radiosynthèse utilisant le groupement tosylate qui sera substitué par le fluor.
Le précurseur doit impérativement avoir un groupe « partant » situé à l’endroit où l’on souhaite introduire le [18F]. Les groupes partants les plus utilisés sont les triflates, les tosylates, les mésylates et les nosylates.
Si la substitution nucléophile doit être réalisée au niveau d’un noyau aromatique, les groupements partants sont souvent le nitro (NO2), le triméthylammonium ou le 19F et le noyau aromatique doit être activé par la présence en ortho ou para de groupes électronégatifs.
Si le précurseur possède des sites, qui doivent rester intacts, possiblement attaquables par la substitution nucléophile, il est nécessaire que le précurseur possède des groupements protecteurs. Ces groupements doivent être facilement hydrolysables après substitution nucléophile.

Purification et mise en forme

 La purification sur cartouche SPE
C’est la méthode la plus utilisée pour purifier le [18F]-FDG. On utilise des cartouches à usage unique ayant des capacités de rétention différentes.
L’extraction en phase solide ou SPE est une technique de plus en plus utilisée en raison de sa rapidité et de son efficacité. Le principe est simple : on adsorbe les composés à extraire sur une phase stationnaire contenue dans une cartouche puis on les récupère lors de l’élution. Des lavages permettent d’éliminer les impuretés. L’extraction se décompose en 4 étapes :
 « conditionner » la cartouche en faisant percoler un volume donné de solvant ou de plusieurs solvants afin d’activer le support. La cartouche ne doit pas sécher avant le dépôt de l’échantillon,
 déposer l’échantillon,
 laver la cartouche en faisant circuler un solvant éluant les composés indésirables sans éluer le composé d’intérêt,
 éluer le composé d’intérêt avec un faible volume de solvant approprié.
Le choix des solvants et de la phase stationnaire est très important et nécessite souvent plusieurs essais. Cependant, l’approche est identique à celle de la chromatographie puisque les interactions mises en jeu sont identiques.
Prenons l’exemple du FDG : selon la méthode classique d’Hamacher (Le Bars, 1998) ; le sucre fluoré et hydrolysé passe successivement :
• sur une colonne de résine retardatrice d’H+ afin d’augmenter la valeur du pH.
• sur des colonnes de type Sep-Pak d’alumine (qui piègent les traces de fluorures) et de C18 (pour bloquer les résidus non totalement hydrolysés).
Le FDG est ensuite élué pour passer à l’étape suivante qui est la mise en forme pharmaceutique. Cette purification SPE peut également être utilisée en complément de la purification HPLC. Soit avant celle-ci : il s’agit d’une pré-purification, cette étape peut permettre de se débarrasser des impuretés présentes en très grandes quantités qui pourraient endommager la colonne HPLC. Soit après une purification HPLC, dans le but de se débarrasser du solvant d’élution de l’HPLC qui n’est pas toujours compatible avec une mise en forme pharmaceutique en vue d’une injection patient.
 Purification HPLC
Les composés à séparer sont mis en solution dans un solvant. Ce mélange est introduit dans la phase mobile liquide. Suivant la nature des molécules, elles interagissent plus ou moins avec la phase stationnaire (colonne chromatographique). La phase mobile, en phase isocratique, poussée par une pompe sous haute pression, parcourt le système chromatographique.
Les composés en solution se répartissent alors suivant leur affinité entre la phase mobile et la phase stationnaire. En sortie de colonne, grâce à un détecteur approprié (gamma pour les composés fluorés et UV pour les composés non radioactifs), les différents composés du soluté sont caractérisés par un pic (Figure 10). Cette méthode permet de séparer les différents composés. Grâce à des essais préalables, on connaît le temps de rétention de la molécule d’intérêt, du fluor libre et des autres impuretés avec un solvant donné. Ceci permet alors de sélectionner le pic de notre composé d’intérêt et ainsi de pouvoir le collecter en sortie de colonne. Le composé est ainsi caractérisé et dissous dans le solvant d’élution.
Une fois le radiopharmaceutique collecté, il doit être formulé dans un solvant biologiquement compatible afin d’être considéré comme un produit injectable.
Plusieurs solutions sont à envisager suivant la composition de la phase mobile HPLC. Si cette phase mobile ne contient pas de solvants nocifs, on utilise directement la fraction collectée et on l’additionne à des solutions biologiquement compatibles pour ajuster le pH (bicarbonate par exemple) ou l’osmolalité (sérum physiologique par exemple).
Si la phase mobile contient des solvants nocifs (acétonitrile, méthanol …), il est nécessaire de les éliminer. On utilise le plus souvent une cartouche SepPak qui retient le radiopharmaceutique puis l’élution est réalisée avec un solvant non nocif comme de l’éthanol. Ensuite le pH et l’osmolalité sont ajustés.
Les solvants utilisables ainsi que la teneur maximale de ces solvants en solution font l’objet d’une norme (Lignes directrices de l’ICH : international conference on harmonisation of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use).
Il est également nécessaire de procéder à une stérilisation du MRP obtenu. Celle-ci est réalisée grâce à une filtration stérilisante à l’aide de filtres dont les pores sont de 0.22 µm de diamètre. Cette filtration doit être réalisée à l’intérieur d’une enceinte classe A (classification relative au niveau particulaire dans l’air de l’enceinte).
Le rendement de la radiosynthèse est obtenu en utilisant l’Équation 7. (%)= é é ℎé é à × 100 (7)
L’actvité du MRP est mesurée dans un activimètre après sa mise en forme pharmaceutique. (Tcal). L’activité du fluor est calculée à partie de l’activité initiale corrigée de la décroissance du [18F] produit par le cyclotron. Il s’agit donc de l’activité [18F] théorique à Tcal.

