Soutenance mémoire
La protéine porteuse ou core protein
La partie protéique des PGs détermine leur localisation et leur distribution dans la cellule, via sa taille et sa nature. Il existe une protéine porteuse propre à chaque famille de PGs, dont la taille varie de 10 à plus de 500 kDa. Les structures de ces protéines sont uniques mais il semble que le motif « Ser-Gly-X-Gly », où X est un acide aminé quelconque, soit commun à de nombreuses séquences protéiques, avec le résidu L-Serine comme site potentiel d’accroche des GAGs.
Deux exemples de maladies liées aux PGs
Comme indiqué précédemment, les PGs ont une localisation variée et sont impliqués dans divers processus physiologiques et pathologiques. Les paragraphes qui vont suivre vont traiter deux exemples de maladies dans lesquelles sont impliqués les PGs. L’arthrose est la maladie articulaire la plus fréquente et touche environ 70% de la population française de plus de 65 ans.10 Elle se caractérise par la dégradation progressive du cartilage et s’accompagne donc de douleurs persistantes aux articulations.11 Les articulations les plus touchées, pour les personnes agées de 65 à 75 ans, sont la colonne vertébrale (70- 75%), les doigts (60%), le genou (30%) et les hanches (10%) mais toutes les autres articulations peuvent être touchées, même si cela est plus rare.10 Les principaux facteurs de risque conduisant à cette maladie sont l’âge, la surcharge pondérale, les traumatismes et des facteurs hormonaux, les femmes étant plus touchées que les hommes.12 Les PGs sont des composants majeurs du cartilage, avec l’eau et les fibres de collagènes. Ces protéoglycanes sont de deux types, ceux de haut poids moléculaire (aggrécane) et ceux de plus petit poids moléculaire (décorine, biglycane…).13 Les aggrécanes contribuent à l’hydrophilie de la matrice extracellulaire du cartilage et sont intégrés dans le réseau formé par les fibres de collagène. Les GAGs présents dans l’aggrécane sont le sulfate de chondroïtine, qui est majoritaire et principalement sulfaté en position 6 et 4, avec un rapport C6S/C4S grand, et le sulfate de kératane. Dans le processus arthrosique, il y a un déséquilibre synthèse-dégradation de l’aggrécane, ce qui induit des modifications quantitatives et qualitatives des PGs.14 Il a notamment été montré que le rapport C6S/C4S diminuait avec l’aggravation de l’arthrose. Ces différentes modifications entraînent un dommage du réseau des fibres de collagène et conduisent donc progressivement à la dégradation du cartilage. Les protéoglycanes sont également impliqués dans différents cancers, comme celui du pancréas, du sein ou encore du poumon. Les cancers sont liés à un dysfonctionnement des mécanismes de régulation de notre organisme et provoquent la prolifération de cellules de manière anarchique. Ces maladies touchent aussi bien les hommes que les femmes, quelque soit leur âge. En France, on estime que 3 millions de personnes de 15 ans et plus, en vie en 2008, ont eu un cancer au cours de leur vie. Les cancers les plus courants sont ceux de la prostate, du sein, du côlon-rectum et celui du poumon. Les protéoglycanes et notamment le sulfate d’héparane jouent un rôle dans le cancer. Celui-ci est présent à la surface de nombreuses cellules, y compris les cellules tumorales. Le HS semble être un signal pour réguler la croissance, la prolifération et la migration de ces cellules. Il semble également impliqué dans la transformation des cellules en cellules cancéreuses et dans la régulation des métastases. Dans le cas du cancer du poumon, les HS présents à la surface des cellules sont surexprimés. Ces changements pourraient augmenter le signal permettant la croissance des cellules cancéreuses. En effet, les résidus sulfatés des HS sont nécessaires pour activer le récepteur du facteur de croissance, FGFR (fibroplast growth factor receptor), et permettent la stabilisation du complexe ligand-récepteur.17 On comprend donc bien l’importance des PGs dans les processus biologiques et les pathologies. Il est donc crucial de comprendre la biosynthèse de ces PGs, et notamment les mécanismes des différentes enzymes impliquées dans ce processus, qui pourraient alors devenir de potentielles cibles thérapeutiques.
