Synthèse d’antigènes présentés par la protéine CD1b

RESUME

   La tuberculose reste aujourd’hui un problème majeur de santé dans le monde. L’efficacité protectrice du vaccin BCG, le seul actuellement disponible, est remise en question. Dans le cadre d’un programme européen de développement d’un nouveau vaccin contre la tuberculose, les sulfoglycolipides diacylés (Ac2SGL), spécifiques de Mycobacterium tuberculosis, ont été décrits comme des antigènes présentés par la protéine CD1b et activant des clones de lymphocytes T CD8+ in vitro. Il a également été montré in vivo que ces glycolipides, dont la structure est représentée ci-dessous, sont immunogènes. Ils semblent donc être de bons candidats pour tester leur activité protectrice sur des modèles animaux. Ces sulfoglycolipides sont présents en faible quantité dans la membrane de M. tuberculosis, seuls des composés synthétiques pourraient permettre la poursuite des études immunologiques. L’acide hydroxyphtiocéranoïque est un acide gras dextrogyre, ramifié par plusieurs groupements méthyles et un hydroxyle. Etant donnée sa complexité, il est difficile de le synthétiser à l’identique. L’objectif de cette thèse est de préparer des analogues de ces Ac2SGL dans lesquels cet acide gras est remplacé par d’autres de structure plus simple et qui auraient les mêmes activités biologiques que le composé naturel. Pour cela, une famille de molécules a été synthétisée dont toutes ont la même tête polaire que le composé naturel et différent par la structure de leur partie lipidique. Une voie de synthèse générale de ces sulfoglycolipides (SGL) a été mise au point. Puis, après avoir montré le rôle essentiel de l’acide gras complexe dans la reconnaissance de l’antigène par les cellules immunitaires, différents acides gras chiraux ont été synthétisés par alkylation stéréospécifique d’énolates. Ainsi, une vingtaine de composés ont été obtenus. L’activité antigénique de ces analogues a été évaluée in vitro. D’une part, cette étude nous a permis de montrer que les structures des deux chaînes lipidiques contrôlaient la reconnaissance des complexes CD1b:SGL par le récepteur des cellules T. En effet, la longueur de la chaîne située en position 2 est importante ainsi que le nombre de substituants méthyles et la configuration absolue des carbones asymétriques de l’acide gras estérifiant la position 3 du tréhalose. De plus, les sulfoglycolipides acylés en position 3 par des acides gras polyméthylés α,β insaturés se sont montrés plus actifs que leurs analogues saturés. D’autre part, certains analogues ont montré une activité comparable à celle du sulfoglycolipide diacylé naturel et sont accessibles en quantité suffisante pour évaluer leur pouvoir protecteur chez le cochon d’Inde.

Bref historique de la tuberculose

  La tuberculose est la plus vieille de toutes les maladies identifiables dans l’Histoire, elle a touché l’Humanité depuis la préhistoire, comme l’ont montré des études archéologiques dans diverses parties du monde. Au 19ème siècle, on assiste à d’importantes épidémies de tuberculose causant de nombreux décès en Europe et en Amérique du Nord. La surpopulation des villes et les mauvaises conditions d’hygiène favorisèrent sa propagation. A cette époque, et jusqu’en 1940, la cure « hygiéno-diététique » et le repos dans les établissements spécialisés (sanatoriums) étaient la seule chance de guérison pour les tuberculeux. En 1882, Robert Koch isole le bacille responsable de la tuberculose, Mycobacterium tuberculosis, que l’on appelle également bacille de Koch. Cette découverte révolutionna l’histoire de la tuberculose et valu à Koch le prix Nobel de médecine en 1905. Dans un premier temps, l’amélioration des conditions de vie et d’hygiène ont ralenti la propagation de la maladie. Puis, de nouvelles approches thérapeutiques ont été développées. En 1921, Calmette et Guérin mirent au point un vaccin, puis à partir de 1944, plusieurs antibiotiques furent découverts, notamment les cinq antituberculeux de première ligne encore utilisés aujourd’hui : Isoniazide, Ethambutol, Pyrazinamide, Rifampicine et Streptomycine. Ces avancées ont permis de faire reculer la maladie, mais malheureusement, depuis une vingtaine d’années, on assiste à une recrudescence de la tuberculose.