Contrôle qualité

Selon les Good Manufacturing Practice (GMP), publiées par la Food and Drug Administration (FDA) américaine, les tests à réaliser sur le produit fini ainsi que les spécifications devant être respectées doivent être établis par le producteur du radiopharmaceutique. Les tests doivent être validés, et la méthode utilisée peut dépendre de l’appareillage de chaque site. A titre de référence, le fabricant doit respecter les directives des monographies correspondantes dans la pharmacopée européenne ou française si elles existent (Sánchez et al., 2008).
Globalement, les tests à réaliser sur le produit fini appartiennent à deux catégories : les tests à réaliser en routine et les tests supplémentaires à réaliser lors de la validation du procédé de fabrication. Nous n’aborderons pas la thématique de la production pour l’usage humain dans cette thèse. Nous nous contenterons de mentionner que pour être autorisé à utiliser un MRP expérimental, il est nécessaire d’avoir effectué une validation du procédé de fabrication grâce à la production de 3 lots qui subiront en plus des tests de routines, des tests complémentaires (Tableau 3).
Les contrôles à réaliser en routine sur chaque production de lot de MRP sont les suivants :
 Apparence de la solution : Par inspection visuelle
 pH : Le contrôle du pH est effectué par bandelette pH de sensibilité 1 unité pH. 10 µL de solution finale sont déposés sur le papier pH. La couleur obtenue est comparée à l’échelle de couleur fournie par le fabricant.
 Pureté radiochimique : La pureté radiochimique est déterminée par chromatographie HPLC. Procédure : 500 µL de la solution finale sont injectés dans le système HPLC équipé d’une colonne greffée en C18. Les constituants de la solution sont séparés sur la colonne HPLC et détectés par un détecteur de radioactivité ainsi que par un détecteur UV monté en série. La pureté du composé d’intérêt est déterminée en calculant le rapport de l’aire du pic correspondant à ce composé à la somme des aires de l’ensemble des pics. L’attribution du pic lié au composé d’intérêt est faite par comparaison avec le temps de rétention obtenu avec la référence standard non radioactive.
 Pureté chimique :
Détection de résidus de Kryptofix par un test comparatif colorimétrique.
Ce composé utilisé lors des premières étapes de synthèse pour encager les ions positifs est normalement éliminé dans l’étape de purification HPLC. C’est un composé toxique (Baudot et al., 1977) et on le recherche spécifiquement à l’aide d’un test colorimétrique.
Procédure : Test avec de l’acide iodoplatinique selon la méthode décrite par Mock.(Mock et al., 1997). Ce procédé est identique à celui de la Pharmacopée européenne concernant la recherche de kryptofix dans une solution injectable de FDG (07/2008 ; n° 1325). La norme fixée est : < 2.2 mg / Vmax

L’AUTORADIOGRAPHIE SUR COUPES DE TISSU CEREBRAL

Principe

L’autoradiographie est une technique d’imagerie d’émission réalisée à partir d’une source radioactive placée au contact d’une émulsion ou d’un film photographique. Comme l’indique le préfixe auto-, la source de rayonnement n’est pas une source externe (de rayons X par exemple), mais elle est incluse dans l’échantillon dont on produit une image. Une structure radiomarquée (organisme, cellule, molécules…) est mise en contact avec un film sensible aux radiations : les radiations qu’elle émet vont imprimer le film (argentique) et y provoquer une réaction de précipitation. Ces zones noircies par la réaction de précipitation vont ainsi permettre de localiser la structure recherchée. Une technique plus récente a remplacé le film argentique, le tissu à étudier peut maintenant être mis en contact avec un phosphorscreen.