L’EXTL2 et l’EXTL3
La biosynthèse des chaînes de GAGs s’oriente vers les Hep/HS lorsque le résidu Nacétylglucosamine D-GlcNAc est transféré sur l’acide glucuronique de la zone de liaison à partir de l’UDP-D-GlcNAc. La N-acétylglucosaminyltransférase I (GlcNAcT-I) fut l’enzyme initialement identifiée pour catalyser cette réaction clé.29 Quelques années plus tard, il a été montré que les glycosyltransférases impliquées dans la biosynthèse des Hep/HS étaient fortement associées à une famille de gènes nommés exostoses (EXT) et à leurs homologues EXTL (EXT-like) découverts par la suite.30,31 Ces gènes font parti d’une famille de « suppresseurs de tumeurs ». En 1999, l’équipe de Sugahara a montré que le gène EXTL2 encodait une α-1,4-Nacétylhexosaminyltransférase du même nom, capable de transférer des D-GalNAc et des DGlcNAc sur la zone de liaison des protéoglycanes.32 La structure cristallographique de cette enzyme, issue de la souris, a été résolue en 2003 et cette étude a montré un mécanisme de rétention de configuration, suivant probablement celui de type SNi.33 A notre connaissance, la structure cristallographique de l’enzyme humaine n’est toujours pas résolue. L’équipe de Sugahara a également observé des résultats intéressants avec les EXTL1 et EXTL3.34 En effet, l’EXTL3 montre une activité de N-acétylglucosaminyltransférase I et II (GlcNAcT-I et GlcNAcT-II), qui permet respectivement le transfert du premier D-GlcNAc et celui des suivants, et est donc impliqué dans l’initiation et l’élongation des chaînes de Hep/HS. En revanche, l’EXTL1 ne montre qu’une activité de GlcNAcT-II et n’est donc impliqué que dans l’élongation des chaînes. Ainsi les deux enzymes connues à ce jour pour initier la synthèse des chaînes d’Hep/HS sont l’EXTL2, qui peut transférer des D-GalNAc et des D-GlcNAc, et l’EXTL3, qui permet également l’élongation de cette chaîne de GAGs.
Synthèses de la zone de liaison partielle, sulfatée en position 4 ou 6 via un diol intermédiaire
En 2004, Jacquinet J.-C.53 reporte la synthèse de différents disaccharides de la zone de liaison afin d’étudier le rôle des sulfatations dans la biosynthèse des sulfates de chondroïtines. Ces composés sont formés des deux D-Gal, sulfatés sur l’un ou l’autre, en position 4 ou 6, avec pour aglycone le 4-méthoxyphényle qui permettra une bonne détection lors des tests biologiques. Une stratégie de protections orthogonales des galactoses de la zone de liaison a été élaborée afin de pouvoir, en fin de synthèse, sulfater l’un ou l’autre de ces galactoses (Schéma 11). Les intermédiaires clés de cette synthèse sont les diols 52 et 53, qui proviennent du composé 54 qui possède des groupements protecteurs orthogonaux sur les deux D-Gal, des groupements lévulinoyles sur le Gal-2 et un benzylidène sur le Gal-1. Ce disaccharide 54 a été obtenu par le couplage des deux monosaccharides 55 et 56, à l’aide de TMSOTf avec un rendement de 70%. Ces composés sont issus du dérivé du D-Gal 57. A partir du disaccharide 54, une déprotection du benzylidène ou des groupements Lev permet l’obtention des diols 52 ou 53 respectivement. Afin d’obtenir les différents composés sulfatés, deux voies ont été suivies : les composés 6-sulfatés sont issus de la sulfatation sélective de la position 6 à l’aide du complexe SO3.NMe3 (1,5 éq.) alors qu’une benzoylation sélective de cette position, avec du cyanure de benzoyle, suivie de la sulfatation de la position 4 permet l’accès aux composés 4-sulfatés (Schéma 12). Une déprotection totale de ces composés mène aux composés finaux 46-49. Il est à noter qu’une déprotection à la fois des groupements Lev et du benzylidène donne le tétrol correspondant, qui permet l’obtention des composés non sulfaté 50 et 6- disulfaté 51. Suivant une stratégie similaire, Thollas B. et Jacquinet J.