Insuffisance du BCG

   Le vaccin BCG est très efficace pour prévenir la lèpre8 et les formes graves de la tuberculose chez les jeunes enfants (près de 90% d’efficacité contre la tuberculose méningée), mais il protège mal les adultes contre la forme pulmonaire de la maladie, particulièrement dans les régions tropicales et subtropicales. Des hypothèses sont émises pour expliquer les insuffisances du BCG et les inégalités d’efficacité face aux différentes populations :
– la souche d’origine a dérivé, et ceci différemment selon les pays producteurs du vaccin.
– des antigènes de M. tuberculosis impliqués dans la réponse de l’hôte sont absents de la souche BCG, comme par exemple la protéine ESAT 6 qui est fortement antigénique.14 Les lymphocytes T spécifiques de ces antigènes ne sont donc pas présents chez les personnes vaccinées par BCG.
– dans les régions tropicales, les populations sont exposées à des mycobactéries environnementales non pathogènes ayant des antigènes communs avec M. bovis BCG. Ces sujets sont alors immunisés contre la souche vaccinale : elle est éradiquée avant d’avoir permis le développement d’une réponse protectrice contre la tuberculose.17 Différents programmes de recherche visent actuellement à mettre au point un vaccin plus efficace que le BCG.

Infection et réponse immunitaire

   Mycobacterium tuberculosis peut provoquer diverses formes de la maladie. La tuberculose pulmonaire (phtisie) est de loin la plus fréquente et la plus répandue, mais il existe des atteintes osseuses (mal de Pott, tumeur blanche du genou…), rénales, intestinales, génitales, méningées, cutanées (tuberculomes), etc. La tuberculose pulmonaire est également la plus contagieuse, et se transmet par voie aérienne. Une personne atteinte de tuberculose pulmonaire non traitée peut infecter de 10 à 15 personnes en moyenne chaque année. A l’occasion de toux ou d’éternuements, un malade contagieux répand dans l’air des microgouttelettes contenant le bacille tuberculeux. Suite à l’inhalation de ces aérosols par un sujet sain, les bacilles vont se loger directement dans les alvéoles pulmonaires où ils sont phagocytés par les macrophages alvéolaires, cellules effectrices importantes du système immunitaire. C’est la primo-infection. Mais, contrairement aux autres bactéries, M. tuberculosis inhibe le pouvoir microbicide des macrophages, il peut alors survivre et se multiplier dans ces cellules. Des granulomes, constitués principalement de macrophages, de cellules géantes multinucléées et de lymphocytes T, se forment autour des cellules infectées, ce qui permet de contenir et d’isoler les mycobactéries, assurant ainsi un équilibre entre l’infection et son contrôle par le système immunitaire.33es bacilles peuvent survivre dans cet environnement sans que l’hôte n’ait jamais le moindre symptôme de la maladie. On parle alors de tuberculose latente.34 Dans 5 à 10 % des cas, suite à une immunodéficience, les granulomes ne peuvent plus contenir les bacilles qui se répandent dans les bronches, c’est alors que la maladie se déclare. La localisation intracellulaire du bacille le protège de la détection par les anticorps. Par conséquent, une réponse anti-mycobactérienne efficace de l’hôte repose sur la mise en place de l’immunité cellulaire dont les effecteurs sont les lymphocytes T CD4+ et CD8+. Conventionnellement, ces cellules sont stimulées par des antigènes peptidiques présentés par les protéines du complexe majeur d’histocompatibilité de classe I et II (CMH-I et CMH-II respectivement) à la surface des cellules présentatrices d’antigènes35 (Figure 5). La présentation croisée, assurée par des vésicules apoptotiques, permet la présentation des antigènes par des cellules non infectées. Les lymphocytes T peuvent également être stimulés par des lipides bactériens. Ces antigènes lipidiques sont présentés par une troisième classe de molécules présentatrices d’antigènes : les protéines CD1 dont le rôle et la structure sont très proches de ceux des molécules du CMH-I et -II.37 Ce sont des glycoprotéines membranaires exprimées principalement dans les cellules dendritiques38 et qui sont absentes des macrophages. Elles sont non ubiquitaires et non polymorphiques. Grâce à la présentation croisée, des cellules non infectées peuvent également présenter des antigènes lipidiques. Des vésicules apoptotiques contenant des lipides sont libérées des cellules infectées afin de délivrer leur chargement antigénique aux cellules environnantes et notamment aux cellules dendritiques (Figure 5). Ce mécanisme semble jouer un rôle important dans le cas d’une infection par M. tuberculosis, qui touche principalement les macrophages. Ces antigènes peuvent stimuler des lymphocytes T CD4+, CD8+, CD4-/CD8- ou NKT. Dans le cas de la tuberculose, la majorité des lymphocytes T spécifiques des lipides circulant dans le sang périphérique des patients semble être CD4+. De plus, des études récentes indiquent que la plupart des cellules T CD8+, activées par des cellules infectées par M. bovis BCG, reconnaissent les antigènes lipidiques mycobactériens44 et participent à la réponse protectrice.45, 46 Le trafic des protéines CD1 dans la cellule dendritique ainsi que le chargement des antigènes seront détaillés dans un chapitre ultérieur.