Matériel

Les écrans radioluminescents à mémoire (ERLM), appelés également écrans photo stimulables ou plaques au phosphore photo stimulables ou encore « phosphorscreen », sont aujourd’hui très largement utilisés et ont remplacé les films argentiques. Ils ont la particularité de pouvoir stocker l’énergie transmise par les rayonnements ionisants, tels que les rayons X, dans une structure cristalline radiosensible. Par la suite, cette énergie est restituée par photo stimulation laser.
Brièvement, le cycle d’utilisation d’un ERLM comporte trois expositions : une première exposition aux radiations ionisantes (X, gamma, ..) « écrit » l’image, une seconde exposition à un faisceau étroit de lumière visible « lit » l’image ligne par ligne, et une dernière exposition à une lumière visible intense (typiquement plusieurs tubes néon ) « efface » l’image en vue d’un nouveau cycle d’utilisation du même ERLM
Les rayonnements ionisants incidents génèrent dans le cristal dopé une avalanche d’excitations. Les ions d’europium bivalents jouent le rôle d’activateurs en libérant un électron dans la bande de conduction du cristal (Eu2+ ⇒Eu3+). Ces porteurs de charge vont pour la plupart être piégés dans des sites métastables référencés sous le nom de « centres PSL ». La concentration locale de centres PSL est proportionnelle à l’énergie déposée par les radiations. L’énergie ainsi stockée constitue l’image latente.
Après l’exposition, la lecture de l’image est réalisée au moyen d’un appareil numériseur équipé d’un laser de longueur d’onde précise (habituellement dans le rouge, vers 635 nm) qui balaye la surface de l’écran. La plupart des électrons ainsi photo stimulés sont libérés de leurs pièges et se recombinent en émettant un signal de luminescence (généralement dans le bleu, vers 390 nm). La lumière est guidée vers un tube photomultiplicateur pour être à nouveau transformée en électrons. Le signal électrique est ensuite amplifié et numérisé par des composants électroniques. La matrice image obtenue par informatique est composée de pixels dont la taille minimale est de l’ordre de 25 µm (condition définie par le scanner utilisé comme le Typhoon FLA 9400 GE healthcare), et est encodée sous le format « .GEL ». Le signal obtenu s’exprime en DLU (digital Light Unit) et est proportionnel à l’énergie initiale déposée par le radioélément.
Après lecture, l’énergie résiduelle contenue dans les centres PSL qui n’ont pas été relaxés par le laser (soit 10 à 50 % des centres PSL) est totalement libérée par photo stimulation en exposant l’écran à une lumière blanche intense (typiquement une rangée de tubes néons ou une lampe flash). L’ERLM ainsi réinitialisé peut être réutilisé des milliers de fois.

Autoradiographie avec radiomarquage « in vitro »

Cette technique consiste à incuber une section de tissu avec un radioligand spécifique de la fonction à étudier. Cette incubation se fait à température ambiante dans un milieu tamponné proche du pH physiologique (pH= 7.4), pendant un temps dépendant de la rapidité d’intéraction entre le ligand et sa cible. Dans ce type de protocole, le radioligand n’est en contact qu’avec la section à étudier, il ne subit pas les phénomènes de distribution, métabolisation, élimination, qu’il subirait in vivo. Après incubation des sections dans le milieu contenant le radioligand, la lame portant la coupe de tissu est lavée pour éliminer la liaison non spécifique. La lame sur laquelle est mise la section de tissu est ensuite mise en contact avec le phosphorscreen.

Autoradiographie ex vivo

Dans cette procédure expérimentale, le radioligand est injecté à l’animal et est donc soumis aux  phénomènes de distribution, métabolisation, élimination. Après un temps défini (correspondant au temps présentant le meilleur rapport signal sur bruit après injection), l’animal est sacrifié et l’organe à étudier est prélevé et coupé en fines sections. Ces sections seront ensuite mises en contact avec le phosphorscreen.