-C.54 ont également synthétisé des trisaccharides de la zone de liaison, possédant le D-GlA et les deux motifs D-Gal, sulfatés en position 4 ou 6 de l’un ou l’autre des D-Gal (Schéma 13). L’intermédiaire clé de cette synthèse est le composé 66, trisaccharide commun aux différents produits, qui possède des groupements orthogonaux sur les deux D-Gal, avec un groupement silylène sur le Gal-2 et un groupement benzylidène sur le Gal-1, et qui va ainsi permettre l’obtention des diols 64 et 65. Ce composé provient de la glycosylation entre le dérivé glucuronique 67 et le disaccharide 68, formé lui-même par la glycosylation entre les monosaccharides 56 et 69 suivie d’une délévulinoylation et de l’introduction de l’acétal tertbutylsilylène. La déprotection du silylène en présence du complexe 3HF.Et3N donne accès au diol 65 et va permettre de modifier les positions 4 et 6 du Gal-2, alors que la déprotection du benzylidène conduit au diol 64 et permet ainsi d’accéder aux positions 4 et 6 du Gal-1. L’accès aux différents produits finaux (58-63) se fait comme précédemment par une sulfatation régiosélective pour les composés sulfatés en position 6 ou par une benzoylation régiosélective suivie de la sulfatation pour les composés 4-sulfatés puis par une saponification. Plus récemment, en 2012, Aït-Mohand K. et al55 ont décrit la synthèse de trisaccharides 70-74 possédant le même motif GlcA-Gal-Gal, mais avec une biotine comme aglycone (Schéma 14). Cette synthèse suit également une stratégie basée sur des groupements protecteurs orthogonaux pour les deux D-Gal. Les trisaccharides biotinylés 70-74 proviennent des deux trisaccharides clés 77 et 78 possédants respectivement des ClAc sur le Gal-2 ou un groupement silylène sur le Gal-1, qui donneront accès aux diols 75 et 76. La différenciation des deux D-Gal est réalisée lors de la formation des disaccharides 79 et 80 et celle du monosaccharide 81. La glycosylation du disaccharide 79 avec le composé 81 suivie de la déprotection du silylène et de l’introduction de groupements benzoyles permettent l’obtention du trisaccharide 77. Ce trisaccharide est le précurseur des molécules sulfatées sur le Gal-2. La glycosylation du disaccharide 80 avec le composé 81 permet l’obtention du trisaccharide 78. Celui-ci permettra l’accès aux molécules sulfatées sur le Gal-1. Les disaccharides 79 et 80 sont obtenus par la glycosylation des monosaccharides 82 et 43. Après formation des diols 75 et 76 par la déprotection sélective des chloroacétates ou du silylène, l’accès aux différents produits finaux (70-73) se fait de la même manière que précédemment c’est-à-dire O-sulfonation régiosélective pour les composés 6-sulfatés ou benzoylation régiosélective puis sulfatation pour les composés sulfatés en position 4 et enfin saponification. Une déprotection totale du trisaccharide biotinylé permet d’accéder à la molécule 74 non sulfatée.