Trafic intracellulaire des protéines CD1 et chargement des antigènes

   Les protéines CD1 sont présentes majoritairement dans les cellules dendritiques. Elles sont synthétisées dans le réticulum endoplasmique, où elles sont associées à la β2- microglobuline. Afin de les stabiliser et de protéger leurs sites de liaisons, il a été montré que CD1b et CD1d étaient chargées par des phospholipides endogènes. Chaque protéine CD1 est caractérisée par un trafic intracellulaire particulier. Après avoir été exprimées à la surface de la cellule (exception faite de CD1e qui est uniquement intracellulaire), elles sont internalisées puis distribuées dans différents compartiments endosomaux plus ou moins tardifs. Les mécanismes d’internalisation ne sont pas bien connus. Cependant, les différences d’adressage sont attribuées à la présence d’un motif YXXZ (où Y est une tyrosine, X, un acide aminé et Z un résidu hydrophobe) dans le domaine cytoplasmique des protéines CD1 qui se lie à la protéine adaptatrice AP-2, impliquée dans l’internalisation des récepteurs membranaires.82 Les isoformes CD1b, CD1c et CD1d contiennent cette séquence, contrairement à CD1a. Ainsi, CD1a est adressée aux endosomes de recyclage, CD1c se retrouve dans les endosomes précoces et tardifs, alors que CD1b et CD1d transitent jusqu’aux endosomes tardifs et lysosomes.83 C’est dans ces compartiments que se produisent les rencontres avec les antigènes bactériens, les éventuels apprêtements ainsi que le chargement dans la protéine. Les protéines CD1 sont ensuite recyclées jusqu’à la surface de la cellule présentatrice d’antigènes afin d’activer les lymphocytes T spécifiques de l’antigène présenté (Figure 9). Selon les compartiments dans lesquels les protéines CD1 transitent, elles rencontrent et chargent les antigènes de structures différentes. Les lipides exogènes transitent aussi dans les différents compartiments endosomaux de la cellule présentatrice d’antigènes.84 Selon la longueur de leurs chaînes, ils sont distribués dans des compartiments cellulaires différents. En effet, des études réalisées sur le glucose monomycolate (GMM, Figure 8) révèlent que selon la longueur de l’acide mycolique, les localisations intracellulaires sont différentes. Ceux estérifiés par de longues chaînes (C80) saturées s’accumulent dans les endosomes tardifs et/ou les lysosomes alors que ceux avec de courtes chaînes (C32) insaturées sont localisés dans les endosomes de recyclage. Ceci a, par conséquent, des répercussions sur la présentation de ces antigènes par les protéines CD1.Cette distribution du trafic lipidique entre les endosomes de recyclage et les endosomes tardifs ou lysosomes corrèlerait avec les trafics des différentes protéines CD1 : CD1b et CD1d présentent des molécules dont la partie lipidique est, de façon générale, plus volumineuse que celles des antigènes présentés par CD1a88 (Figure 9). Cependant, certains composés comme les PIM (phosphatidyl-myo-inositol mannosides) qui contiennent deux acides palmitiques (C16), sont présentés par l’isoforme CD1b. A la sortie du réticulum endoplasmique, les protéines CD1 sont chargées par des lipides endogènes. Il a été montré que CD1b était chargé par une molécule de phosphatidylcholine (PC) et un autre lipide constitué de 41 à 44 atomes de carbone, dont la structure exacte reste inconnue. Le chargement des antigènes dans les compartiments endosomaux requiert donc le déplacement de ces lipides. Dans le cas des antigènes dont les chaînes sont trop courtes pour occuper entièrement les poches, on peut imaginer que seulement un des deux lipides est déplacé. Zajonc et al. ont publié la structure de CD1d en complexe avec un α-GalCer dont la chaîne acyle est de longueur C8 et la sphingosine de longueur C18. Etonnamment, la plus courte occupe le canal A’, qui est le plus volumineux des deux canaux de CD1d, et un lipide en C16 occupe le reste de la poche.89 Pour les antigènes dont les chaînes lipidiques sont plus longues, les deux lipides doivent être déplacés. Dans la structure de CD1b:GMM, la chaîne méromycolique de longueur C50 occupe tout le canal A’-T’-F’. Pour les sulfoglycolipides diacylés par exemple, il a été montré qu’un passage dans les endosomes tardifs, où le pH est acide, était nécessaire à l’association de cet antigène lipidique avec les protéines CD1. De même, le chargement des acides mycoliques ou du GMM dans CD1b n’est possible qu’à faible pH.90 Ces observations suggèrent que l’acidité générée par des ATPases dans les vésicules pourraient déstructurer les hélices α qui protègent le site de liaison et ainsi permettre l’entrée de l’antigène dans les poches de la protéine. Dans le cas des antigènes présentés par les molécules du CMH, le chargement est précédé par de nombreux mécanismes d’apprêtements des protéines par la cellule qui permettent de générer les peptides antigéniques. En ce qui concerne les antigènes lipidiques, subissent-ils une dégradation de leur tête polaire et/ou de leur partie lipidique avant leur chargement ou sont-ils présentés tels quels par les protéines ? Ces mécanismes demeurent encore très mal connus. Certains antigènes présentés par CD1 sont chargés dans les endosomes tardifs ou les lysosomes, ce qui leur offre l’opportunité d’être exposés à des enzymes qui pourraient modifier leur structure.30, 37, 85 Prigozy et al. ont été les premiers à mettre en évidence un mécanisme d’apprêtement d’un lipide. Ils ont montré, sur un antigène non naturel, que le disaccharide Gal(α1→2)GalCer perdait son galactose terminal avant d’être présenté par la protéine CD1d au TCR.91 L’existence de tels mécanismes a été confirmé par de la Salle et al. sur un antigène mycobactérien. En effet, avant d’être présentés par CD1b aux lymphocytes T, les PIM hexamannosylés (PIM6) sont dégradés en molécules dimannosylées (PIM2) par une αmannosidase lysosomale assistée par la protéine CD1e.49 En revanche, aucun apprêtement des parties lipidiques des antigènes n’est encore connu. Contrairement aux antigènes peptidiques pour lesquels de nombreuses études ont été réalisées afin de déterminer leurs apprêtements, trafic et chargement, il reste encore de nombreux mécanismes à élucider pour les antigènes lipidiques. Ces molécules hydrophobes se comportent tout à fait différemment des peptides en solution, formant des micelles et des agrégats. Ceci suggère que les mécanismes mis en jeu soient différents de ceux connus pour la présentation par les molécules du CMH.