Activation et perméabilité des récepteurs NMDA

L’activation des récepteurs NMDA requiert la présence de deux agonistes, le glutamate et un co-agoniste, la glycine (ou D-sérine). Un obstacle de plus dans l’activation du récepteur est l’ion Mg2+. En effet, cet ion se loge à l’intérieur du canal à l’état de repos. Le canal ionique ne peut s’ouvrir qu’après dépolarisation de la membrane, qui élimine le blocage exercé par les ions Mg2+ extracellulaires fixés sur le canal. Cette sensibilité au blocage magnésium confère aux NMDA le rôle de détecteurs de coïncidence capables d’intégration synaptique, entre éléments pré et post synaptiques (Gielen, 2010).
De fait, pour qu’il y ait activation des GluN il faut que les éléments présynaptiques libèrent du glutamate, et donc qu’ils soient dépolarisés. Puis pour que les ions traversent le canal, il faut que les éléments post-synaptiques aussi soient dépolarisés pour lever le blocage aux Mg2+. Enfin, l’activité des GluN est sujette à de multiples modulations induites par des composés extracellulaires, habituellement des petites molécules ou des ions, dont certains, comme H+ et Zn2+ sont présents de façon endogène dans le SNC, agissant sur le récepteur comme modulateurs allostériques.
Le glutamate et la glycine ont montré des effets sur l’affinité du Mg2+ à son site liaison, cette affinité voltage dépendante est donc aussi modulée par la liaison de ces substances (Liu et al., 2001). De plus en fonction de la composition en sous-unités, le déblocage du canal en expulsant le Mg2+ peut avoir une cinétique plus ou moins lente, les études suggèrent que la liaison au co-agoniste serait impliquée (Clarke et al., 2013).
 Mécanismes d’ouverture du récepteur canal
L’agoniste endogène des GluN, le glutamate, se fixe sur le domaine ABD des sous-unités NR2. L’affinité de ce site pour le glutamate dépend de la composition en sous-unités du récepteur mais reste de l’ordre du micromolaire. En plus de l’agoniste principal (le glutamate ou le NMDA) l’activation du récepteur est dépendante de la liaison simultanée d’un autre agoniste. Ce site co-agoniste, appelé site glycine (mais peut aussi en fonction de la sous unité, être activé par de la sérine), se situe dans le domaine ABD de la sous-unité GluN1. (Figure 11 ; Figure 12 ; Figure 16) Les mécanismes d’ouverture du canal ionotrope n’impliquent que les domaines ABD et transmembranaires (TMD).
La séquence classique d’activation du GluN procède comme ceci :
1) Liaison des agonistes sur le site de reconnaissance du domaine ABD,
2) La reconnaissance provoque un mouvement conformationnel qui induit un écartement de la partie inférieure des domaines ABD de chaque dimère,
3) Cette séparation exerce une traction sur la région intermédiaire qui relie les domaines ABD aux segments transmembranaires ce qui, par réorientation d’une hélice transmembranaire, provoque l’ouverture du canal.
4) Cependant, le blocage par le Mg2+ empêche tout flux ionique au potentiel électrique de repos des neurones qui est négatif. Il est nécessaire d’avoir une dépolarisation post synaptique. Si le neurone post-synaptique est excité via d’autres afférences glutamatergiques (récepteurs AMPA et kaïnates), la dépolarisation résultante peut lever transitoirement le blocage par le Mg2+, les ions peuvent alors transiter au travers du canal ionique des récepteurs NMDA (Gielen, 2010).
5) L’activation du GluN se termine par une désactivation c’est-à-dire que le récepteur-canal adopte à nouveau une configuration fermée en dépit de la présence des agonistes. Les cinétiques de désactivation (constantes de temps caractérisant la décroissance du courant induit par le GluN suite à un bref pulse d’agoniste) peuvent varier d’un facteur 50 en fonction de la composition en sous-unités.
 Perméabilité
Le canal ionique des récepteurs NMDA est perméable aux cations monovalents (Na+ et K+) ainsi qu’aux ions Ca 2+. Les ions monovalents K+ et Na+, se déplacent de part et d’autre de la membrane en suivant leur gradient électrochimique. La perméabilité relative aux ions Ca2+ varie de 0,8 à 10,4 (Perméabilité au Ca2+ /Perméabilité aux ions monovalents), ce qui classe ces récepteurs parmi les récepteurs les plus perméables au Ca2+.La perméabilité est fonction de la localisation du récepteur ainsi que de sa composition en sous-unités comme mentionné dans Tableau 4. Les récepteurs AMPA et Kainate sont beaucoup moins perméables au Ca2+.