Synthèses de la zone de liaison liée à une D-GalNAc par une liaison α
Deux équipes ont présenté la synthèse de dérivés de la zone de liaison possédant une liaison α entre la partie zone de liaison et un sucre aminé, qui est ici un D-GalNAc. La présence de cette entité a été identifiée par Freeze en 1995 dans des cellules de mélanome humain et l’action probable d’une α-D-GalNAc transférase a été mise en évidence par Sugahara63 la même année. En 1995, Neumann K. W. et al64 ont synthétisé un pentasaccharide comportant les quatres motifs de la zone de liaison et la D-GalNAc liée en α. Ce pentasaccharide 121 a été obtenu par la glycosylation de deux blocs polysaccharidiques, le disaccharide 122 et le trisaccharide 95 (Schéma 21). Le disaccharide 122 est obtenu après glycosylation entre les monosaccharides 123, qui possède comme précédemment un azido en position 2, et 124, suivie des étapes de déprotection du TBDPS, oxydation, estérification et formation de l’imidate. La glycosylation a été réalisée en présence de TMSOTf et conduit à un mélange de stéréoisomères α/β inséparables avec un ratio 1/2. Leur séparation est réalisée après l’estérification. La glycosylation entre le composé 122 et le trisaccharide 95, déjà connu,46 permet d’obtenir le pentasaccharide, qui subit une série de protections / déprotections et la réduction du N3 par hydrogénolyse avec le catalyseur de Lindlar suivie de l’acétylation. L’activation du pentasaccharide par un imidate permet d’introduire le motif sérine sur la position anomérique. Une déprotection totale permet d’accéder au composé final 121. Le groupe de Tamura J.-I.65 a synthétisé en 1999 la séquence suivante D-GalNAc-α- (1→4)-D-GlcA-β-(1→3)-D-Gal, possédant un bras aminé ou une biotine en position anomérique, composés 125 et 126 respectivement (Schéma 22). Les composés 125 et 126 ont été obtenus à partir du disaccharide 122 déjà connu et du monosaccharide 127. La glycosylation entre ces deux composés forme le trisaccharide dont l’azido est ensuite réduit par l’acide thioacétique. Une déprotection totale conduit au produit 125 alors qu’un couplage avec le dérivé de la biotine suivie de la déprotection totale permettent d’accéder au trisaccharide 126. Ces auteurs ont également synthétisé le disaccharide D-GlcA-D-Gal biotinylé ou non à l’aide du composé 127 et du donneur GlcA connu. Très peu de synthèses de motifs de la zone de liaison liée à un dérivé D-GalNAc en α ont été réalisées. Celles-ci montrent comme précédemment l’importance du groupement en position 2 du sucre aminé. Un grand nombre de travaux ont donc été décrits sur la synthèse de la zone de liaison sulfatée mais il existe très peu de travaux sur la synthèse de motifs de la zone de liaison sulfatée avec une amorce de CS et il n’existe, à notre connaissance, qu’une publication sur la synthèse de motifs de la zone de liaison liés à une amorce de Hep/HS et aucune où la zone de liaison est sulfatée.