Table des matières

INTRODUCTION
I. La tuberculose
1.Bref historique de la tuberculose
2.Etat des lieux actuel de la tuberculose
II. Nécessité d’un nouveau vaccin contre la tuberculose 
1.Le BCG : seul vaccin actuellement disponible
a. De la mise au point à nos jours
b.Insuffisance du BCG
2. Vers un nouveau vaccin
3. Premières immunisations de cochons d’Inde par des lipides
III. Les protéines CD1 : molécules présentatrices d’antigènes lipidiques
1.Infection et réponse immunitaire
2. Structure des protéines CD1
3.Les antigènes présentés par les protéines CD1
4.Trafic intracellulaire des protéines CD1 et chargement des antigènes
IV. Modulation de la réponse immunitaire par la structure fine des antigènes 
1. Déterminants structuraux des antigènes mycobactériens présentés par la protéine CD1b
2.Etude d’un antigène de CD1d : l’α-Galactosylcéramide
a. Le galactose
b.La partie polaire du céramide
c. La partie lipidique du céramide
V. Sujet de recherche 
1.Les sulfoglycolipides diacylés
2. Projet de thèse
CHAPITRE 1 : SYNTHESE D’ANALOGUES DES SULFOGLYCOLIPIDES DIACYLES MYCOBACTERIENS 
I. Synthèse générale des sulfoglycolipides diacylés 
1. Stratégie de synthèse
2. Synthèse des sulfoglycolipides diacylés
a. Benzylidénation de l’α,α-D-tréhalose
b.Monoacylation en position 2 par un chlorure d’acyle
c. Protection des positions 2’ et 3’
d. Acylation de la position 3 par la deuxième chaîne lipidique
e. Déprotection des positions 2’ et 3’
f. Sulfatation de la position 2’
g. Déprotections finales
II. Mise en évidence de l’importance de la structure fine des chaînes lipidiques 
1. Analogues estérifiés par des acides linéaires
2. Préparation de sulfoglycolipides par hémisynthèse
a. Purification des sulfoglycolipides naturels
b.Ethanolyse et purification des esters
c. Hémisynthèse de sulfoglycolipides à partir des esters C
d.Importance du groupement hydroxyle de l’acide hydroxyphtiocéranoïque
III. Synthèse d’acides gras polyméthylés 
1.Littérature
a. Par résolution d’un mélange racémique
b. Aldolisation asymétrique d’un énolate
c. Alkylation d’un énolate
d. Substitution allylique (SN2’) asymétrique
e. Addition conjuguée 1,4
2. Stratégie utilisée
3. Synthèse des acides polyméthylés chiraux
a. Introduction du premier groupement méthyle par couplage de Wittig puis dédoublement
b.Méthode stéréospécifique d’Enders
c. Cas particulier de l’acide (4S,6S)-2,4,6-triméthyloct-2-ènoïque
d.Cas particulier de l’acide (S)-2,4,6-triméthyltétracos-2,4-diènoïque
IV. Synthèse des sulfoglycolipides diacylés 
CHAPITRE 2 : ACTIVITE ANTIGENIQUE DES SULFOGLYCOLIPIDES DE SYNTHESE 
I. Tests réalisés sur les analogues 
1.Chargement des sulfoglycolipides de synthèse dans la protéine CD1b
2. Activation d’une lignée cellulaire de lymphocytes T spécifiques des Ac2SGL
a. Antigènes présentés par des cellules dendritiques
b. Antigènes présentés par la protéine humaine CD1b soluble
II. Résultats 
1.Les sulfoglycolipides contenant deux chaînes linéaires
2. Hémisynthèse
3.Le nombre de substituants méthyles contrôle l’activité antigénique des sulfoglycolipides
4.Importance des doubles liaisons
5.Effet de la longueur des chaînes
a. En position 2 du tréhalose
b.En position 3 du tréhalose
c. Sur les positions 2 et 3 du tréhalose
6.Importance de la configuration absolue des atomes de carbone asymétriques
7. Positions d’acylation par les acides gras
III. Discussion 
CONCLUSION – PERSPECTIVES
PARTIE EXPERIMENTALE 
I. Remarques générales 
II. Modes opératoires 
III. Caractéristiques des composés synthétisés 
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXES

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