Table des matières

LOPPEMENT PRE-CLINIQUE DE SONDES FLUORÉES UTILISÉES DANS L’IMAGERIE MOLÉCULAIRE DES PATHOLOGIES NEURODÉGÉNÉRATIVES.
INTRODUCTION
1. PROBLEMATIQUE
2. IMAGERIE MOLECULAIRE IN VIVO ET TEP
3. OUTILS ET PERSPECTIVES D’ETUDE DES MALADIES NEURODEGENERATIVES REVUE DE LA LITTERATURE
1. PRINCIPES DE L’IMAGERIE MOLECULAIRE
1.1. Définition
1.2. Qualités requises pour être un bon radiotraceur
2. PRODUCTION D’UN RADIOTRACEUR FLUORE
2.1. Émetteurs de positons
2.1.1. Principes physiques
2.1.2. Les principaux émetteurs de positons utilisés en médecine nucléaire
2.1.3. Avantage et production du [18F]
2.2. Radiochimie dans un module de synthèse
2.2.1. Stratégie de marquage au [18F]
2.2.2. La substitution nucléophile
2.2.3. Purification et mise en forme
2.3. Contrôle qualité
3. L’AUTORADIOGRAPHIE SUR COUPES DE TISSU CEREBRAL
3.1. Principe
3.2. Matériel
3.3. Autoradiographie avec radiomarquage « in vitro »
3.4. Autoradiographie ex vivo
AXE 1 : SYNTHESE DE LA [18F]-FNM ET EVALUATION DE SON INTERET POUR L’ETUDE DE L’HYPERACTIVATION DES RECEPTEURS NMDA IN VIVO
1. CONTEXTE
1.1. Le récepteur au glutamate de type NMDA
1.1.1. Les sous-uniteé du Récepteur NMDA, leur structure et leur assemblage
1.1.2. Activation et perméabilité des récepteurs NMDA
1.2. Conséquences fonctionnelles de l’activitation des récepteurs NMDA
1.2.1. Activité synaptique
1.2.2. Plasticités synaptiques
1.2.3. Récepteurs NMDA synaptiques et neuroprotection
1.2.4. Rôles physiologiques des recepteurs NMDA extra-synaptiques
1.2.5. Récepteurs NMDAR extra-synaptiques et pathologies
1.3. Contrôle et régulation de l’activité des récepteurs NMDA
1.3.1. Contrôle par les modulateurs allostériques
1.3.2. Antagonistes pharmacologiques du site PCP
1.4. Historique des radioligands du site PCP
2. RADIOTRACEURS DERIVES DE LA MEMANTINE
3. PARTIE EXPERIMENTALE
3.1. Matériel et méthode
3.1.1. Radiosynthèse
3.1.2. Propriétés physicochimiques
3.1.3. Etudes précliniques sur le rongeur
3.2. Résultats
3.2.1. Radiosynthèse
3.2.2. Propriétés physico-chimiques de la molécule fluorée
3.2.3. Etudes précliniques
4. DISCUSSION AXE 1
AXE 2 : IMAGERIE TAU : SYNTHESE DE L’ [18F]-AV1451 EN CONDITION PHARMACEUTIQUE ET TEST DE CONDITIONS D’AUTORADIOGRAPHIES
1. CONTEXTE
1.1. Les protéines tau
1.2. Structure et rôle des différents domaines des protéines tau chez l’humain
1.3. Modifications post traductionnelles :
1.3.1. Phosphorylation
1.3.2. O-glycosylation
1.4. Agrégation pathologique de protéine tau :
1.4.1. Formation de l’agrégat
1.4.2. Propagation
1.4.3. Recherche des agrégats à l’aide d’anticorps
1.5. Toxicité de tau
1.5.1. Perte de fonction de tau, déstabilisation des MTs et altération du transport axonal
1.5.2. Inhibition du transport axonal suite a un excès de tau sur les MTs
1.6. La maladie d’Alzheimer
1.6.1. Les plaques séniles
1.6.2. La dégénérescence neurofibrillaire (DNF)
1.7. Historique des radiotraceurs de la DNF
1.7.1. Le FDDNP (famille des aminonaphtalènes)
1.7.2. [11C]-lansoprazole (famille des benzothiazoles)
1.7.3. Famille THK (benzimidazole et quinoline)
1.7.4. Le [11C] PPB3
1.7.5. Famille des benzimidazoles pyrimidine
1.8. Les primates non humains
1.8.1. Le marmouset (Callithrix jacchus)
1.8.2. Etude du vieillissement chez le marmouset
1.8.3. Recherche de plaques amyloïdes et DNF chez les PNH
1.8.4. Le marmouset : modèle pour l’étude de la neuro dégénérescence
2. PARTIE EXPERIMENTALE
2.1. Matériel et méthode
2.1.1. Synthèse de l’ [18F]-AV1451 en condition pharmaceutique
2.1.2. Echantillons de cerveaux humains et de marmousets
2.2. Résultats
2.2.1. Synthèse du [18F]-AV1451
2.2.2. Détection de DNF sur coupes de tissu cérébral par [18F]-AV1451
3. DISCUSSION AXE 2
DISCUSSION GENERALE
BIBLIOGRAPHIE

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