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Table des matières
ABRÉVIATIONS
I- INTRODUCTION BIOLOGIQUE
I-1. Les protéoglycanes
I-1.1. La protéine porteuse ou core protein
I-1.2. La zone de liaison
I-1.3. Les glycosaminoglycanes
I-1.4. Deux exemples de maladies liées aux PGs
I-2. La biosynthèse des protéoglycanes
I-3. Les enzymes de bifurcation
I-3.1. La CSGalNAcT-1
I-3.2. L’EXTL2 et l’EXTL3
I-3.3. Orientation de la biosynthèse
I-3.4. Nécessité d’une synthèse chimique
II- TRAVAUX DE SYNTHÈSES DÉCRITS DANS LA LITTÉRATURE
II-1. Synthèses de la zone de liaison sulfatée
II-1.1. Synthèses de la zone de liaison sulfatée via l’utilisation d’un groupement protecteur temporaire
II-1.1.1. Synthèses de la zone de liaison sulfatée en position 4
II-1.1.2. Synthèses de la zone de liaison sulfatée en position 6
II-1.2. Synthèses de la zone de liaison partielle, sulfatée en position 4 ou 6 via un diol intermédiaire
II-2. Synthèses de la zone de liaison avec une amorce de GAGs
II-2.1. Synthèses de la zone de liaison avec une amorce de CS
II-2.2. Synthèse de la zone de liaison avec une amorce de Hep
II-2.3. Synthèses de la zone de liaison liée à une D-GalNAc par une liaison α
III- OBJECTIFS ET STRATÉGIE DE SYNTHÈSE
III-1. Objectifs de recherche
III-2. Stratégie de synthèse pour accéder aux di- et trisaccharides sulfatés
IV- SYNTHÈSE
IV-1. Synthèse du disaccharide protégé de la zone de liaison 137
IV-1.1. Synthèse du bloc donneur 82
IV-1.2. Synthèse du bloc accepteur 138
IV-1.3. Synthèse du disaccharide 137
IV-2. Synthèses des disaccharides finaux sulfatés ou non
IV-2.1. Synthèse du disaccharide 6-sulfaté 129
IV-2.2. Synthèse du disaccharide 4-sulfaté 130
IV-2.3. Synthèse du disaccharide non sulfaté 128
IV-3. Synthèse des trisaccharides de la zone de liaison possédant la première unité des CS
IV-3.1. Préparation de la D-galactosamine 111
IV-3.2. Synthèse du précurseur trisaccharidique 159
IV-3.3. Synthèse du trisaccharide 6-sulfaté 132
IV-3.4. Synthèse du trisaccharide 4-sulfaté 133
IV-3.5. Synthèse du trisaccharide non sulfaté 131
IV-4. Synthèse des trisaccharides de la zone de liaison possédant la première unité des HS
IV-4.1. Préparation de la D-glucosamine 139
IV-4.2. Synthèse du précurseur trisaccharidique 167
IV-4.2.1. Glycosylation
IV-4.2.2. Réduction du groupement azido
IV-4.2.3. Déprotection du silylène
IV-4.3. Synthèse du trisaccharide 6-sulfaté 135
IV-4.4. Synthèse du trisaccharide 4-sulfaté 136
IV-4.5. Synthèse du trisaccharide non sulfaté 134
IV-5. Synthèses de composés fluorés – Travail préliminaire
IV-5.1. Préparation des précurseurs 183 et 184
IV-5.2. Fluoration de la position 6
IV-6. Conclusion
V- NOUVELLES MÉTHODES D’ACTIVATION POUR L’OBTENTION DE SUCRES SULFATÉS
V-1. Introduction sur ces différentes méthodes
V-1.1. Le principe du micro-ondes (MW)
V-1.2. La chimie de flux continu
V-2. Sulfatation exhaustive
V-2.1. Sulfatation de la position 4
V-2.2. Disulfatation des positions 4 et 6
V-3. Sulfatation régiosélective de la position 6
V-4. Application sur les di- et trisaccharides
V-4.1. Application sur un disaccharide D-Gal-D-Gal
V-4.2. Application sur nos composés
V-4.2.1. 6-Sulfatation
V-4.2.2. 4-Sulfatation
V-5. Conclusion
VI- UTILISATION DE SULFATASES POUR L’OBTENTION DE SUCRES MONOSULFATÉS
VI-1. Généralités sur les sulfatases
VI-2. Projet envisagé
VI-2.1. Choix et synthèse des composés
VI-2.2. Choix des sulfatases
VI-3. Résultats préliminaires
VI-4. Conclusion
VII- CONCLUSION ET PERSPECTIVES
VII-1. Conclusion
VII-2. Perspectives
VIII- PARTIE EXPÉRIMENTALE
IX- ANNEXES
X- RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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